Många experimentella system har använts för att förstå de mekanismer som reglerar T-cellutveckling och funktion i ett immunsvar. Här en genetisk strategi med användning av retroviral transduktion beskrivs, som är ekonomiska, tidseffektivt, och viktigast av allt, mycket informativ i att identifiera regulatoriska vägar.
Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.
The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative.
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function.
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses.
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.
Retroviral medierad överuttryck av gener är ett effektivt sätt att analysera funktion i hjälpar-T-celler, som deras utveckling och funktion är ofta bestäms av uttrycksnivån för nyckelregulatorer. Dock är försiktig tolkning av resultaten krävs eftersom uttrycksnivåer betydligt över de den endogena genen kan införa många artefakter. Därför bör denna teknik kombineras med andra för att kontrollera relevansen av funktionen. Till exempel bör överuttryck kompletteras med minskad uttryck med hjälp av siRNA eller gen knockouts om sådana finns. Med miRNA, kompletterade vi överuttryck experiment med dem att blockera genom att använda virus som överuttryckta artificiell miRNA inriktning webbplatser som fungerade som konkurrerande hämmare för en miRNA 15. Retrovirala transducerade celler kan också användas i biokemiska analyser som inbegriper RNA och proteinanalys. Emellertid är en stor begränsning av dessa experiment effektiviteten i transduktion resulting i en blandad population av transducerade och otransducerade celler. Därför kommer dessa analyser mest sannolikt att kräva sortering av GFP + populationen. Slutligen bör differentiering in vitro-analyser kombineras med in vivo experiment, och ett sätt detta kan uppnås är genom adoptivt överföra transducerade T-celler i möss och efter deras differentiering och deras effekt på immunsvaret.
En av de viktigaste begränsningar för detta system är storleken på RNA-genomet som kan paketeras in i retrovirala kapsiden. I vår erfarenhet, den maximala insatsen storlek för MIG retroviral system som ger bra virusproduktionen är 3-3,5 kb. Därför kan större gener inte analyseras med detta system, eftersom de ger dåliga virustitrar. Men de flesta gener är mindre än denna storlek, så detta system är användbart för ett stort antal olika genprodukter studier.
Med retroviral transduktion, flera alternativ inom dessa protocols har använts. Många forskare har utnyttjat förpackningar cellinjer som stabilt uttrycker de retrovirala generna (exempelvis referens 16). Emellertid har vi erhållit de högsta titrarna med användning av standard HEK 293T-celler med co-transfektion av pCl-Eco hjälpvirus-vektor. Isolering av naiva hjälpar-T-celler kan också åstadkommas genom cellsortering i stället för magnetiska pärlor och cellseparationskolonn protokollet, men detta kräver tillgång till en cellsorterare, och kostnaderna för sorterings tid är vanligtvis högre än pärla reagens. Slutligen finns det variationer på aktiveringsbetingelser som användes för att differentiera hjälpar-T-celler in i de olika undergrupper. Till exempel, TCR-stimulering av celler för länge innan exponering för Treg inducerande betingelser kan hämma deras induktion 16. Detta kan vara ett problem eftersom retroviral expressions kräver celldelning som induceras genom stimulering av celler. Trots detta har vi funnit effektiv Treg induktion med detta protokoll med O / N activation före retroviral transduktion.
Inom dessa protokoll kräver framgångsrik tillämpning flera faktorer. Hög titer retrovirus preparat behöver effektiv transfektion av HEK 293T-celler så hög kvalitet DNA och exakt beredda 2x HBS är viktiga. Dessutom måste celldensiteten av HEK 293T-celler vara ungefär 50% vid punkten för transfektion eftersom god expression av den transfekterade DNA kräver att cellerna är aktivt växande, och detta kommer att inhiberas om cellerna är alltför glest eller tätt. Celler vid optimal täthet under transfektion ska nå sammanflödet vid något tillfälle under de virusuppsamlingssteg, men de kommer att fortsätta att producera hög titer virusstammar hela vägen fram till den sista samlingen. Effektiv differentiering av hjälpar-T-celler kräver god cellkvalitet så säkerställa att isolerade celler är att renheten som illustreras i figur 1. På samma sätt, är beroende av möss fr kvaliteten hos cellernaabout vilken de isolerades. För dessa studier har vi använt 6-8 veckor gamla C57BL / 6-möss. Äldre möss kan ha mindre naiva celler, och andra stammar kan skilja sig i deras differentiering. Till exempel BALB / c-möss är mer benägna att Th2-svar än C57BL / 6-möss 17 så som nämnts ovan, C57BL / 6 T-celler kan vara svåra att inducera ett Th2-svar. Dessutom kan vilken som helst av de differentieringsförhållandena varierar något från labb till labb, och effekten av genen uttryck kan endast bli uppenbara i suboptimala förhållanden så cytokin koncentrationer i de olika polariseringsförhållandena kan behöva titreras. Slutligen kan effekterna av det överuttryckta genen eller de polariseringsförhållandena på cellproliferation påverka transduktionseffektiviteten så mäter effekterna av genen av intresse kan kräva optimering av timing och koncentrationen av polariserande reagens. Optimera alla dessa faktorer bör leda till informativa resultat med detta system.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.
RPMI | Sigma | R8758 | |
DMEM | Sigma | D5671 | |
Penicillin Streptomycin solution | Sigma | P4333 | |
L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
DPBS | Sigma | D8537 | |
MIG vector | Addgene | Plasmid 9094 | |
pCL-Eco vector | Addgene | Plasmid 12371 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
Magnetic beads mouse CD4 cell kit | Invitrogen (Dynabeads) | 11415D | |
Streptavidin Beads | Miltenyi Biotech | 130-048-102 | |
MS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
LS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
CD25 Biotenylated MAb | BD Biosciences | 85059 | clone 7D4 |
CD62L Biotenylated MAb | BD Biosciences | 553149 | clone MEL-14 |
Polybrene (Hexadimethrine Bromide) | Sigma | 107689 | |
Anti-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | clone 145-2C11 |
Anti-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | clone 37.51 |
Anti-IL-4 | BD Biosciences | 559062 | clone 11B11 |
Anti-IFN-gamma | BD Biosciences | 559065 | clone XMG1.2 |
Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554425 | cloneJES6-5H4 |
Recombinant IL-12 p70 | eBiosciences | 14-8121 | |
Recombinant IL-4 | BD Biosciences | 550067 | |
Recombinant TGF-beta | eBiosciences | 14-8342-62 | |
Recombinant IL-6 | eBiosciences | 14-8061 | |
Recombinant IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
PMA | Sigma | P8139 | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
Brefeldin A | eBiosciences | 00-4506 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling |
Foxp3 staining buffer set | eBiosciences | 00-5523 | |
Anti-CD4 FITC | eBiosciences | 11-0041 | clone GK1.5 |
Anti-CD8a perCP-cy5.5 | eBiosciences | 45-0081-80 | clone 53-6.7 |
Anti-MHCII PE | eBiosciences | 12-0920 | clone HIS19 |
Anti-CD25 PE | eBiosciences | 12-0251-82 | clone PC61.5 |
Anti-CD62L PE | eBiosciences | 12-0621-82 | clone MEL-14 |
Anti-CD44 APC | eBiosciences | 17-0441 | clone IM7 |
Anti-IFN-gamma FITC | eBiosciences | 11-7311-81 | clone XMG1.2 |
Anti-IL-4 PE | BD Biosciences | 554435 | clone 11B11 |
Anti-IL-9 PE or APC | eBiosciences/Biolegend | 50-8091-82/514104 | clone RM9A4 |
Anti-IL-17a PE | BD Biosciences | 559502 | clone TC11-18H10 |
Anti-Foxp3 APC or PE | eBiosciences | 17-5773-82/12-5773-80 | clone FJK-16s |
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
Na2HPO4-2H2O | Sigma | 71643 | |
Dextrose/Glucose | Sigma | G7021 | |
HEPES, free acid | Sigma | H3375 | |
NH4Cl | Sigma | A9434 | |
Disodium EDTA | Sigma | D2900000 | |
KHCO3 | Sigma | 237205 | |
CaCl2 | Sigma | C5670 |