Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utveckling av stamcellshärledda antigen-specifika regulatoriska T-celler mot autoimmunitet

Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54720
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University College of Medicine

Abstract

Autoimmuna sjukdomar uppstår på grund av förlusten av immunologisk självtolerans. Regulatoriska T-celler (tregs) är viktiga mediatorer för immunologisk självtolerans. Tregs representerar omkring 5 - 10% av den mogna CD4 + T-cell subpopulation i möss och människor, med ca 1 - 2% av dessa tregs som cirkulerar i det perifera blodet. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) kan delas in i funktionella tregs, som har en potential att användas för cellbaserade terapier för autoimmuna sjukdomar. Här presenterar vi en metod för att utveckla antigen (Ag) specifika tregs från iPSCs (dvs IPSC-tregs). Metoden är baserad på införlivande av den transkriptionsfaktorn Foxp3 och en Ag-specifik T-cellreceptor (TCR) i iPSCs och därefter differentiera på OP9 stromala celler som uttrycker Notch-ligander deltaliknande (DL) 1 och DL4. Efter in vitro-differentiering, IPSC-tregs uttrycka CD4, CD8, CD3, CD25, foxp3, och Ag-specifik TCR och kan svara på Ag stimulering.Denna metod har med framgång tillämpas på cellbaserad terapi av autoimmun artrit i en murin modell. Adoptiv överföring av dessa Ag-specifik iPSC-tregs i Ag-inducerad artrit (AIA) -haltig möss har förmågan att minska ledinflammation och svullnad och för att förhindra benförlust.

Protocol

Alla djurförsök godkänts av Pennsylvania State University College of Medicine Animal Care kommittén (IACUC protokollet # 45470) och genomförs i enlighet med de riktlinjer Föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care.

1. Stem Cell Culture

  1. Inkubera en 10 cm skål med 10 ml 0,1% gelatin i minst 30 minuter vid 37 ° C (inkubator) för att belägga plattan.
  2. Ta bort gelatin från skålen och plattan 3 x 10 6 bestrålade SNL76 / 7-celler och inkubera under en dag vid 37 ° C (inkubator) med användning av 10% DMEM-medium (10% FBS och 1% penicillin streptomycin).
  3. Ta bort materialet från plattan och kultur tinas iPSCs över SNL76 / 7 cell feeder lager med iPSC media (DMEM media som innehåller 15% fetalt kalvserum, 0,1 mmol / L icke-essentiella aminosyror, 1 mmol / L L-glutamin, och 0,1 mmol / L β-merkaptoetanol) 9. Den mus iPS-MEF-Ng-20D-17 cell line, som framkallades från mus embryonala fibroblaster från retroviral transfektion av Oct3 / 4, Sox2, Klf4, och c-Myc, erhölls från Dr. Shinya Yamanaka (Institutet för Frontier medicinska vetenskaper, Kyoto University, Kyoto, Japan).
  4. Ändra media på dag tre med färska media och observera IPSC kolonier under mikroskop.
    OBS: Dessa kolonier är små, blanka kluster eller runda celler med en tydlig avgränsning visar GFP uttryck under ett fluorescerande mikroskop.

2. In vitro-differentiering av Ag-specifika IPSC-tregs

  1. Generera konstruktionerna som skall användas i retroviral transduktion genom sub-kloning av OT-II TCR-gener och Foxp3 in i Midr plasmiden 10 länkad med själv klyva peptid 2A för att göra Midr-TCRα-2A-TCRβ-2A-foxp3 konstruktet.
  2. Utföra retroviral transduktion 9 av iPSCs använder Plat E-celler som den packande cellinjen.
  3. På dag 0, frö OP9-DL1-DL4-IA B-celler enTA minsta densitet på 10 4 celler / cm2 med hjälp av OP-9 medium (α-MEM-medium innehållande 20% FCS och 2,2 g / L natriumbikarbonat. Plate 1 x 10 6 celler per 10 cm skål.
  4. På dag tre, då OP9-DL1-DL4-IA B-celler blir 80-90% sammanflytande, ta bort media och utsäde 0,5 - 1 x 10 5 iPSCs över OP9-DL1-DL4 - IA B-celler i OP-9 media.
    OBS: Detta etablerar samtidig kultur iPSCs på OP9-DL1-DL4-IA B-celler och anses vara dag 0 av differentiering 9.
  5. På dag 5, ta bort media från 10 cm skålen genom aspiration, tvätta cellerna med 10 ml 1 x PBS och aspirera PBS. Tillsätt 4 ml av 0,25% trypsin och inkubera vid 37 ° C under 10 min. Lägga till ytterligare 8 ml iPSC medium till cellerna, återsuspendera dem, och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid rumstemperatur.
    1. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml iPSC media. Inkubera dessa återsuspenderas celler på en ny 10 cm skåloch återgå till inkubatorn under 30 min.
      OBS: Ta bort OP9-DL1-DL4-IA B matarceller och hålla de differentierande iPSCs flyter i media. Bibehålla OP9-DL1-DL4-IA B-celler kontinuerligt för att uppnå 80-90% konfluens för ytterligare co-kultur.
    2. Efter 30 min, samla in de flytande celler, filtrera dem genom ett 70 | im cellfilter och räkna cellerna med en hemocytometer.
  6. Seed 5 x 10 5 av iPSCs till en ny 80-90% sammanflytande av OP9-DL1-DL4-IA B-celler i OP9 media. Komplettera mediet med mFlt-3L vid en slutlig koncentration av 5 ng / ml.
  7. På dag 8, samla delvis differentierade iPSCs genom att tvätta plattan med media från skålen själv med hjälp av en 10 ml pipett. Använd ytterligare 5 ml OP-9 media i skålen försiktigt tvätta bort halv vidhäftande celler genom försiktig, kraftfull pipettering för att inte bryta OP9 monoskiktet i botten av skålen. Upprepa tvätta med 10 ml PBS för att skörda alla semi-adHerent differentiera celler.
    1. Kombinera båda tvättar, centrifugera vid 400 xg under 5 min vid rumstemperatur, återsuspendera i 10 ml OP9 media innehållande mFlt-3L (5 ng / ml) och mIL-7 (1 ng / ml) och filtrera genom en 70 ìm cell sil.
  8. Överför celler i en 6-brunnsodlingsplatta innehållande 80-90% sammanflytande OP9-DL1-DL4-IA B-celler, som i steg 1,1. Överför celler skördas från en 10 cm skål i en brunn på 6-brunnar.
  9. På dag 10, ändra hälften av mediet från celler till färskt OP9 media kompletterat med mFlt-3L (5 ng / ml) och mIL-7 (1 ng / ml). Upprepa detta steg varannan dag.
  10. Var 4-6 dagar, beroende på tillväxt, re-frö de differentierande iPSCs på plattor med ett nytt skikt av OP9-DL1-DL4-IA B-celler, som beskrivs i steg 1,1.

3. Utvärdering av in vitro Treg differentiering och mognad

  1. Morfologiska förändringar av differentierande iPSCs.
    1. monitor samtidig kultur iPSCs med OP9-DL1-DL4-IA B-celler varje dag genom att observera levande celler under en konventionell bright mikroskop (20X). Vid dag 5, observera kolonierna med mesoderm liknande egenskaper, såsom tillplattade celler. Vid dag 8, observera små, runda kluster av celler, som representerar differentierande celler.
    2. Använd trypanblåttexklusion metod för att räkna cellerna för att detektera antalet och andelen levande celler. Beräkna cellviabilitet som antalet viabla celler dividerat med det totala antalet celler i de fyra gallren på hemocytometer. Om celler ta upp trypanblått, anser dem döda eller icke livsdugliga. Registrera antalet levande celler som skördats från kulturen.
  2. Flödescytometrianalys att differentiera iPSCs.
    1. På dagarna 5, 7, 11, 15, 19, 21, och 28 i samodling, avlägsna cellerna med 0,25% trypsin som i steg 25.
    2. Före ytan färgning med olika fluorokromkonjugerade antikroppar, incubate 1 x 10 6 celler med 100 pl Fc blockerare 2.4G2 utspätt i PBS (slutlig koncentration 10 | ig / ml) vid 4 ° C under 20 min för att förhindra bindningen av antikroppen till Fc-receptom på cellytan.
    3. På dagarna 5, 7, 11, 15, 19, 21, och 28, använda 1 x 10 6 celler för flödescytometri med olika fluorokromkonjugerade antikroppar för att detektera de cellytmarkörer, inklusive CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25, och CTLA4.
    4. Efter Fc-block, tvätta cellerna med 10 ml PBS och fläcken med olika fluorokromkonjugerade antikroppar under 20 minuter vid 4 ° C, och sedan utför flödescytometrisk analys med 15 färger flödescytometer. Använda 0,200 pg av antikropp per 10 6 celler utspädda i 100 pl PBS.
    5. På dag 28, analysera cellerna genom flödescytometri 11 och grind på CD4 + CD8 + celler med användning av CD4 och CD8 fluorokrom-konjugerad färgning; analysera uttrycket av TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, Och foxp3 (Figur 1). För foxp3 färgning, fixera cellerna och permealize dem och sedan utföra antikroppsfärgning 11.
  3. In vitro antigen stimulering av iPSCs.
    1. På dag 28 av co-kultur, skörd iPSC-tregs från kulturer genom att samla de flytande cellerna. Trypsinize resten av cellerna med 0,25% trypsin (som i steg 2,5) och återsuspendera cellerna i 8 ml iPSC media. Centrifugera i 5 minuter vid 400 xg vid rumstemperatur, aspirera mediet, och återigen återsuspendera celler i 10 ml medium.
      1. Inkubera återsuspenderas celler i en ny 10 cm skål vid 37 ° C under 30 min och samla in de flytande celler. Tvätta cellerna med kall PBS.
    2. Inkubera 3 x 10 6 splenocyter från mjältar av C57BL / 6 Rag1 - / - möss med 5 ^ M ovalbuminpeptid i 200 | il medium (OVA 323-339) vid 4 ° C under 30 min i en 96 brunnars platta 11.
    3. Blanda tregs med OVA 323-339 splenocyter på en 1: 4-förhållande (använd 0,75 x 10 6 tregs). Inkubera vid 37 ° C i en CO2-inkubator under 40 timmar. Under de senaste fyra timmar, tillsätt 4 pl utspätt Brefeldin A i odlings (faktiska koncentrationen 1,000x, utspätt i 1x odlingsmedier).
    4. Harvest celler med 0,25% trypsin (såsom i steg 2,5), tvätta med 10% NaN3 och 0,5 M EDTA-lösning (FACS-buffert), blockera med 100 pl av utspätt (slutlig koncentration 10 | ig / ml) Fc blockerare 2.4G2, och fläck för ytmarkörer, CD4, CD8, TCRVα2 och TCRVβ5 som i steg 3.2.3-3.2.4.
    5. Fixera cellerna med 4% paraformaldehydlösning i PBS och permeabilisering med 100 pl av 1x permeabilization buffert efter cellytan färgning. Försiktighet! Paraformaldehyd är allergiframkallande, cancerframkallande, och toxiskt.
    6. Färga cellerna med fluorokrom-konjugerade TGF-β och IL-10 under 20 minuter i mörker. Använd 0.200 xg antikropp / 10 6 celler diluted i 100 pl PBS. Detektera den intracellulära produktionen av TGF-β och IL-10 med 15-färg-flödescytometer (Figur 2).
    7. Tvätta cellerna tre gånger med kall FACS-buffert före flödescytometrisk analys 11.
  4. In vivo ihållande Ag-specifik iPSC-tregs.
    1. Efter 8 dagars samodling på OP9-DL1-DL4-IA B-celler, överföra iPSC härrörande pre-tregs (Thy1.2) som i steg 3.3.1 i Thy 1.1 kongena möss (4-6 veckor gamla) via en injektion i svansvenen utan bedövning. Före genomförandet av injektion i svansvenen, dilatera svansvenen med användning av en infraröd lampa i 5 min. Efter svansvenen utvidgning, placera musen i fixerings och adoptivt överföra 3 x 10 6 celler återsuspenderades i 200 pl PBS genom att injicera genom svansvenen.
    2. Sex veckor efter Treg överföringen avliva möss av CO 2 kvävning följt av halsdislokation. Se till att mice är inte andas. Öppna peritonealhålan genom att den yttre huden på bukhinnan med hjälp av sax och pincett och försiktigt dra det tillbaka för att exponera den inre huden bekläder peritonealhålan. Isolera mjälten och perifera lymfknutor injicerade Thy 1.1 kongena möss.
    3. Samla upp cellerna från mjälten och lymfkörtlar som använder mekanisk brytning för att ge en enkelcellsuspension. Inkubera cellerna med 5 ml ACK lyserings-buffert i 5 min vid RT för att lysera röda blodkroppar. Samla in och tvätta återstående splenocyter eller lymfocyter med 10 ml kall FACS buffert.
    4. Efter tvätt, behandla celler med Fc-blockerare 2.4G2 vid 4 ° C under 20 min såsom i steg 3.2.2 och fläcken med 100 pl utspädda fluorokromkonjugerade anti-Thy 1.2 antikroppar.
    5. Tvätta cellerna med 10 ml FACS buffert och gå vidare till flödescytometrisk analys 11.

4. In vivo Mognad och bekämpande av autoimmun artrit

  • Generera konstruktionerna som i steg 2,1.
  • Utför retroviral transduktion 9 som i steg 2,2.
  • In vivo differentiering och artrit induktion i möss.
    1. Differentiera OT-II TCR / Foxp3-transducerade iPSCs (OT-II-Foxp3 / iPSCs), Foxp3-transducerade iPSCs och DsRed transducerade iPSCs på OP9-DL1-DL4-IA b stromala celler i närvaro av cytokiner mFlt-3L och mIL-7 för 8 dagar som beskrivs i steg 2,1 - 2,6.
    2. Trypisinize alla tre typer av celler från 10 cm platta och återsuspendera celler från varje 10 cm platta i 10 ml färskt medium. Tillsätt celler till en färsk 10 cm platta och återgå till inkubatorn under 30 min. Efter 30 minuter, samla flytande celler.
    3. Passera celler genom en 70 ìm cell sil för att avlägsna cellkluster och räkna med en hemocytometer. Justera cellerna till en koncentration av 1,5 x 10 7 celler / ml i kall PBS och filtrera igen om det behövs. Hålla cellerna på is tills adoptiv cellöverföring i möss. Injicera 200 pl av cellsuspensionen (3 x 10 6 celler) in i tre olika grupper av 4-6 veckor gamla C57BL / 6-möss genom svansvenen såsom beskrivits i 3.4.1
    4. På dag 10 efter cellöverföringen, injicera möss med 100 | ig av mBSA emulgerat i Freunds fullständiga adjuvans vid svansbasen med användning av en 1 ml spruta.
    5. På dag 17, söva möss med användning av en isofluran förångare (enligt IACUC riktlinjer). Utnyttja 4-5% isofluran för induktion och 1-2% för underhåll. Framkalla artrit genom intraartikulär injektion av 20 mikrogram mBSA i 10 pl PBS i den vänstra knäleden och 20 mikrogram mBSA och 100 mikrogram hela OVA i 10 ul PBS i rätt knäleden. Mat och en gelpack kan placeras på strö golvet efter artrit har utvecklats. Möss kommer att avlivas: Body Condition Score (BCS) av 2/5 eller döende, svår utmärgling och / eller ihållande VILA (en 24-timmarsperiod) och svårighetsgrad poäng 4. poäng4, erytem och kraftig svullnad omfattar ankeln, fot och siffror, eller ankyloses av lemmen.
  • Karakterisering av OT-II TCR / FOXP3-omvandlade iPSCs.
    1. Använd en fluorescerande mikroskop (20X) för att visualisera ofixerade levande DsRed + GFP + celler.
    2. Undersök gen integration och uttryck av både Western blöt och flödescytometri 11.
  • Treg utveckling och mognad.
    1. Vid vecka 2, 4, och 6 efter cellöverföringen, avliva möss. För dödshjälp, i varje bur använda 1-2 liter CO2 i första steget. När djuret har förlorat medvetandet, öka flödeshastigheten av CO2 till 4-5 L / min. Avliva möss genom CO 2 inandning. Isolera mjälten och dränera lymfkörtlarna genom att skära den yttre huden på bukhinnan med hjälp av sax och pincett och försiktigt dra det tillbaka för att exponera den inre huden bekläder peritonealhålan.
    2. Samla enda cellsuspensionen from mjälten och lymfkörtlar genom mekanisk nedbrytning med användning av en cellfilter och en 1 ml spruta i en% IPSC medier. Centrifugera det koniska röret innehållande media vid 400 g under 5 min. Återsuspendera cellpelleten i 5 ml ACK lyserings-buffert för att lysera röda blodkroppar. Re-centrifug vid 1000 rpm under 5 min. Återsuspendera cellpelleten och tvätta de återstående splenocyter eller lymfocyter med kall FACS buffert. Följ stegen 3.4.4 - 3.4.5 och fortsätt till flödescytometrisk analys.
  • Intracellulär färgning.
    1. På dag 50 efter utmaning, isolera mjälten och dränera lymfkörtlarna hos möss (som i steg 4.5.1) efter eutanasi av CO 2 inandning följt av halsdislokation.
    2. Samla upp den enda cellsuspension från mjälte och lymfkörtlar genom mekanisk nedbrytning med användning av en cellfilter och en 1 ml spruta. Inkubera splenocyterna vid rumstemperatur under 5 minuter med 5 ml ACK lyserings-buffert för att lysera röda blodkroppar. Samla och tvätta de återstående splenocytes eller lymfocyter med kall FACS-buffert. Följ stegen 3.2.3 - 3.2.4, men fläcken med ytmarkörer CD4, CD8, CD25, och TCRVβ5.
    3. Fortsätt att fixera celler för intracellulär färgning såsom beskrivits i 3.3.5 - 3.3.7 och analysera intracellulär cytokinproduktion (TGF-β och IL-10) hos iPSC-härledda tregs och grind på levande CD4 + CD25 + celler.
  • Infiltration av Ag-specifika tregs i knäna och undertryckande av artrit.
    1. Efter steg (4,3 - 4.3.6) på dagarna 7-14 efter artrit induktion, avliva möss genom CO 2 inandning följt av halsdislokation (enligt IACUC riktlinjer). Ta bort hår från knäna med en elektrisk klippare och skära knäna genom kirurgiskt ingrepp.
    2. Ta bort huden från benen genom att göra en incision i bakbenet med trubbig ände sax och skära in i huden tvärs över låret och ner till ankeln. Försiktigt skal huden över ben och fot för att exponera muskeln. Avlägsnamuskeln från benet försiktigt utan att skada knäleden.
      1. Skär bakben strax ovanför bäcken / höftleden och skär skenbenet med hjälp av vassa dissekera sax.
    3. Fäst knäna i 4% formalin under 48 timmar. Avkalka knäna genom att använda 2,5 M myrsyra; Skölj tre gånger i xylen under 3 min, skölj två gånger i 100% etanol, skölj två gånger i 95% etanol, skölj två gånger i avjoniserat vatten under 2 min och avkalkning i 1 mM EDTA. Behandla vid en sub-koktemperatur (90 ° C) under 20 min.
    4. Kyla den fasta vävnaden i 30 min. Skölj med 1x PBS under 4 minuter och bädda in det i paraffin. Dehydratisera vävnaderna genom en serie av etanol bad för att tränga undan vattnet, och sedan infiltrera dem med vax. Då bädda in infiltrerat vävnader i vax block. Utför både vertikalt och horisontellt sektionering för färgning. Förbereda 4 | j, m sektioner med en glidande mikrotom.
    5. Utför immunofluorescerande färgning på sektioner efter standardprocedurer för deparaffition och rehydrering med hjälp av xylen och etanol 12.
    6. Blockera endogen peroxidasaktivitet genom nedsänkning av objektglaset i en tillräcklig mängd av 3% -ig vätesuperoxidlösning under 3 min efter Ag hämtning. Block diabilder för icke-specifik bindning i 3% BSA i PBS vid rumstemperatur i en fuktig kammare under 60 min.
    7. Stain sektioner med 200 pl av fluorokromkonjugerade TCRVβ5 antikropp utspädd 1: 100 i blockeringslösning. Inkubera i 2 h vid rumstemperatur i en 75 till 100% fuktad kammare, och tvätta 5 gånger i 1 x PBS under 5 min.
    8. Kontrast bilderna för nukleär färgning med en antifade reagens innehållande DAPI. Tillsätt ca 300 pl av den utspädda DAPI färglösningen (300 nM i 1x PBS) till täck, göra vissa att hela täck täcks. Lagra objektglasen i mörker vid 4 ° C fram till analys under ett fluorescensmikroskop (figur 3).
  • Artrit undertryckande assay
    1. Mät svullnad i båda knäna hos mössen innan artrit induktion genom att använda en fjärrmätare bromsok att etablera en baslinje.
    2. Följ steg (4,3 - 4.3.6) för artrit induktion och Treg överföring. Mät mus knä med en fjärrmätare bromsok efter Treg överföring.
    3. Beräkna ökningen i knäet diameter procent: Procent ökning = (Knee diameter på dag 1 - Knä diameter på dag 0) / Knä diameter på dag 0.
  • Mätning av leddestruktion och inflammatoriska celler infiltration i knäna genom histologi (Figur 4).
    1. På dag 7 efter artrit induktion, avliva möss som beskrivits tidigare och skära knäna genom kirurgiskt ingrepp. Se steg 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Fäst knäna i 4% formalin, kalka i EDTA, och bädda in i paraffin. Se steg 4.7.3
    3. Ta bort båda knäna, fixa i 10% formalin, och förkalkas i Formical-4. Bädda vävnaderna i paraffin, avsnitt vid 4 pm, och fläcken med hematoxyli och eosin (H & E) eller Safranin O färgning (såsom i steg 4.7.7) och observera under ett mikroskop.
    4. Använd H & E färgning att utvärdera ben erosion med en semi-kvantitativ poängsystem (0: ingen erosioner; 4: utökade erosioner och nedbrytning av ben). Använd Safranin O färgning att utvärdera förlusten av proteoglykaner och poäng med en semi-kvantitativ poängsystem (0: ingen förlust av proteoglykaner, 3: total förlust av färgning för proteoglykaner).
      1. Använd en semi-kvantitativ poängsystem att göra mål inflammatorisk cellinfiltration på H & E färgade objektglas (0: ingen cell infiltration, 4: flödade cellinfiltration). Utvärdera poäng genom att undersöka båda knäna på en blindad sätt.

    • 5. Mätning av benförlust i knäna med hög upplösning Micro-datortomografi (mikro-CT) System

    1. På dag 10 efter artrit induktion, söva möss med 2% isofluran och förbereda för avbildning.
    2. positionen mice med knäna uppåt i kammaren.
    3. Använda en högupplösande mikro-CT-system för att förvärva in vivo-avbildning av benet arkitekturen runt knäna hos mössen.
    4. Utför mikro datortomografi med 2,2 mm längd, inklusive mus knäleder med följande parametrar: 10,5 um voxelstorlek vid 55 kv, 145 iA 200 ms integrationstiden, 211 bilder.
    5. Import mikro-CT-bilder och fånga frontal plan bilder efter ytterligare bildbehandling (volym rendering och omvandling) (Figur 5).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Som visas här, på dag 28, Ag-specifik tregs avsevärt uttryckt CD3 och Ag-specifik TCR, två cellmarkörer T. CD3 + TCRVβ5 + populationen uttryckte CD4. De flesta av de CD3 + TCRVβ5 + CD4 + celler också uttryckta CD25, CD127, och CTLA-4, vilka typiskt uttrycks vid förhöjda nivåer i naturligt förekommande T regs (nTregs) och i T-celler som uttrycker Foxp3 ektopiskt. Foxp3 expression i iPSC-härledda celler kvarstod till och med efter långvarig stimulering in vitro med Notch-ligand, såsom detekterades genom intracellulär färgning analyserades med flödescytometri (figur 1). Dessutom har Ag-specifika iPSC-tregs producerade suppressiva cytokiner, såsom TGF-β och IL-10, när de stimuleras in vitro med Ag-pulsade splenocyter (Figur 2), vilket indikerar den iPSC-tregs hade potentiella suppressiva aktiviteter. Fluorescensmikroskopi avslöjade att fler Foxp3 + celler var närvarande i OVA-behandlade än de PBS-behandlade knän; det fanns inga FOXP3 + celler som finns i knäna i möss som fick de DsRed + vektor omvandlade iPSCs. Många fler CD4 + Foxp3 + TCRVβ5 + celler som presenteras i knäna på möss som fick iPSCs transducerade med Midr-TCR-Foxp3 än Midr-Foxp3 (Figur 3). Dessa observationer antyder att Ag-specifika IPSC-tregs migrera till AIA knäet efter adoptiv överföring in i mottagarmöss. De överförda iPSC-härledda celler minskade kraftigt den inflammatoriska knä svullnad när OVA var närvarande, men hade ingen effekt på kontroll knä som bara injicerades med MBSA i musmodellen (Figur 4); reducerad benförlust i cellöverföring knä visualiseras genom den högupplösta mikro-CT-systemet (Figur 5).

    tp_upload / 54720 / 54720fig1.jpg "/>
    Figur 1:. Differentiering av Ag-specifik iPSC-tregs Murin iPSCs transducerades med en konstruktion: Midr-TCRα-2A-TCRβ-2A-foxp3 innehållande generna av OVA-specifika TCR och FOXP3. Genen-transducerade celler (DsRed +) samodlades på OP9-DL1-DL4-IA B-celler i närvaro av mFlt3L och mIL-7. (A) Morfologi av T ReGS celldifferentiering på dag 0, 7, 14 och 22. (B) Flödescytometrisk analys för proteinuttryck av iPSC-härledda celler på dag 28. CD3 + TCRVβ5 + celler gated såsom indikeras (R1) och analyserades med avseende på expression av CD4 och CD8, med CD25, CD127, CTLA- 4, och foxp3 visas för celler gated som CD4 + CD8 - celler (R2). (mörka linjer, skuggade områden anger isotypkontrollerna) klicka här för att se en larger version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2: Funktionella Analyser av I n Vitro Differentierade Ag-specifik tregs Murina IPSC-tregs stimulerades av splenocyter. (APC: er, T regs / APC = 1: 4) och pulserades med OVA 323-339 peptid. Intracellulär cytokinproduktion (TGF-β och IL-10) analyserades genom flödescytometri efter slussning på levande CD4 + CD25 + celler. (Mörka linjer, skuggade områden anger isotypkontrollerna) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3: Ag specifika iPSC-tregs infiltreras i knälederna. Ag-specifika IPSC-tregs ades adoptivt överförd in i C57BL / 6-möss. Strax efter artrit induktion (dagarna 7 - 14), var knäna avlägsnades och färgades för immunhistologi (skala stänger: 20 | j, m). Möss som erhöll OVA-specifika iPSC-tregs har ett stort antal TCRVβ5 + celler i knäna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4: adoptiv överföring av Ag-specifik iPSC-tregs ameliorates AIA hos möss Murina iPSCs transducerades med retrovirala konstrukt Midr, Midr-Foxp3, eller Midr-TCR-Foxp3 och samodlades på OP9-DL1 / DL4 /. IA B-celler. På dag 7, gense-transducerade celler (3 x 10 6 / mus) var endoptively överföras till C57BL / 6-möss som inducerats med AIA två veckor efter cellöverföringen. På dagen efter artrit induktion ades artrit svårighetsgrad övervakas genom mätning av knät diametern. (AC) Procent ökning av knäet diameter. Ökning i knä diameter beräknades baserat på förinsprutningsfas knä diameter för varje mus före injektion på dag 0. Artrit poäng utvärderades genom att undersöka båda knäna på en förblindad sätt; varje knä tilldelades en poäng (0: ingen synlig svullnad eller missfärgning; 1: synlig svullnad med eller utan missfärgning, 2: måttlig svullnad med missfärgning, 3: svår svullnad med missfärgning). I varje grupp, användes fem möss användes, och data är representativa för tre oberoende experiment. Data representeras som medelvärde ± SD. (D) Den genomsnittliga scoring på dag 7 för båda knäna från fem möss. Data representeras som medelvärde ± SD från tre oberoende försök (** p <0,01, *** p <0,001, två-vägs ANOVA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 5
    Figur 5:. Ag-specifik iPSC-tregs migrera till OVA Injicerad Knee och Minska Bone Loss IPSC-tregs ades adoptivt överförd in i C57BL / 6-möss. Inom 21 dagar post-artrit induktion mössen bedövades och benet arkitekturen runt mus knän avbildades av mikro CT-systemet. Möss som erhöll OT-II TCR / Foxp3 gen-transducerade murina IPSC-tregs uppvisar signifikant reduktion av benförlust i jämförelse med kontrollmöss som erhöll vektor-transducerade iPSCs. (A) De avsökningar genomfördes med en 2,2 mm lång, och avbildar fångades efter vidare bildbehandling (volym rendering och omvandling;Skala barer. 1 mm) (B) benvolym runt knäleden utvärderades med hjälp av tredimensionell rekonstruktion av mikro-CT-bilder, och benvolym i volymen av intresse beräknades (skala barer:. 1 mm) Klicka här för att en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I detta protokoll är ett kritiskt steg differentieringen av TCR / foxp3 genen-omvandlade iPSCs in vitro. In vitro Notch-signalering inducerar utveckling mot cell härstamning T. För att skilja iPSCs i CD4 + FOXP3 + tregs använde vi OP9-DL1 / DL4 / IA B-celler, som i hög grad express MHC II (IA B) molekyler. De flesta av de iPSCs differentiera till CD4 + celler. Men efter ytan TCR uttryck, många differentierade pre-T-celler förlorar förmågan att differentiera och dör så småningom. Som ett resultat, minskar cellantalet av IPSC-härledda funktionella tregs dramatiskt efter fyra veckors in vitro differentiering. För att undvika detta, kan tillsats av IL-2 förbättrar cellöverlevnad vid dessa tidpunkter. En alternativ metod för att driva mognad och överlevnad Ag-specifika pre-tregs är att överföra pre-tregs som har differentierade in vitro under en vecka i möss. Dessa pre-tregs kan samarbetantinue differentiera och mogna in vivo i ytterligare tre veckor. Med denna metod kan en funktionell Ag-specifik Treg population genereras från iPSCs, som är nTregs-liknande och har förmågan att undertrycka autoimmun artrit i musmodellen.

    Att förbättra effektiviteten av in vivo-utvecklingen av Ag-specifik iPSC-tregs, olika föreningar (t.ex. vitamin A-syra, gelectin) 13,14 eller suppressiva cytokiner (t.ex. TGF-β, IL-10) kan användas efter adoptiv överföring av pre-tregs. Förutom att öka cellöverlevnad, kan detta kombinerade metoden upprätthålla foxp3 uttryck 14,15 och höja kvaliteten på den Ag-specifika iPSC-tregs.

    Ett potentiellt problem som kan uppstå för in vivo Treg utveckling är övergripande immunsuppression, vilket resulterar i komplikationer under infektioner eller efterföljande viktminskning. Ett stort antal av Ag-specifik tregs utvecklas i vivo kan förvärra infektioner. I detta fall, ett självmordsgenen, den inducerbara kaspas 9 (ICasp9) 15,16, kan införlivas i TCR / foxp3 vektor. Detta tillvägagångssätt gör avlägsnandet av stamcells härledda tregs genom injektion av en bioinert liten molekyl dimerise medel (AP1903) att "stänga av" genereringen av stamcellshärledda tregs, som kommer att övervinna denna potentiella problem.

    En själv-Ag är ett typiskt protein som känns igen av immunsystemet hos värdar som lider av en individuell autoimmun sjukdom. Denna själv Ag är målet för immunsystemet, och korrelerade T-celler tas inte bort. För att generera själv Ag specifika tregs, är användningen av TCR överföring ett bra val. En själv-Ag (t.ex., värmechockprotein) specifik TCR kan transduceras in i mogna CD4 + CD25 + tregs från perifera mononukleära blodceller (PBMC), och denna metod har använts i kliniska prövningar. Alternativt, som desfaktorer beskrivs i detta protokoll, med hjälp av genen transduktion av själv Ag specifika TCR med foxp3 och stimulering med Notch-signalering, stamcellshärledda tregs kan vara själv Ag specifika tregs.

    Cellbaserade terapier för autoimmuna sjukdomar som använder modifierade tregs kan vara användbara 17. Även TCR överföring i T-celler har visat sig vara säker, är det möjligt, och tillämpas i kliniska prövningar, finns det fortfarande stora säkerhetsproblem på grund av autoimmunitet som orsakas av korsreaktivitet med frisk vävnad 18. Dessutom använder dagens metoder, genetiskt modifierad tregs har vanligtvis en kortvarigt kvarstående in vivo-19. Alternativt är en lovande källa för att utveckla ett stort antal monoklonala Ag-specifika tregs stamceller. Embryonala stamceller (ESC) har den bästa pluripotens och självförnyelse, men det är inte möjligt att få dem från patienter. Även lätt isoleras från perifert blod, hematopoetiska stamceller (HSCs) är multi-potenta stamceller och kan expanderas i cellkultur på samma sätt som ekonomiska och sociala råd 20. Nuvarande iPSC tekniken har avancerat till en mer effektiv generering av PSC från patienternas somatiska celler genom transduktion av olika transkriptionsfaktorer. Ett antal metodförbättringar har utvecklats under de senaste åren för att generera iPSCs av maximalt minska potentiella risker såsom immunogenicitet och tumörbildning. Jämfört med ekonomiska och sociala råd, iPSCs har identiska pluripotens och självförnyelse. Som ett resultat kan iPSC teknik erbjuder en fördel i att utveckla patient- och / eller sjukdomsspecifika PSC. Användningen av iPSCs att utveckla Ag-specifik tregs kan avancera inom cellbaserade terapier för autoimmuna sjukdomar 10,11.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Detta projekt har finansierats delvis under anslag från National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 och K18CA151798), American Diabetes Association (1-16-IBS-281), och Pennsylvania Department of Health (Tobaksavvecklingsfonder) till JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
    2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
    3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
    4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
    5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
    6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
    7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
    8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
    9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. , e3986 (2012).
    10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
    11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
    12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. , (2007).
    13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
    14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
    15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
    16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
    17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66 (2010).
    18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
    19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
    20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

    Tags

    Immunologi reglerande T-cell pluripotenta stamceller celldifferentiering antigeninducerad artrit mus autoimmuna sjukdomar
    Utveckling av stamcellshärledda antigen-specifika regulatoriska T-celler mot autoimmunitet
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P.,… More

    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter