Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Udvikling af Stem Cell-afledte antigen-specifikke regulatoriske T celler mod Autoimmunitet

Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54720
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University College of Medicine

Abstract

Autoimmune sygdomme opstår på grund af tabet af immunologisk selv-tolerance. Regulatoriske T-celler (tregs) er vigtige mediatorer af immunologisk selv-tolerance. Tregs for ca. 5 - 10% af det modne CD4 + T-celle subpopulationen i mus og mennesker, med ca. 1 - 2% af disse tregs cirkulerer i det perifere blod. Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) kan differentieres til funktionel tregs, som har potentiale til at blive anvendt til cellebaserede behandlingsformer på autoimmune sygdomme. Her præsenteres en metode til at udvikle antigen (Ag) -specifikke tregs fra iPSCs (dvs. IPSC-tregs). Fremgangsmåden er baseret på inkorporering af transskriptionsfaktoren foxp3 og en Ag-specifik T-celle receptor (TCR) i iPSCs og derefter differentiere på OP9 stromaceller udtrykker Notch-ligander delta-lignende (DL) 1 og DL4. Efter in vitro differentiering, IPSC-tregs udtrykke CD4, CD8, CD3, CD25, foxp3, og Ag-specifik TCR og er i stand til at reagere på Ag-stimulering.Denne metode er blevet anvendt med succes til celle-baseret behandling af autoimmun arthritis i en murin model. Adoptiv overførsel af disse Ag-specifik iPSC-tregs i Ag-induceret arthritis (AIA) -fyldt mus har evnen til at reducere ledbetændelse og hævelse og forebygge knogletab.

Protocol

Alle dyreforsøg godkendes af Pennsylvania State University College of Medicine Animal Care udvalg (IACUC protokol # 45470) og gennemføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra foreningen for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care.

1. Stem Cell Culture

  1. Inkubér en 10 cm skål med 10 ml 0,1% gelatine i mindst 30 min ved 37 ° C (inkubator) med henblik på at belægge pladen.
  2. Fjern gelatine fra skålen og pladen 3 x 10 6 bestrålet SNL76 / 7-celler og inkuberes i en dag ved 37 ° C (inkubator) ved anvendelse af 10% DMEM-medium (10% FBS og 1% penicillin streptomycin).
  3. Fjern mediet fra pladen og kultur optøet iPSCs over SNL76 / 7 cell feeder lag ved hjælp iPSC medier (DMEM-medium indeholdende 15% føtalt kalveserum, 0,1 mmol / l ikke-essentielle aminosyrer, 1 mmol / l L-glutamin, og 0,1 mmol / l β-mercaptoethanol) 9. Den mus iPS-MEF-Ng-20D-17 celle line, der blev induceret fra muse embryonale fibroblaster ved retro viral transfektion af Oct3 / 4, Sox2, Klf4, og c-myc, blev opnået fra Dr. Shinya Yamanaka (Institut for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto, Japan).
  4. Skift medier på dag 3 med friske medier og observere IPSC kolonier under mikroskopet.
    BEMÆRK: Disse kolonier er små, skinnende klynger eller runde celler med en klar afgrænsning viser GFP udtryk under et fluorescerende mikroskop.

