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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54720
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University College of Medicine

Abstract

Las enfermedades autoinmunes se presentan debido a la pérdida de inmunológica auto-tolerancia. Las células T reguladoras (Tregs) son importantes mediadores de la auto-inmunológica tolerancia. Tregs representan aproximadamente el 5 - 10% de la subpoblación de células T CD4 maduro + en ratones y humanos, con aproximadamente 1 - 2% de esas células T reguladoras que circulan en la sangre periférica. células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden diferenciarse en células T reguladoras funcional, que tienen un potencial para ser utilizado para terapias basadas en células de enfermedades autoinmunes. A continuación, presentamos un método para desarrollar antígeno (Ag) Tregs específicos de células iPS a partir de (es decir, IPSC-Tregs). El método se basa en la incorporación del factor de transcripción FoxP3 y un receptor de células T Ag-específico (TCR) en iPSCs y luego diferenciar en células que expresan Notch OP9 estromales ligandos delta-como (DL) 1 y DL4. Después de la diferenciación in vitro, las células T reguladoras IPSC-expresan CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, y Ag-TCR específico y son capaces de responder a la estimulación Ag.Este método se ha aplicado con éxito a la terapia basada en células de la artritis autoinmune en un modelo murino. La transferencia adoptiva de estas Ag-específica IPSC-Tregs en la artritis inducida por Ag (AIA) ratones llevando los tiene la capacidad de reducir la inflamación articular y la inflamación y para prevenir la pérdida de hueso.

Protocol

Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el Colegio de la Universidad Estatal de Pensilvania Cuidado de Animales Medicina (IACUC protocolo # 45470) y se realiza de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care.

1. Stem Cell Culture

  1. Se incuba una placa de 10 cm con 10 ml de gelatina al 0,1% durante al menos 30 minutos a 37 ° C (incubadora) con el fin de cubrir la placa.
  2. Retire la gelatina de la cápsula y la placa 3 x 10 6 irradiadas SNL76 / 7 células e incubar durante un día a 37 ° C (incubadora) utilizando 10% de medio DMEM (10% de FBS y 1% penicilina estreptomicina).
  3. Retire el papel de la placa y iPSCs cultivo descongelado sobre el curso / 7 células capa de alimentación SNL76 uso de los medios de IPSC (medio DMEM que contiene 15% de suero fetal bovino, 0,1 mmol / L de los aminoácidos no esenciales, 1 mmol / L de L-glutamina, y 0,1 mmol / L β-mercaptoetanol) 9. El li células iPS de ratón-MEF-Ng-20D-17ne, que fue inducida a partir de fibroblastos de embriones de ratón por transfección viral retro de Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-Myc, se obtuvo del Dr. Shinya Yamanaka (Instituto de Ciencias Médicas de la frontera, la Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón).
  4. Cambiar el soporte en el día 3 por medio nuevo y observar colonias IPSC bajo el microscopio.
    NOTA: Estas colonias son grupos pequeños, brillantes o células redondas con una demarcación clara que muestra la expresión de GFP en un microscopio fluorescente.

2. La diferenciación in vitro de Ag-específicas IPSC-Treg

  1. Generar las construcciones a utilizar en la transducción retroviral por sub-clonación de los genes OT-II de TCR y FoxP3 en el plásmido MIDR 10 vinculado con la auto-escisión de péptido 2A para hacer que el constructo MIDR-TCRα-2A-TCR-2A-FoxP3.
  2. Realizar la transducción retroviral 9 de iPSCs utilizando células Plat E como la línea celular de empaquetamiento.
  3. En el día 0, células B de semillas OP9-DL1-DL4-IA adensidad mínima ta de 10 4 células / cm 2 mediante el uso de medios de comunicación OP-9 medios de comunicación (α-MEM que contiene 20% de FCS y 2,2 g / L de bicarbonato de sodio. placa 1 x 10 6 células por placa de 10 cm.
  4. El día 3, cuando las células B OP9-DL1-DL4-IA se convierten en un 80-90% de confluencia, retirar los medios y las semillas de 0,5 - 1 x 10 5 células iPS sobre OP9-DL1-DL4 - IA células B en la OP-9 medios de comunicación.
    NOTA: Esto establece el co-cultivo de células iPS en las células B OP9-DL1-DL4-IA y es considerado como el día 0 de la diferenciación 9.
  5. El día 5, extraiga el soporte de la placa de 10 cm por aspiración, se lavan las células con 10 ml de PBS 1x, y aspirar el PBS. Añadir 4 ml de 0.25% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 10 min. Añadir otros 8 ml de medio de IPSC a las células, volver a suspender ellos, y se centrifuga a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    1. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de medio de IPSC. Incubar estas células resuspendidas en un plato fresco 10 cmy volver a la incubadora durante 30 min.
      NOTA: Retire las células alimentadoras b OP9-DL1-DL4-IA y mantener las células iPS diferenciadores que flotan en los medios de comunicación. Mantener las células B OP9-DL1-DL4-IA continuamente para alcanzar el 80 - 90% de confluencia para su posterior co-cultivo.
    2. Después de 30 min, recoger las células flotantes, filtrado a través de un filtro de células de 70 m, y contar las células con un hemocitómetro.
  6. Seed 5 x 10 5 de iPSCs a un nuevo máximo 80 - 90% confluente de células B OP9-DL1-DL4-IA en los medios OP9. Suplemento los medios de comunicación con mFlt-3L a una concentración final de 5 ng / ml.
  7. En el día 8, recoger iPSCs diferenciadas parcialmente por lavado de la placa con los medios de comunicación de la propia cápsula, utilizando una pipeta de 10 ml. Utilice otros 5 ml de OP-9 medios de comunicación en el plato para lavar suavemente las células semi-adherentes por cuidado de pipeteado, contundente a fin de no romper la monocapa OP9 en la parte inferior del plato. Repetir el lavado con 10 ml de PBS para cosechar todos los semi-adherent diferenciación de las células.
    1. Combinar ambos lavados, centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente, volver a suspender en 10 ml de medio OP9 contiene mFlt-3L (5 ng / ml) y mIL-7 (1 ng / ml), y filtrar con un 70 filtro de células micras.
  8. Transferencia de las células en una placa de cultivo de 6 pocillos que contiene 80 - 90% confluente OP9-DL1-DL4-IA b células, como en el paso 1.1. La transferencia de células cosechadas a partir de una placa de 10 cm en un pocillo de la placa de 6 pocillos.
  9. En el día 10, el cambio medio de los medios de comunicación de las células a los medios OP9 fresco suplementado con mFlt-3L (5 ng / ml) y mIL-7 (1 ng / ml). Repita este paso cada dos días.
  10. Cada 4-6 días, dependiendo del crecimiento, re-semilla de las células iPS diferenciadores sobre las placas con una nueva capa de células B OP9-DL1-DL4-IA, tal como se describe en el paso 1.1.

3. Evaluación in vitro de diferenciación y maduración Treg

  1. Los cambios morfológicos de células iPS diferenciadores.
    1. Mesnitor el co-cultivo de células iPS con células B OP9-DL1-DL4-IA cotidiana mediante la observación de células vivas con un microscopio de campo claro convencional (20X). Durante el día 5, observar las colonias con características similares a mesodermo, tales como células aplanadas. En el día 8, observar pequeños grupos de células redondas, que representan células que se diferencian.
    2. Utilice el método de exclusión de azul de tripano para contar las células para detectar el número y el porcentaje de células vivas. Calcular la viabilidad celular como el número de células viables dividido por el número total de células dentro de las cuatro rejillas en el hemocitómetro. Si las células se ocupan de azul de tripano, considerarlos muertos o no viables. Registre el número de células vivas recolectadas a partir del cultivo.
  2. La citometría de flujo análisis de la diferenciación de células iPS.
    1. En los días 5, 7, 11, 15, 19, 21, y 28 de co-cultivo, eliminar las células con 0,25% de tripsina como en el paso 25.
    2. Antes de la tinción de la superficie con diferentes anticuerpos conjugados con fluorocromo, incubate 1 x 10 6 células con 100 l de Fc 2.4G2 bloqueador diluido en PBS (concentración final 10 mg / ml) a 4 ° C durante 20 min para evitar la unión del anticuerpo al receptor de Fc en la superficie celular.
    3. En los días 5, 7, 11, 15, 19, 21, y 28, usar 1 x 10 6 células por citometría de flujo con diferentes anticuerpos conjugados con fluorocromo para detectar los marcadores de superficie celular, incluyendo CD3, TCR, CD4, CD8, CD25, y CTLA4.
    4. A continuación del bloque Fc, lavar las células con 10 ml de PBS y mancha con diferentes anticuerpos conjugados con fluorocromo durante 20 minutos a 4 ° C, y luego realizar el análisis de citometría de flujo con el 15-color de citómetro de flujo. Utilice 0,200 g de anticuerpo por 10 6 células diluidas en 100 l de PBS.
    5. En el día 28, analizar las células por citometría de flujo 11 y la puerta a + células CD4 CD8 + utilizando CD4 y CD8 tinción conjugado a un fluorocromo; analizar para la expresión de TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, Y FoxP3 (Figura 1). Para la tinción de FoxP3, fijar las células y permealize ellos y luego realizar la tinción de anticuerpos 11.
  3. En la estimulación antigénica in vitro de iPSCs.
    1. En el día 28 de co-cultivo, cosecha IPSC-Treg a partir de cultivos mediante la recopilación de las células flotantes. Tripsinizar el resto de las células con 0,25% de tripsina (como en el paso 2.5) y volver a suspender las células en 8 ml de medio de IPSC. Se centrifuga durante 5 min a 400 x g a temperatura ambiente, aspirar los medios de comunicación, y de nuevo volver a suspender las células en 10 ml de medio.
      1. Se incuban las células se resuspendieron en una nueva placa de 10 cm a 37 ° C durante 30 min y recoger las células flotantes. Se lavan las células con PBS frío.
    2. Incubar 3 x 10 6 esplenocitos a partir de bazos de C57BL / 6 Rag1 - / - ratones con 5 mM péptido de ovoalbúmina en 200 l de los medios de comunicación (OVA 323-339) a 4 ° C durante 30 min en una placa de 96 pocillos 11.
    3. Mezclar las células T reguladoras con OVA 323-339 esplenocitos en una proporción de 1: 4 (utilizan 0,75 x 10 6 células T reguladoras). Incubar a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 40 h. En la última de 4 horas, añadir 4 l de diluirse Brefeldina A en la cultura (1.000 x concentración real, se diluyó en medio de cultivo 1x).
    4. Células de la cosecha con 0,25% de tripsina (como en el paso 2.5), lavar con 10% NaN 3 y una solución de 0,5 M EDTA (tampón FACS), el bloque con 100 l de diluido (concentración final 10 mg / ml) Fc 2.4G2 bloqueador, y las manchas para los marcadores de superficie, CD4, CD8, TCRVα2, y TCRVβ5 como en los pasos 3.2.3-3.2.4.
    5. Fijar las células con una solución de paraformaldehído al 4% en PBS y permeabilizar con 100 l de tampón de permeabilización 1x después de la tinción de la superficie celular. ¡Atención! El paraformaldehído es alergénico, carcinogénico y toxicidad.
    6. Teñir las células con fluorocromo conjugado con TGF-β y IL-10 durante 20 min en la oscuridad. Utilice 0,200 g de anticuerpo / 10 6 células diluted en 100 l de PBS. Detectar la producción intracelular de TGF-β y IL-10 con el 15-color de citómetro de flujo (Figura 2).
    7. Se lavan las células tres veces con tampón FACS frío antes del análisis de citometría de flujo 11.
  4. Persistencia in vivo de Ag-específica IPSC-Treg.
    1. Después de 8 días de co-cultivo de células B OP9-DL1-DL4-IA, transferir IPSC derivados de pre-células T reguladoras (Thy 1.2) como en el paso 3.3.1 en Tus 1.1 congenic ratones (4-6 semanas de edad) a través de una inyección en la vena de la cola sin anestesia. Antes de realizar la inyección en la vena de la cola, dilatar la vena de la cola usando una lámpara de infrarrojos para 5 min. Después de la dilatación de la vena de la cola, colocar el ratón en un retenedor y la transferencia adoptiva 3 x 10 6 células se volvieron a suspender en 200 l de PBS mediante la inyección a través de la vena de la cola.
    2. Seis semanas después de la transferencia de Treg, la eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical. Asegúrese de que el mice no está respirando. Abra la cavidad peritoneal mediante la reducción de la piel exterior del peritoneo usando tijeras y pinzas y suavemente tirando de él hacia atrás para exponer la piel interior que recubre la cavidad peritoneal. Aislar el bazo y los ganglios linfáticos periféricos de Thy 1.1 congenic ratones inyectados.
    3. Recoger las células de los ganglios linfáticos y bazo utilizando rotura mecánica para producir una única suspensión celular. Se incuban las células con 5 ml de tampón de lisis ACK de 5 min a TA para lisar las células rojas de la sangre. Recoger y lavar los esplenocitos o linfocitos restantes con 10 ml de tampón FACS frío.
    4. Tras el lavado, el tratamiento de células con el bloqueador de 2.4G2 Fc a 4 ° C durante 20 min como en el paso 3.2.2 y mancha con 100 l de anticuerpos anti-Thy 1.2 conjugados con fluorocromo diluidos.
    5. Lavar las células con 10 ml de tampón de FACS y proceder a análisis de citometría de flujo 11.

4. En Vivo Maduración y represión de la artritis autoinmune

  • Generar las construcciones como en el paso 2.1.
  • Realizar la transducción retroviral 9 como en el paso 2.2.
  • En la diferenciación in vivo y la inducción de artritis en ratones.
    1. Diferenciar OT-II TCR / CMPI FoxP3 transducidas (OT-II-FoxP3 / iPSCs), iPSCs FoxP3 transducidas, y DsRed iPSCs transducidas en las células B del estroma OP9-DL1-DL4-IA en la presencia de citoquinas mFlt-3L y mIL-7 durante 8 días como se describe en los pasos 2.1 - 2.6.
    2. Trypisinize los tres tipos de células de la placa de 10 cm y células de cada placa de 10 cm volver a suspender en 10 ml de medio fresco. Añadir a las células a una placa fresca 10 cm y volver al incubador durante 30 min. Después de 30 min, recoger las células flotantes.
    3. Pasar las células a través de un filtro de células de 70 micras para eliminar grupos de células y contar con un hemocitómetro. Ajustar las células a una concentración de 1,5 x 10 7 células / ml en PBS frío y filtrar de nuevo si es necesario. Mantener las células en hielo hasta que la transferencia adoptiva de células en ratones. Inyectar 200 l de la suspensión celular (3 x 10 6 células) en tres diferentes grupos de 4 a 6 semanas de edad, ratones C57BL / 6 hembra a través de la vena de la cola como se describe en 3.4.1
    4. En el día 10 después de la transferencia de células, inyectar ratones con 100 mg de mBSA emulsionado en adyuvante completo de Freund en la base de la cola mediante el uso de una jeringa de 1 ml.
    5. En el día 17, anestesiar a los ratones utilizando un vaporizador de isoflurano (de acuerdo con las directrices del IACUC). Utilizar 4-5% de isoflurano para la inducción y 1 - 2% para el mantenimiento. Inducir artritis mediante inyección intraarticular de 20 mg mBSA en 10 l de PBS en la rodilla izquierda y conjunta de 20 mg y 100 mg mBSA toda OVA en 10 l de PBS en la articulación de la rodilla derecha. Alimentos y un gelpack se pueden colocar en el suelo después de ropa de cama de la artritis se ha desarrollado. Los ratones se sometieron a eutanasia: la condición corporal (BCS) de 2/5 o moribundos, caquexia severa y / o decúbito persistente (un período de 24 horas), y la puntuación de la gravedad 4. En la puntuación4, eritema y tumefacción severa abarcan el tobillo, el pie y los dígitos, o anquilosis de la extremidad.
  • Caracterización de las células iPS OT-II TCR / transducidas Foxp3.
    1. Utilizar un microscopio de fluorescencia (20X) para visualizar las células DsRed + GFP + en vivo no fijadas.
    2. Examinar la integración y expresión génica tanto por Western blot y citometría de flujo 11.
  • el desarrollo y la maduración Treg.
    1. En las semanas 2, 4 y 6 después de la transferencia de células, la eutanasia a los ratones. Para la eutanasia, en cada jaula usar 1 - 2 litros de CO 2 en la primera etapa. Una vez que el animal ha perdido el conocimiento, aumentar la velocidad de flujo de CO2 en un 4 - 5 L / min. La eutanasia a los ratones por inhalación de CO2. Aislar el bazo y drenar los ganglios linfáticos cortando la piel exterior del peritoneo usando tijeras y pinzas y suavemente tirando de él hacia atrás para exponer la piel interior que recubre la cavidad peritoneal.
    2. Recoger la suspensión de células individuales from el bazo y los ganglios linfáticos por avería mecánica usando un filtro de células y una jeringa de 1 ml en 1% de medios IPSC. Centrifugar el tubo cónico que contiene los medios de comunicación a 400 g durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en 5 ml de tampón de lisis ACK para lisar las células rojas de la sangre. Re-centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular y se lavan los esplenocitos o linfocitos restantes con tampón FACS frío. Siga los pasos 3.4.4 - 3.4.5 y proceder a fluir el análisis de citometría.
  • tinción intracelular.
    1. En el día 50 después de la estimulación, aislar el bazo y drenar los ganglios linfáticos de los ratones (como en el paso 4.5.1) después de la eutanasia mediante inhalación de CO2, seguido por dislocación cervical.
    2. Recoger la suspensión de células individuales a partir del bazo y los ganglios linfáticos por avería mecánica usando un filtro de células y una jeringa de 1 ml. Incubar los esplenocitos a temperatura ambiente durante 5 min con 5 ml de tampón de lisis ACK para lisar las células rojas de la sangre. Recoger y lavar los restantes splenocytes o linfocitos con tampón FACS frío. Siga los pasos 3.2.3 - 3.2.4, pero se tiñen con los marcadores de superficie CD4, CD8, CD25, y TCRVβ5.
    3. Procede a fijar las células para la tinción intracelular como se describe en 3.3.5 - 3.3.7 y analizar la producción intracelular de citoquinas (TGF-β e IL-10) de células T reguladoras derivadas de IPSC y la puerta a las células en vivo CD4 + CD25 +.
  • La infiltración de células T reguladoras Ag-específicas en las rodillas y la supresión de la artritis.
    1. Siguiendo los pasos (4.3 - 4.3.6) en los días 7 - 14 de inducción después de la artritis, la eutanasia a los ratones por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical (de acuerdo con las directrices del IACUC). Eliminar el vello de las rodillas con una maquinilla eléctrica y extirpar las rodillas por el procedimiento quirúrgico.
    2. Quitar la piel de las piernas al hacer una incisión en la pata trasera con unas tijeras de punta roma y cortar la piel a través del muslo y hasta el tobillo. Con cuidado, la piel sobre la pierna y el pie para exponer el músculo. retirarel músculo de la pierna con cuidado, sin dañar la articulación de la rodilla.
      1. Cortar la pata trasera justo por encima de la articulación de la pelvis / cadera y cortar la tibia usando las tijeras de disección afilados.
    3. Fijar las rodillas en formalina al 4% durante 48 horas. Decalcify las rodillas mediante el uso de ácido fórmico 2,5 M; enjuagar tres veces en xileno durante 3 min, enjuague dos veces en etanol al 100%, enjuague dos veces en etanol al 95%, enjuague dos veces en agua desionizada durante 2 min, y descalcificar en EDTA 1 mM. Tratar a una temperatura sub-ebullición (90 ° C) durante 20 min.
    4. Enfriar el tejido fijado durante 30 min. Enjuagarlo con 1x PBS durante 4 min y incrustarla en parafina. Deshidratar los tejidos a través de una serie de baños de etanol para desplazar el agua y, a continuación, infiltrarse con cera. Luego integrar los tejidos infiltrados en bloques de cera. Realizar tanto de corte vertical y horizontal para la tinción. Preparar 4 micras secciones con un micrótomo de deslizamiento.
    5. Realizar la tinción de inmunofluorescencia de las secciones después de procedimientos estándar de deparaffización y la rehidratación utilizando xileno y etanol 12.
    6. Bloquear la actividad peroxidasa endógena mediante la inmersión de la corredera en una cantidad suficiente de solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 3 min después de la recuperación de Ag. diapositivas de bloque para la unión no específica en el 3% de BSA en PBS a temperatura ambiente en una cámara húmeda durante 60 minutos.
    7. secciones se tiñen con 200 l de anticuerpo conjugado a un fluorocromo TCRVβ5 diluidos 1: 100 en la solución de bloqueo. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en un 75 - 100% cámara humidificada, y se lava 5 veces en 1X PBS durante 5 min.
    8. CONTRATINCIÓN los portaobjetos para tinción nuclear con un reactivo que contiene DAPI antifade. Añadir aproximadamente 300 l de la solución de tinción DAPI diluido (300 nM en 1X PBS) al cubreobjetos, asegurándose de que toda cubreobjetos está cubierto. Almacenar los portaobjetos en la oscuridad a 4 ° C hasta su análisis bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 3).
  • ensayo de supresión de la artritis
    1. Medir la hinchazón de las rodillas de los ratones antes de la inducción de la artritis mediante el uso de un calibrador de línea de calibre para establecer una línea de base.
    2. Siga los pasos (4.3 - 4.3.6) para la inducción de la artritis y la transferencia de Treg. Medir las rodillas de ratón con una línea de vía de transferencia de pinza post-Treg.
    3. Calcular el porcentaje de aumento en el diámetro de la rodilla: por ciento de aumento = (diámetro de la rodilla en el día 1 - diámetro de la rodilla en el día 0) / diámetro de la rodilla en el día 0.
  • La medición de la destrucción de las articulaciones y la infiltración de células inflamatorias en las rodillas por la histología (Figura 4).
    1. En el día 7 después de la inducción-artritis, la eutanasia a los ratones como se describió anteriormente y extirpar las rodillas por el procedimiento quirúrgico. Vea el paso 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Fijar las rodillas en formalina al 4%, decalcify en EDTA, e incrustar en parafina. Vea el paso 4.7.3
    3. Retire las dos rodillas, fijar en formol al 10%, y se calcifican en Formical-4. Incrustar los tejidos en parafina, sección a 4 micras, y la mancha con hematoxyly eosina (H & E) o safranina O tinción (como en el paso 4.7.7) y observar con un microscopio.
    4. Utilice tinción H & E para evaluar la erosión del hueso con un sistema de puntuación semicuantitativo (0: no hay erosiones; 4: erosiones extendidas y destrucción del hueso). Utilice safranina O tinción para evaluar la pérdida de proteoglicanos y la puntuación con un sistema de puntuación semicuantitativo (0: no pérdida de proteoglicanos; 3: pérdida completa de la tinción de los proteoglicanos).
      1. Utilice un sistema de puntuación semicuantitativo para anotar la infiltración de células inflamatorias en portaobjetos H & E manchadas (0: sin infiltración celular; 4: abundado infiltración de células). Evaluar las puntuaciones mediante el examen de las dos rodillas en una forma ciega.

    • 5. La medición de la pérdida ósea en las rodillas con el sistema computado-micro-tomografía de alta resolución (micro-CT)

    1. En el día 10 después de la inducción-artritis, anestesiar a los ratones con isoflurano al 2% y prepararse para la imagen.
    2. posición del micrófonoe con las rodillas hacia arriba en la cámara.
    3. Utilice un sistema de micro-CT de alta resolución para adquirir imágenes in vivo de la arquitectura de hueso alrededor de las rodillas de los ratones.
    4. Realizar análisis de micro-CT con una longitud de 2,2 mm, incluyendo las articulaciones de rodilla de ratón con los siguientes parámetros: 10,5 micras de tamaño de voxel a 55 kv, 145 mu 200 ms de tiempo de integración, 211 imágenes.
    5. Importación de imágenes de micro-CT y captura imágenes planas frontal tras su posterior procesamiento de imágenes (representación de volumen y transformación) (Figura 5).

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    Representative Results

    Como se muestra aquí, en el día 28, Ag-específica Tregs expresa sustancialmente CD3 y Ag-específica TCR, dos marcadores de células T. La población CD3 + + TCRVβ5 expresa CD4. La mayoría de las células CD3 + CD4 + TCRVβ5 + también expresan CD25, CD127, y CTLA-4, que se expresan típicamente en niveles elevados en origen natural, reglas T (nTregs) y en células T que expresan FoxP3 ectópica. FoxP3 expresión en las células derivadas de IPSC persistió incluso después de largo plazo en la estimulación in vitro con el ligando de Notch, tal como se detecta mediante tinción intracelular se analizaron por citometría de flujo (Figura 1). Además, el Ag-específica IPSC-Tregs produce citoquinas supresoras, tales como TGF-β y IL-10, cuando se estimulan in vitro con esplenocitos Ag-pulsados (Figura 2), indicando la IPSC-Tregs tenía potenciales actividades supresoras. Microscopía de fluorescencia reveló que más FoxP3 + células estaban presentes en la OVA tratadas que las rodillas tratadas con PBS; no hay células FoxP3 + existentes en las rodillas, en los ratones que recibieron las células iPS vector transducidas DsRed +. Muchos más CD4 + células FoxP3 + TCRVβ5 + se presentan en las rodillas de los ratones que recibieron iPSCs transducidas con el MIDR-TCR-FoxP3 que el MIDR-FoxP3 (Figura 3). Estas observaciones sugieren que Ag-específicas IPSC-Tregs migran a la rodilla AIA después de la transferencia adoptiva en ratones receptores. Las células derivadas de IPSC transferidos disminuido sustancialmente la rodilla inflamatoria hinchazón cuando OVA estuvo presente, pero no tuvo efecto en la rodilla de control que sólo se inyectó con mBSA en el modelo murino (Figura 4); pérdida de masa ósea reducida en la rodilla de transferencia de células se visualizaron por el sistema de micro-CT de alta resolución (Figura 5).

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    Figura 1:. La diferenciación de Ag-específica IPSC-Treg murino iPSCs fueron transducidas con un constructo: MIDR-TCRα-2A-TCR-2A-FoxP3 que contiene los genes de TCR y FoxP3 específica de OVA. Las células de genes transducidos (DsRed +) fueron co-cultivadas en células B OP9-DL1-DL4-IA en presencia de mFlt3L y mIL-7. (A) Morfología de T regs diferenciación de las células en días 0, 7, 14 y 22. análisis de citometría de (B) de flujo para la expresión de proteínas de las células derivadas de iPSC en día 28. CD3 + TCRVβ5 + células fueron cerrada como se indica (R1) y se analizaron para la expresión de CD4 y CD8, con CD25, CD127, CTLA- 4, y FoxP3 muestra de células cerradas como CD4 + CD8 - células (R2). (líneas oscuras; las áreas sombreadas indican los controles de isotipo) Haga clic aquí para ver una larger versión de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2: Análisis funcional de células T reguladoras E n Vitro diferenciada Ag-específica murinos IPSC-Tregs fueron estimulados por los esplenocitos.;: Y pulsadas con OVA 323-339 péptido (APC, reglas T / APC = 1 4). La producción intracelular de citoquinas (TGF-β e IL-10) se analizó por citometría de flujo después active en vivo CD4 + CD25 + células. (Líneas oscuras; las áreas sombreadas indican los controles de isotipo) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figura 3
    Figura 3: Una-g-Treg específicas IPSC se infiltran en las articulaciones de la rodilla. Ag-específicas IPSC-Treg se transfirieron de forma adoptiva en ratones C57BL / 6 ratones. Poco después de la inducción de artritis (día 7 - 14), las rodillas se retiraron y se tiñeron para inmunohistología (barras de escala: 20 micras). Los ratones que recibieron OVA específica IPSC-Treg tienen un gran número de células TCRVβ5 + en las rodillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    Figura 4: la transferencia adoptiva de Ag-específica IPSC-Tregs aminora AIA en ratones iPSCs murinos fueron transducidas con el constructo retroviral MIDR, MIDR-FoxP3, o MIDR-TCR-FoxP3 y se co-cultivaron en el OP9-DL1 / DL4 /. Las células B IA. En el día 7, las células de genes transducidos (3 × 10 6 / ratón) eran unadoptively transferido a 6 ratones hembras C57BL / que fueron inducidos con AIA dos semanas después de la transferencia de células. En el día después de la inducción de la artritis, de la gravedad de la artritis se controló por medición del diámetro de la rodilla. Porcentaje de aumento (AC) de diámetro de la rodilla. Aumento en el diámetro de la rodilla se calculó basándose en el diámetro de la rodilla antes de la inyección para cada ratón antes de la inyección en el día 0. puntuación de la artritis se evaluó mediante el examen de ambas rodillas en una forma ciega; cada rodilla se le asignó una puntuación (0: no visible hinchazón o decoloración; 1: hinchazón visible con o sin cambio de color; 2: moderada hinchazón con cambio de color; 3: severa hinchazón con decoloración). En cada grupo, se utilizaron cinco ratones, y los datos son representativos de tres experimentos independientes. Los datos se representan como la media ± SD. (D) La media anotando el día 7 de ambas rodillas de cinco ratones. Los datos se representan como la media ± SD de tres experimentos independientes (** p <0,01, *** p <0,001, ANOVA de dos vías). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 5
    Figura 5:. Ag-específica IPSC-Treg migrar a la OVA inyectado rodilla y reducir la pérdida de hueso IPSC-Treg se transfirieron de forma adoptiva en ratones C57BL / 6 ratones. Dentro de los 21 días posteriores a la inducción de la artritis, los ratones fueron anestesiados y la arquitectura del hueso alrededor de las rodillas ratón fue fotografiada por el sistema de micro-CT. Los ratones que recibieron OT-II TCR / FoxP3 gen transducidas murino IPSC-Tregs exhiben reducción significativa de la pérdida ósea en comparación con los ratones control que recibieron iPSCs vector transducidas. (A) Las exploraciones se realizaron con una longitud 2,2 mm, y las imágenes se capturaron después de además de procesamiento de imágenes (representación de volumen y la transformación;barras de escala:. 1 mm) (B) el volumen de hueso alrededor de la articulación de la rodilla se evaluó utilizando la reconstrucción tridimensional de imágenes de micro-CT, y se calculó el volumen de hueso en el interior del volumen de interés (barra de escala:. 1 mm) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    En este protocolo, un paso crítico es la diferenciación in vitro de TCR / FoxP3 iPSCs de genes transducidos. In vitro de señalización Notch induce el desarrollo hacia el linaje de células T. Para diferenciar células iPS en CD4 + FoxP3 + células T reguladoras, hemos utilizado las células B OP9-DL1 / DL4 / IA, que MHC II (IA b) moléculas altamente exprés. La mayoría de las iPSCs se diferencian en células CD4 +. Sin embargo, después de la expresión del TCR de superficie, muchas células pre-T diferenciadas pierden la capacidad de diferenciarse y finalmente mueren. Como resultado, el número de células de las células T reguladoras funcionales derivados de IPSC reduce drásticamente después de cuatro semanas de diferenciación in vitro. Para evitar esto, la adición de IL-2 puede mejorar la supervivencia de las células en los puntos de tiempo. Un método alternativo para conducir la maduración y la supervivencia de Ag-específicas pre-Tregs es transferir los pre-Tregs que han diferenciado in vitro para una semana en ratones. Estos pre-Treg puede continue diferenciación y maduración in vivo durante otras tres semanas. Usando este método, una población Treg Ag-específica funcional se puede generar a partir de iPSCs, que son nTregs-como y tienen la capacidad de suprimir la artritis autoinmune en el modelo murino.

    Para mejorar la eficacia de desarrollo in vivo de Ag-específica IPSC-Tregs, diferentes compuestos (por ejemplo, ácido retinoico, gelectin) 13,14 o supresores de citoquinas (por ejemplo, TGF-β, IL-10) se pueden utilizar después de la transferencia adoptiva de la pre-Tregs. Además de aumentar la supervivencia celular, este enfoque combinado puede mantener la expresión FoxP3 14,15 y mejorar la calidad de la Ag-específica IPSC-Tregs.

    Un problema potencial que pudiera surgir durante el desarrollo in vivo de Treg es la inmunosupresión en general, lo que resulta en complicaciones durante infecciones o posterior pérdida de peso. Un gran número de Ag-específica Tregs en desarrollo en vivo puede empeorar las infecciones. En este caso, un gen suicida, la caspasa 9 inducible (ICasp9) 15,16, se puede incorporar en el vector de TCR / FoxP3. Este enfoque permite la eliminación de las células T reguladoras derivadas de células madre mediante la inyección de una pequeña molécula bioinerte dimerizar agente (AP1903) a "apagar" la generación de células T reguladoras derivadas de células madre, que superar este problema potencial.

    Un auto-Ag es una proteína típica reconocido por el sistema inmune de los ejércitos que sufren de un trastorno autoinmune individual. Esta auto-Ag es el objetivo del sistema inmune, y no se eliminan las células T correlacionados. Para generar auto-Ag Tregs específicos, el uso de TCR transducción es una buena opción. Un auto-Ag (por ejemplo, proteína de choque térmico) específico TCR puede transduce en madura CD4 + CD25 + células T reguladoras de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), y este enfoque ha sido utilizada en ensayos clínicos. Alternativamente, como se described en este protocolo, utilizando la transducción de genes de la auto-Ag TCR específico con FoxP3 y la estimulación con la señalización de Notch, madre derivadas de células Treg puede ser auto-Ag células T reguladoras específicas.

    Terapias basadas en células para enfermedades autoinmunes que utilizan Tregs ingeniería pueden ser útiles 17. Aunque TCR transducción en las células T ha demostrado ser seguro, factible y aplicable en los ensayos clínicos, todavía existen importantes problemas de seguridad debido a la autoinmunidad causada por la reactividad cruzada con los tejidos sanos 18. Además, usando los métodos actuales, Tregs modificado genéticamente por lo general tienen una persistencia a corto plazo in vivo 19. Por otra parte, una fuente prometedora para el desarrollo de un gran número de monoclonales específicos de Ag-células T reguladoras son las células madre. Las células madre embrionarias (CES) tienen la mejor pluripotencia y auto-renovación, pero no es posible obtenerlos de los pacientes. Aunque fácilmente aislado de la sangre periférica, células madre hematopoyéticas (HSC) son multi-Las células madre potentes y pueden expandirse en cultivo de células de manera similar a los CES 20. IPSC tecnología actual ha avanzado a una generación más eficiente del PSC partir de células somáticas de los pacientes mediante transducción de diferentes factores de transcripción. Una serie de mejoras metodológicas se han desarrollado en los últimos años para generar células iPS, reduciendo al máximo los riesgos potenciales, como la inmunogenicidad y la tumorigenicidad. En comparación con las CME, iPSCs tienen pluripotencia idénticos y auto-renovación. Como resultado de ello, la tecnología de IPSC puede proporcionar una ventaja en el desarrollo de PSC en el paciente y / o específicos de la enfermedad. El uso de células iPS para desarrollar Ag-específica Tregs puede avanzar en el campo de las terapias basadas en células para enfermedades autoinmunes 10,11.

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    Acknowledgments

    Este proyecto fue financiado, en parte, en virtud de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01AI121180, R21AI109239 y K18CA151798), la Asociación Americana de la Diabetes (1-16-IBS-281), y el Departamento de Salud de Pensilvania (Fondos del Acuerdo de Tabaco) a JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
    2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
    3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
    4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
    5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
    6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
    7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
    8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
    9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. , e3986 (2012).
    10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
    11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
    12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. , (2007).
    13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
    14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
    15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
    16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
    17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66 (2010).
    18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
    19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
    20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

    Tags

    Inmunología No. 117 de células T reguladoras células madre pluripotentes la diferenciación celular la artritis inducida por antígenos ratón enfermedades autoinmunes
    Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad
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    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P.,… More

    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

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