2. In vitro Differentiering af Ag-specifikke IPSC-tregs

  1. Generere konstruktionerne skal anvendes i retroviral transduktion af sub-kloning af OT-II TCR-gener og foxp3 i MiDR plasmid 10 forbundet med selv-spaltende peptid 2A at gøre MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-foxp3 konstrukt.
  2. Udfør retroviral transduktion 9 af iPSCs vha Plat E-celler som den pakkende cellelinje.
  3. På dag 0, frø OP9-DL1-DL4-IA B-celler enta minimal tæthed mellem 10 4 celler / cm2 ved anvendelse af OP-9 medier (α-MEM medium indeholdende 20% FCS og 2,2 g / l natriumbicarbonat. Plade 1 x 10 6 celler pr 10 cm skål.
  4. På dag 3, hvor OP9-DL1-DL4-IA b celler bliver 80-90% sammenflydende, fjerne medierne og frø 0,5 - 1 x 10 5 iPSCs løbet OP9-DL1-DL4 - IA B-celler i OP-9 medier.
    BEMÆRK: Dette etablerer co-kultur af iPSCs på OP9-DL1-DL4-IA B-celler og anses for at være dag 0 af differentiering 9.
  5. På dag 5, fjerner alle medier fra 10 cm skål ved aspiration, vaske cellerne med 10 ml 1x PBS, og aspirere PBS. Tilsæt 4 ml 0,25% trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Tilføj en anden 8 ml iPSC medier til cellerne, re-suspendere dem, og der centrifugeres ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
    1. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 10 ml iPSC medier. Inkubér disse resuspenderede celler på en frisk 10 cm skålog vende tilbage til inkubatoren i 30 min.
      BEMÆRK: Fjern OP9-DL1-DL4-IA b feederceller og holde de differentierende iPSCs flyder i medierne. Vedligehold OP9-DL1-DL4-IA B-celler kontinuerligt at opnå 80-90% sammenflydning for yderligere co-kultur.
    2. Efter 30 min indsamle de flydende celler, filtrere dem gennem et 70 um cellefilter, og tælle cellerne med et hæmocytometer.
  6. Seed 5 x 10 5 af iPSCs til et frisk 80 - 90% konfluent af OP9-DL1-DL4-IA B-celler i OP9 medier. Supplere mediet med mFlt-3L i en slutkoncentration på 5 ng / ml.
  7. På dag 8, indsamle delvist differentierede iPSCs ved at vaske pladen med medierne fra fadet selv ved hjælp af en 10 ml pipette. Bruge yderligere 5 ml OP-9 medier i skålen til forsigtigt vaske semi-adhærente celler ved forsigtig, kraftfuld pipettering for ikke at bryde OP9 monolag i bunden af ​​skålen. Gentag vask med 10 ml PBS for at høste alle semi-annonceHerent differentierende celler.
    1. Kombinere begge vasker, centrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur, resuspender i 10 ml OP9 medier indeholdende mFlt-3L (5 ng / ml) og mIL-7 (1 ng / ml) og filtreres gennem en 70 um celle si.
  8. Overfør cellerne i en 6-brønds dyrkningsplade indeholdende 80 - 90% sammenflydende OP9-DL1-DL4-IA B-celler, som i trin 1.1. Overfør celler høstet fra en 10 cm skål i en brønd i 6-brønds plade.
  9. På dag 10, ændre halvdelen af ​​mediet fra celler til frisk OP9 medier tilsat mFlt-3L (5 ng / ml) og mIL-7 (1 ng / ml). Gentag dette trin hver to dage.
  10. Hver 4-6 dage, afhængig af vækst, re-seed de differentierende iPSCs på plader med en frisk lag af OP9-DL1-DL4-IA B-celler, som beskrevet i trin 1.1.

3. Evaluering af In Vitro treg Differentiering og Modning

  1. Morfologiske ændringer af differentierende iPSCs.
    1. Monitor co-kultur af iPSCs med OP9-DL1-DL4-IA B-celler hverdagen ved at observere levende celler under en konventionel brightfield mikroskop (20X). Ved dag 5, observere kolonier med mesoderm-lignende egenskaber, såsom flade celler. Ved dag 8, observere små, runde klynger af celler, som repræsenterer differentierende celler.
    2. Brug trypanblåt Udelukkelse Metode til at tælle cellerne for at detektere antallet og procentdelen af ​​levende celler. Beregn cellelevedygtighed som antallet af levedygtige celler divideret med det totale antal celler inden for de fire gitre på hæmocytometeret. Hvis celler optager trypanblåt, anser dem døde eller ikke-levedygtige. Notér antallet af levende celler høstet fra kulturen.
  2. Flowcytometrianalyse differentiere iPSCs.
    1. På dag 5, 7, 11, 15, 19, 21, og 28 i co-kultur, fjerne cellerne med 0,25% trypsin som i trin 25.
    2. Forud for overfladefarvning med forskellige fluorokromkonjugerede antistoffer, incubate 1 x 10 6 celler med 100 pi Fc blokker 2.4G2 fortyndet i PBS (slutkoncentration 10 ug / ml) ved 4 ° C i 20 minutter for at forhindre bindingen af antistof til Fc-receptoren på celleoverfladen.
    3. På dag 5, 7, 11, 15, 19, 21, og 28, bruger 1 x 10 6 celler til flowcytometri med forskellige fluorokromkonjugerede antistoffer til påvisning celleoverflademarkørerne, herunder CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25, og CTLA4.
    4. Efter Fc blok, vaske cellerne med 10 ml PBS og pletten med forskellige fluorokromkonjugerede antistoffer i 20 minutter ved 4 ° C, og derefter udføre flowcytometrisk analyse med 15-farve flowcytometer. Bruge 0,200 ug antistof pr 10 6 celler fortyndet i 100 pi PBS.
    5. På dag 28, analysere cellerne ved flowcytometri 11 og gate på CD4 + CD8 + celler under anvendelse CD4 og CD8 fluorokromkonjugerede farvning; analysere for ekspression af TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, Og foxp3 (figur 1). For foxp3 farvning fikseres cellerne og permealize dem og derefter udføre antistof farvning 11.
  3. In vitro antigen stimulering af iPSCs.
    1. På dag 28 i co-kultur, høst iPSC-tregs fra kulturer ved at indsamle de flydende celler. Trypsinisér resten af ​​cellerne med 0,25% trypsin (som i trin 2.5) og genopslæmmes cellerne i 8 ml iPSC medier. Centrifuger i 5 minutter ved 400 xg ved stuetemperatur, aspireres medierne, og igen genopslæmmes cellerne i 10 ml medium.
      1. Inkubér resuspenderede celler i en ny 10 cm skål ved 37 ° C i 30 minutter og indsamle de flydende celler. Vask cellerne med kold PBS.
    2. Inkuber 3 x 10 6 splenocytter fra milte fra C57BL / 6 RAG1 - / - mus med 5 pM ovalbuminpeptid i 200 pi medie (OVA 323-339) ved 4 ° C i 30 minutter i en plade med 11 96.
    3. Bland tregs med OVA 323-339 splenocytter ved en 1: 4-forhold (brug 0,75 x 10 6 tregs). Der inkuberes ved 37 ° C i en CO2 inkubator i 40 timer. I de sidste 4 timer, tilsættes 4 pi fortyndet Brefeldin A i kulturen (faktiske koncentration 1.000 x, fortyndet i 1x kulturmedier).
    4. Harvest celler med 0,25% trypsin (som i trin 2.5), vask med 10% NaN3 og 0,5 M EDTA-opløsning (FACS buffer), blok med 100 pi fortyndet (slutkoncentration 10 ug / ml) Fc blokker 2.4G2, og pletten for overflademarkører, CD4, CD8, TCRVα2, og TCRVβ5 som i trin 3.2.3-3.2.4.
    5. Fastgør cellerne med en 4% paraformaldehydopløsning i PBS og permeabilisere med 100 ul 1x permeabilisering buffer efter celleoverfladen farvning. Advarsel! Paraformaldehyd er allergifremkaldende, kræftfremkaldende og giftige.
    6. Farv cellerne med fluorokromkonjugerede TGF-β og IL-10 i 20 min i mørke. Bruge 0,200 ug antistof / 10 6 celler diluted i 100 pi PBS. Detektere intracellulær produktion af TGF-β og IL-10 med 15-farve flowcytometer (figur 2).
    7. Vask cellerne tre gange med kold FACS-buffer før flowcytometrianalyse 11.
  4. In vivo persistens af Ag-specifik iPSC-tregs.
    1. Efter 8 dages co-kultur på OP9-DL1-DL4-IA B-celler, overføre iPSC-afledte præ-tregs (Thy1.2) som i trin 3.3.1 i Thy 1.1 kongene mus (4-6 uger gamle) via en haleveneinjektion uden bedøvelse. Før udførelse af haleveneinjektion, dilatere halevenen hjælp af en infrarød lampe i 5 minutter. Efter halevene dilatation, placeres musen i en fastholdelsesanlæg og adoptivt transfer 3 x 10 6 celler resuspenderet i 200 pi PBS ved injektion gennem halevenen.
    2. Seks uger efter treg overførsel, aflive mus ved CO 2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation. Sørg for, at mice er ikke trækker vejret. Åbne bughulen ved at skære den ydre hud af peritoneum med en saks og pincet og forsigtigt at trække det tilbage for at blotlægge den indre hud beklæder peritonealhulen. Isoler milten og perifere lymfeknuder af injicerede Thy 1.1 kongene mus.
    3. Opsamle cellerne fra milten og lymfeknuderne under anvendelse mekanisk brydning til opnåelse af en enkelt cellesuspension. Inkubér cellerne med 5 ml ACK-lysepuffer i 5 minutter ved stuetemperatur for at lysere røde blodlegemer. Opsamling og vask resterende splenocytter eller lymfocytter med 10 ml kold FACS-buffer.
    4. Efter vask, behandle celler med Fc blocker 2.4G2 ved 4 ° C i 20 minutter som i trin 3.2.2 og pletten med 100 pi fortyndet fluorochrom-konjugeret anti-Thy 1.2 antistoffer.
    5. Vask cellerne med 10 ml FACS buffer og fortsæt til flowcytometrianalyse 11.

4. In vivo modning og bekæmpelse af autoimmun Gigt

  • Generere konstruktionerne som i trin 2.1.
  • Udfør retroviral transduktion 9 som i trin 2.2.
  • In vivo differentiering og arthritis induktion i mus.
    1. Differentiere OT-II TCR / Foxp3-transducerede iPSCs (OT-II-Foxp3 / iPSCs), Foxp3-transducerede iPSCs, og dsRed transducerede iPSCs på OP9-DL1-DL4-IA b stromale celler i nærvær af cytokiner mFlt-3L og mIL-7 til 8 dage som beskrevet i trin 2.1 - 2.6.
    2. Trypisinize alle tre slags celler fra 10 cm plade og resuspender celler fra hver 10 cm plade i 10 ml frisk medium. Tilsæt cellerne til et frisk 10 cm plade og vende tilbage til inkubatoren i 30 min. Efter 30 min indsamle flydende celler.
    3. Pass celler gennem en 70 um celle si for at fjerne celleklynger og tælle bruge et hæmocytometer. Justér cellerne til en koncentration på 1,5 x 10 7 celler / ml i kold PBS og filtreres igen om nødvendigt. Hold celler på is indtil adoptiv celle transfer i mus. Injicer 200 pi af cellesuspensionen (3 x 10 6 celler) i tre forskellige grupper på 4 - 6 uger gamle C57BL / 6-mus via halevenen som beskrevet i 3.4.1
    4. På dag 10 efter celleoverførslen, injicere mus med 100 ug mBSA emulgeret i Freunds komplette adjuvans ved basen af ​​halen ved hjælp af en 1 ml sprøjte.
    5. På dag 17, bedøver mus ved hjælp af en isofluran fordamper (ifølge IACUC retningslinjer). Udnyt 4. - 5.% isofluran til induktion og 1 - 2% for vedligeholdelse. Inducere arthritis ved intraartikulær injektion af 20 ug mBSA i 10 pi PBS i venstre knæled og 20 ug mBSA og 100 ug hele OVA i 10 pi PBS i den højre knæled. Fødevarer og en gelpack kan placeres på strøelse gulvet efter arthritis har udviklet. Mus vil blive aflivet: huld (BCS) af 2/5 eller døende, svær kakeksi og / eller vedvarende tilbagelænethed (en 24-timers periode), og sværhedsgraden score 4. I score4, erytem og alvorlig hævelse omfatte ankel, fod og cifre, eller ankyloses af lemmet.
  • Karakterisering af OT-II TCR / Foxp3-transducerede iPSCs.
    1. Brug et fluorescerende mikroskop (20X) for at visualisere ikke-fikserede levende DsRed + GFP + -celler.
    2. Undersøg gen integration og udtryk af både Western blot og flowcytometri 11.
  • Treg udvikling og modning.
    1. I uge 2, 4, og 6 efter celleoverførslen, aflive musene. For dødshjælp, i hvert bur Brug 1 - 2 L af CO 2 i første etape. Når dyret har mistet bevidstheden, øge strømningshastigheden af CO2 til 4 - 5 l / min. Afliv mus ved CO 2 indånding. Isoler milten og dræne lymfeknuderne ved at skære den ydre hud af peritoneum med en saks og pincet og forsigtigt at trække det tilbage for at blotlægge den indre hud beklæder peritonealhulen.
    2. Saml enkelt celle suspension from milt og lymfeknuder ved mekanisk nedbrydning ved anvendelse af en celle si og en 1 ml sprøjte i 1% IPSC medier. Centrifugeres den koniske rør indeholdende mediet ved 400 g i 5 min. Resuspender cellepelleten i 5 ml ACK-lysepuffer at lysere røde blodlegemer. Re-centrifuge ved 1.000 rpm i 5 min. Resuspender cellepelleten og vaske de resterende splenocytter eller lymfocytter med kold FACS-buffer. Følg trin 3.4.4 - 3.4.5 og fortsætte til flowcytometrisk analyse.
  • Intracellulær farvning.
    1. På dag 50 efter infektion, isolere milten og dræne lymfeknuderne i mus (som i trin 4.5.1) efter aflivning af CO 2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation.
    2. Opsaml enkelt cellesuspension fra milten og lymfeknuderne efter mekanisk nedbrud under anvendelse af en celle si og en 1 ml sprøjte. Inkuber splenocytterne ved stuetemperatur i 5 minutter med 5 ml ACK-lysepuffer at lysere røde blodlegemer. Indsamle og vaske de resterende splenocytes eller lymfocytter med kold FACS-buffer. Følg trin 3.2.3 - 3.2.4, men pletten med overflademarkører CD4, CD8, CD25, og TCRVβ5.
    3. Fortsæt til rette celler til intracellulær farvning som beskrevet i 3.3.5 - 3.3.7 og analysere intracellulær cytokinproduktion (TGF-β og IL-10), i iPSC-afledt tregs og gate på levende CD4 + CD25 + celler.
  • Infiltration af Ag-specifikke tregs i knæ og suppression af arthritis.
    1. Efter trin (4,3 - 4.3.6) på dag 7 - 14 efter gigt induktion, aflive mus ved CO 2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation (ifølge IACUC retningslinjer). Fjern hår fra knæene med en elektrisk Clipper og punktafgifter knæene ved kirurgisk indgreb.
    2. Fjerne huden fra benene ved at gøre et indsnit i bagbenet med stump-end saks og skære huden på tværs af låret og ned til anklen. skræl forsigtigt huden over benet og foden for at blotlægge musklen. Fjernemusklen fra benet forsigtigt uden at beskadige knæleddet.
      1. Skær bagbenet lige over bækken / hofteled og skære skinnebenet hjælp skarp dissekere saks.
    3. Fix knæene i 4% formalin i 48 timer. Afkalk knæene ved anvendelse af 2,5 M myresyre; skylles tre gange i xylen i 3 minutter, skylles to gange i 100% ethanol, skylles to gange i 95% ethanol, skylles to gange i deioniseret vand i 2 minutter, og afkalkes i 1 mM EDTA. Behandle ved en sub-kogende temperatur (90 ° C) i 20 min.
    4. Afkøl fikseret væv i 30 minutter. Skyl den med 1x PBS i 4 min og integrere det i paraffin. Dehydrerer vævene gennem en række ethanol bade til at forskyde vandet, og derefter infiltrere dem med voks. Så integrere de infiltrerede væv i voks blokke. Udfør både lodret og vandret sektionering for farvning. Forbered 4 um snit med en glidende mikrotom.
    5. Udfør immunfluorescensfarvning på sektionerne efter standardprocedurer deparaffinisation og rehydrering hjælp xylen og ethanol 12.
    6. Blokere endogen peroxidaseaktivitet ved at nedsænke objektglasset i en tilstrækkelig mængde på 3% hydrogenperoxidopløsning i 3 min efter Ag hentning. Bloker dias for ikke-specifik binding i 3% BSA i PBS ved stuetemperatur i et fugtigt kammer i 60 min.
    7. Farv sektioner med 200 pi fluorokromkonjugerede TCRVβ5 antistof fortyndet 1: 100 i blokeringsopløsningen. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur i en 75 - 100% befugtet kammer, og vask 5 gange i 1 x PBS i 5 min.
    8. Kontrastfarve dias for nuklear farvning med en antifade reagens indeholder DAPI. Der tilsættes ca. 300 pi af den fortyndede DAPI farvning opløsning (300 nM i 1 x PBS) til dækglasset, idet man sikrer hele dækglas dækket. Opbevar objektglassene i mørke ved 4 ° C indtil analyse under et fluorescerende mikroskop (figur 3).
  • Gigt undertrykkelse assay
    1. Mål hævelse af begge knæ af musene før gigt induktion ved hjælp af en dial-gauge caliper at etablere en baseline.
    2. Følg trin (4,3 - 4.3.6) for gigt induktion og Treg overførsel. Mål mus knæ med en dial-gauge caliper post-treg overførsel.
    3. Beregn den procentvise forøgelse i knæet diameter: procent stigning = (Knee diameter på dag 1 - Knee diameter på dag 0) / Knee diameter på dag 0.
  • Måling af leddestruktion og inflammatorisk celleinfiltration i knæ ved histologi (figur 4).
    1. På dag 7 post-gigt induktion, aflive de mus som beskrevet tidligere og punktafgifter knæene ved kirurgisk indgreb. Se trin 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Fastgør knæene i 4% formalin, afkalkes i EDTA, og integrere i paraffin. Se trin 4.7.3
    3. Fjern begge knæ, fix i 10% formalin, og calcify i Formical-4. Integrer væv i Paraffin, afsnit ved 4 pm, og pletten med hematoxyli og eosin (H & E) eller Safranin O-farvning (som i trin 4.7.7) og observere under et mikroskop.
    4. Brug H & E-farvning til at evaluere knogle erosion med en semi-kvantitativ pointsystem (0: ingen erosioner; 4: udvidede erosioner og ødelæggelse af knogle). Brug Safranin O-farvning til at evaluere tabet af proteoglycaner og score med en semi-kvantitativ pointsystem (0: ingen tab af proteoglycaner; 3: fuldstændigt tab af farvning for proteoglycaner).
      1. Brug en semikvantitativ pointsystem for at score inflammatorisk celle infiltration på H & E farvede objektglas (0: ingen celle infiltration; 4: abounded celleinfiltration). Vurdere scores ved at undersøge begge knæ i en blindet måde.

    • 5. Måling af knogletab i knæ med høj opløsning Micro-computertomografi (mikro-CT) System

    1. På dag 10 post-gigt induktion, bedøve mus med 2% isofluran og forberede billeddannelse.
    2. Position mice med knæene opad i kammeret.
    3. Brug en høj opløsning mikro-CT-systemet til at erhverve in vivo-billeddannelse af knoglen arkitektur omkring knæene hos musene.
    4. Udfør mikro-CT-scanninger med en 2,2 mm længde, herunder mus knæled med følgende parametre: 10,5 um voxel størrelse på 55 kv, 145 pA 200 ms integration tid, 211 billeder.
    5. Import mikro-CT-billeder og fange frontal plane billeder efter yderligere billedbehandling (volumen rendering og transformation) (figur 5).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Som vist her, på dag 28, Ag-specifik tregs udtrykte væsentlige CD3 og Ag-specifik TCR, to T-celle-markører. CD3 + TCRVβ5 + population udtrykt CD4. De fleste af de CD3 + TCRVβ5 + CD4 + celler udtrykte også CD25, CD127, og CTLA-4, der typisk er udtrykt på et højt niveau i naturligt forekommende T Fo (nTregs) og i T-celler, der udtrykker foxp3 ektopisk. Foxp3 ekspression i iPSC-afledte celler fortsatte selv efter langvarig in vitro-stimulering med Notch-liganden, som påvist ved intracellulær farvning analyseret ved flowcytometri (figur 1). Derudover Ag-specifikke iPSC-tregs produceret suppressive cytokiner, såsom TGF-β og IL-10, når de stimuleres in vitro med Ag-pulserede splenocytter (figur 2), der angiver iPSC-tregs havde potentielle undertrykkende aktiviteter. Fluorescensmikroskopi afsløret at flere Foxp3 + celler var til stede i OVA-behandlede end PBS-behandlede knæ; der var ingen Foxp3 + -celler eksisterende i knæene i mus, der modtog de DsRed + vektor-transducerede iPSCs. Mange flere CD4 + Foxp3 + TCRVβ5 + -celler vist i knæene hos mus, der modtog iPSCs transduceret med den MiDR-TCR-foxp3 end MiDR-foxp3 (figur 3). Disse observationer tyder på, at Ag-specifikke IPSC-tregs migrere til AIA knæ efter adoptiv overførsel til modtagende mus. De overførte iPSC-afledte celler væsentligt nedsatte inflammatoriske knæ hævelse når OVA var til stede, men havde ingen virkning på kontrol knæet, der kun blev injiceret med mBSA i den murine model (figur 4); reduceret knogletab i cellen overførsel knæet visualiseret ved høj opløsning mikro-CT (figur 5).

    tp_upload / 54.720 / 54720fig1.jpg "/>
    Figur 1:. Differentiering af Ag-specifik iPSC-tregs Murin iPSCs blev transduceret med en konstruktion: MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-foxp3 indeholdende gener af OVA-specifikke TCR og foxp3. Genet-transducerede celler (DsRed +) blev co-dyrket på OP9-DL1-DL4-IA B-celler i nærvær af mFlt3L og mIL-7. (A) Morfologi af T REGS celledifferentiering på dag 0, 7, 14 og 22. (B) Flowcytometrisk analyse for proteinet ekspression af iPSC-afledte celler på dag 28. CD3 + TCRVβ5 + celler blev gated som angivet (R1) og analyseret for ekspression af CD4 og CD8, med CD25, CD127, CTLA- 4, og foxp3 vist for celler gated som CD4 + CD8 - celler (R2). (mørke linier, skraverede områder angiver isotypekontroller) klik her for at se et largis version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2: Funktionelle analyser af I n vitro differentierede Ag-specifik tregs Murine IPSC-tregs blev stimuleret af splenocytter. (APC'er; T Fo / APC'er = 1: 4) og pulset med OVA 323-339 peptid. Intracellulær cytokinproduktion (TGF-β og IL-10) blev analyseret ved flowcytometri efter gating på live CD4 + CD25 + celler. (Mørke linier, skraverede områder angiver isotypekontroller) Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3: Ag-specifikke iPSC-tregs infiltrere knæleddene. Ag-specifikke IPSC-tregs blev adoptivt overført til C57BL / 6 mus. Kort efter arthritis induktion (dag 7 - 14), blev knæene fjernet og farvet for immunhistologi (skala søjler: 20 pm). Mus, der modtager OVA-specifikke iPSC-tregs har et stort antal TCRVβ5 + celler i knæene. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4: adoptiv overførsel af Ag-specifik iPSC-tregs mildner AIA i mus Murine iPSCs blev transduceret med den retrovirale konstrukt MiDR, MiDR-foxp3 eller MiDR-TCR-foxp3 og blev co-dyrket på OP9-DL1 / DL4 /. IA B-celler. På dag 7, som genet transducerede celler (3 x 10 6 / mus) var endoptively overført til C57BL / 6-mus, som blev induceret med AIA to uger efter celleoverførslen. På dagen efter arthritis induktion blev arthritis sværhedsgrad overvåget ved måling af knæet diameter. (AC) procent stigning i knæet diameter. Stigning i knæ diameter blev beregnet på basis præinjektion knæ diameter for hver mus før injektion på dag 0. Arthritis score blev vurderet ved at undersøge begge knæ på en blændet måde; hver knæ blev tildelt en score (0: ingen synlig hævelse eller misfarvning; 1: synlig hævelse med eller uden misfarvning, 2: moderat hævelse med misfarvning, 3: alvorlig hævelse med misfarvning). I hver gruppe blev fem mus anvendes, og data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. (D) Middelværdien lave på dag 7 for begge knæ fra fem mus. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD fra tre uafhængige forsøg (** p <0,01, *** p <0,001, to-vejs ANOVA). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 5
    Figur 5:. Ag-specifikke iPSC-tregs migrere til OVA injicerede Knee og Reducer Bone Loss IPSC-tregs blev adoptivt overført til C57BL / 6 mus. Senest 21 dage efter arthritis induktion blev mus bedøvet og knoglen arkitektur omkring musen knæ blev afbildet af mikro-CT-systemet. Mus, der modtog OT-II TCR / foxp3 genet-transducerede murine IPSC-tregs udviser signifikant reduktion af knogletab i sammenligning med kontrolmus, der modtog vektor-transducerede iPSCs. (A) De scanninger blev udført med en 2,2 mm længde, og billeder blev indfanget efter yderligere billedbehandling (volumen rendering og transformation;skala barer:. 1 mm) (B) Bone volumen omkring knæleddet blev evalueret ved brug tredimensionel rekonstruktion af mikro-CT-billeder, og knogle volumen inde i mængden af interesse blev beregnet (skala søjler:. 1 mm) Klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I denne protokol, et kritisk trin er in vitro differentiering af TCR / Foxp3 gen-transducerede iPSCs. In vitro Notch signalering inducerer udvikling mod T-celle afstamning. For at differentiere iPSCs i CD4 + foxp3 + tregs, vi brugte OP9-DL1 / DL4 / IA B-celler, som meget udtrykkelige MHC II (IA b) molekyler. De fleste af de iPSCs differentiere til CD4 + celler. Men efter at overfladen TCR ekspression mange differentierede præ-T-celler taber, evnen til at differentiere og til sidst dør. Som følge heraf celletallet af IPSC-afledte funktionelle tregs drastisk reducerer efter fire ugers in vitro differentiering. For at undgå dette, kan tilsætning af IL-2 forbedre celleoverlevelse ved disse tidspunkter. En alternativ fremgangsmåde til at drive modning og overlevelse af Ag-specifikke præ-tregs er at overføre de præ-tregs der er differentieret in vitro i en uge i mus. Disse præ-tregs kan samarbejdentinue differentiere og modning in vivo i yderligere tre uger. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, kan en funktionel Ag-specifik Treg population blive genereret fra iPSCs, som er nTregs-lignende og har evnen til at undertrykke autoimmune arthritis i den murine model.

    At forbedre effektiviteten af in vivo udvikling af Ag-specifik iPSC-tregs, forskellige forbindelser (fx retinsyre, gelectin) 13,14 eller suppressive cytokiner (f.eks TGF-β, IL-10) kan anvendes efter adoptiv overførsel af præ-tregs. Ud over at øge cellens overlevelse, kan denne kombinerede fremgangsmåde opretholde foxp3 ekspression 14,15 og forbedre kvaliteten af Ag-specifikke iPSC-tregs.

    Et potentielt problem, der kunne opstå i vivo treg udvikling er overordnet immunosuppression, hvilket resulterer i komplikationer under infektioner eller efterfølgende vægttab. Et stort antal af Ag-specifik tregs udvikler i VIvo kan forværre infektioner. I dette tilfælde et selvmordsgen, den inducerbare caspase 9 (ICasp9) 15,16, kan inkorporeres i TCR / foxp3 vektoren. Denne fremgangsmåde tillader fjernelse af stamcelle-afledte tregs ved indsprøjtning af en bioinert lille molekyle dimeriserende middel (AP1903) til "slukke" generering af stamcelle-afledt tregs, som vil overvinde dette potentielt problem.

    En selvstændig Ag er en typisk protein genkendes af immunsystemet hos værter, der lider af en individuel autoimmun sygdom. Denne selv-Ag er målet for immunsystemet, og de korrelerede T-celler bliver ikke slettet. For at generere self-Ag specifikke tregs, anvendelse af TCR transduktion er et godt valg. En selvstændig Ag (fx heat shock protein) specifikt TCR kan transduceres til modne CD4 + CD25 + tregs fra perifere mononukleære blodceller (PBMC'er), og denne fremgangsmåde er blevet anvendt i kliniske forsøg. Alternativt, som described i denne protokol, ved hjælp af gen-transduktion af selv-Ag specifik TCR med foxp3 og stimulering med Notch signalering, stamceller afledt tregs kan være selv-Ag specifik tregs.

    Cellebaserede terapier for autoimmune sygdomme, der anvender manipuleret tregs kan være nyttige 17. Selv TCR transduktion i T-celler har vist sig at være sikker, gennemførlig, og finder anvendelse i kliniske forsøg, er der stadig alvorlige sikkerhedsproblemer som følge af autoimmunitet forårsaget af krydsreaktivitet med sunde væv 18. Desuden bruger de nuværende metoder, genetisk modificerede tregs har normalt en kortsigtet vedholdenhed in vivo 19. Alternativt en lovende kilde til udvikling af et stort antal monoklonale Ag-specifikke tregs er stamceller. Embryonale stamceller (EKSF) har den bedste pluripotens og selvfornyelse, men det er umuligt at opnå dem fra patienter. Selvom let isoleres fra det perifere blod, hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) er multi-potente stamceller og kan udvides i cellekultur på samme måde som ESC 20. Present iPSC teknologien har udviklet til en mere effektiv generation af PSC fra patienters somatiske celler ved transduktion af forskellige transkriptionsfaktorer. En række metodologiske forbedringer er blevet udviklet i de senere år at generere iPSCs ved maksimalt at reducere potentielle farer, såsom immunogenicitet og tumorgenicitet. I forhold til økonomiske og sociale råd, iPSCs har identiske pluripotens og selv-fornyelse. Som følge heraf kan iPSC teknologi giver en fordel i udviklingen patient-og / eller sygdomsspecifikke PSC. Brugen af iPSCs at udvikle Ag-specifik tregs kan rykke inden for cellebaserede behandlingsformer for autoimmune sygdomme 10,11.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Dette projekt blev finansieret, delvis under tilskud fra National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 og K18CA151798), American Diabetes Association (1-16-IBS-281), og Pennsylvania Department of Health (Tobacco Settlement Funds) til JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
    2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
    3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
    4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
    5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
    6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
    7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
    8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
    9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. , e3986 (2012).
    10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
    11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
    12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. , (2007).
    13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
    14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
    15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
    16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
    17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66 (2010).
    18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
    19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
    20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

    Tags

    Immunologi regulatorisk T-celle pluripotente stamcelle celledifferentiering antigeninduceret arthritis mus autoimmune sygdomme
    Udvikling af Stem Cell-afledte antigen-specifikke regulatoriske T celler mod Autoimmunitet
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P.,… More

    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter