Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utvikling av stamcelle-avledet Antigen-spesifikke Regulatoriske T-cellene mot autoimmunitet

Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54720
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University College of Medicine

Abstract

Autoimmune sykdommer oppstår på grunn av tap av immunologisk selvtoleranse. Regulatoriske T-celler (tregs) er viktige formidlere av immunologisk selvtoleranse. Tregs utgjør ca. 5 - 10% av det fullt utviklede CD4 + T-celle-subpopulasjon i mus og mennesker, med omtrent 1 - 2% av disse Tregs som sirkulerer i det perifere blod. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) kan differensieres til funksjonell Tregs, som har et potensial til å bli brukt for cellebaserte terapier av autoimmune sykdommer. Her presenterer vi en metode for å utvikle antigen (Ag)-spesifikke Tregs fra iPSCs (dvs. IPSC-tregs). Metoden er basert på inkorporering av transkripsjonsfaktoren foxp3 og en Ag-spesifikke T-celle-reseptor (TCR) inn iPSCs og deretter differensiere på OP9 stromale celler som uttrykker Notch ligander delta-lignende (DL) og en DL4. Etter in vitro differensiering, de IPSC-Tregs uttrykke CD4, CD8, CD3, CD25, foxp3, og Ag-spesifikke TCR og er i stand til å svare på Ag stimulering.Denne fremgangsmåten har blitt brukt til cellebasert behandling av autoimmun artritt i en murin modell. Adoptiv overføring av disse Ag-spesifikke IPSC-Tregs inn i Ag-indusert artritt (AIA) -holdige mus har evnen til å redusere leddbetennelse og hevelse og for å hindre bentap.

Protocol

Alle dyreforsøk er godkjent av Pennsylvania State University College of Medicine Animal Care Committee (IACUC protokollen # 45470) og gjennomføres i samsvar med retningslinjene fra Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care.

1. Stem Cell Culture

  1. Inkuber en 10 cm skål med 10 ml 0,1% gelatin i minst 30 minutter ved 37 ° C (inkubator) for å belegge plate.
  2. Fjern gelatin fra fatet og platen 3 x 10 6 bestrålt SNL76 / 7-celler og inkuberes i en dag ved 37 ° C (inkubator) ved anvendelse av 10% DMEM-medium (10% FBS og 1% penicillin streptomycin).
  3. Fjern materialet fra platen og kultur tint iPSCs over SNL76 / 7 cellemater laget ved hjelp IPSC media (DMEM media som inneholder 15% føtalt kalveserum, 0,1 mmol / l ikke-essensielle aminosyrer, 1 mmol / L L-glutamin, og 0,1 mmol / L β-merkaptoetanol) 9. Den mus iPS-MEF-Ng-20D-17 celle line, som ble indusert fra mus embryonale fibroblaster av retro viral transfeksjon av Oct3 / 4, Sox2, Klf4, og c-myc, ble hentet fra Dr. Shinya Yamanaka (Institutt for Frontier medisinske basalfag, Universitetet i Kyoto, Kyoto, Japan).
  4. Endre media på dag 3 med friske media og observere IPSC kolonier under mikroskopet.
    MERK: Disse koloniene er små, blanke klynger eller runde celler med en klar avgrensning viser GFP uttrykk under et fluorescerende mikroskop.

2. In Vitro Differensiering av Ag-spesifikke IPSC-Tregs

  1. Generer konstruksjonene som skal brukes i retroviral transduksjon av sub-kloning av OT-II TCR gener og foxp3 inn i MiDR plasmidet 10 forbundet med selv-spaltning av peptidet 2A for å gjøre den MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-foxp3 konstruksjon.
  2. Utføre retroviral transduksjon 9 av iPSCs ved hjelp Plat E-celler som pakkecellelinje.
  3. På dag 0, frø OP9-DL1-DL4-IA B-celler enta minimumstettheten i 10 4 celler / cm 2 ved hjelp av OP-9 medium (α-MEM medium inneholdende 20% FCS og 2,2 g / l natriumbikarbonat. Plate 1 x 10 6 celler pr 10 cm plate.
  4. På dag 3, når OP9-DL1-DL4-IA b celler blir 80-90% konfluent, tar ut mediene og frø 0,5 - 1 x 10 5 iPSCs løpet OP9-DL1-DL4 - IA B-celler i OP-9 medier.
    MERK: Dette etablerer co-kulturen i iPSCs på OP9-DL1-DL4-IA B-celler og regnes for å være dag 0 av differensiering 9.
  5. På dag 5, fjerne media fra 10 cm fatet ved aspirasjon, vaske cellene med 10 ml 1x PBS og aspirer PBS. Tilsett 4 ml 0,25% trypsin og inkuber ved 37 ° C i 10 min. Legge til ytterligere 8 ml IPSC mediet til cellene, re-suspendere dem, og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    1. Aspirer supernatanten og re-suspendere cellene i 10 ml IPSC medier. Inkuber disse re-suspendert celler på en frisk 10 cm tallerkenog tilbake til inkubatoren i 30 minutter.
      MERK: Fjern OP9-DL1-DL4-IA b feeder-celler og holde de unike iPSCs flytende i media. Opprettholde OP9-DL1-DL4-IA B-celler kontinuerlig for å oppnå 80-90% konfluens for ytterligere co-kultur.
    2. Etter 30 min, samle de flytende celler, filtrere dem gjennom en 70 mikrometer celle sil, og telle celler med en hemocytometer.
  6. Seed 5 x 10 5 av iPSCs til en frisk 80-90% konfluent av OP9-DL1-DL4-IA B-celler i OP9 media. Supplere media med mFlt-3L ved en sluttkonsentrasjon på 5 ng / ml.
  7. På dag 8, samle delvis differensiert iPSCs ved å vaske platen med media fra selve parabolen ved hjelp av en 10 ml pipette. Bruk en annen 5 ml OP-9 media i fatet å forsiktig vaske av semi-tilhenger celler ved forsiktig, kraftig pipettering for ikke å bryte OP9 monolaget på bunnen av fatet. Gjenta vaskingen med 10 ml PBS for å høste alle semi-adHerent differensierende celler.
    1. Kombinere begge vasker, sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur, re-suspendere i 10 ml OP9 media inneholdende mFlt-3L (5 ng / ml) og mIL-7 (1 ng / ml) og filtrer gjennom en 70 mikrometer celle sil.
  8. Overfør cellene inn i en 6-brønners kulturplate inneholdende 80 - 90% konfluente OP9-DL1-DL4-IA b-celler, som i trinn 1.1. Overfør cellene høstet fra en 10 cm plate inn i en brønn på 6-brønners plate.
  9. På dag 10, skifte halvparten av media fra cellene til frisk OP9 media supplert med mFlt-3L (5 ng / ml) og MIL-7 (1 ng / ml). Gjenta dette trinnet hver dag.
  10. Hver 4-6 dager, avhengig av vekst, re-seed de unike iPSCs på plater med et friskt lag med OP9-DL1-DL4-IA B-celler, som beskrevet i trinn 1.1.

3. Evaluering av In Vitro Treg Differensiering og Modning

  1. Morfologiske endringer av differensierende iPSCs.
    1. Momonitoren co-kulturen i iPSCs med OP9-DL1-DL4-IA B-celler hver dag ved å observere levende celler under en konvensjonell lysfelt mikroskop (20X). Etter dag 5, observere kolonier med mesoderm-lignende egenskaper, for eksempel flate celler. Etter dag 8, observere små, runde klynger av celler, som representerer differensierende celler.
    2. Bruk trypanblått Utelukkelse metode for å telle cellene til å oppdage antall og prosentandel av levende celler. Beregn cellelevedyktighet som antall levedyktige celler dividert med det totale antall celler i løpet av de fire gittere på hemocytometer. Hvis cellene tar opp trypanblått, vurdere dem døde eller ikke levedyktige. Registrere antall levende celler høstet fra kulturen.
  2. Flowcytometri analyse av differensierende iPSCs.
    1. På dagene 5, 7, 11, 15, 19, 21 og 28 av ko-kultur, fjernes cellene med 0,25% trypsin som i trinn 25.
    2. Før overflaten farging med forskjellige fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer, incubate 1 x 10 6 celler med 100 ul av Fc-blokkering 2.4G2 fortynnet i PBS (sluttkonsentrasjon 10 ug / ml) ved 4 ° C i 20 min for å forhindre bindingen av antistoff til Fc-reseptor på celleoverflaten.
    3. På dagene 5, 7, 11, 15, 19, 21 og 28 ved å bruke 1 x 10 6 celler for flowcytometri med forskjellige fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer for påvisning av celleoverflatemarkører, inkludert CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25, og CTLA4.
    4. Etter Fc blokk, vaske cellene med 10 ml PBS og flekken med forskjellige fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer i 20 minutter ved 4 ° C, og deretter utføre flowcytometrisk analyse med 15-farge strømningscytometer. Bruk 0,200 ug antistoff per 10 6 celler fortynnet i 100 ul PBS.
    5. På dag 28, analysere cellene ved flowcytometri 11 og porten på CD4 + CD8 + -celler ved hjelp av CD4 og CD8 fluorokromkonjugerte konjugert flekker; analysere for uttrykket av TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, Og foxp3 (figur 1). For foxp3 farging, fikse cellene og permealize dem og deretter utføre antistoff farging 11.
  3. In vitro antigen stimulering av iPSCs.
    1. På dag 28 av co-kultur, høste IPSC-Tregs fra kulturer ved å samle de flytende celler. Trypsineres resten av cellene med 0,25% trypsin (som i trinn 2.5) og re-suspendere cellene i 8 ml IPSC media. Sentrifuge i 5 min ved 400 x g ved romtemperatur, aspireres media, og igjen re-suspendere cellene i 10 ml media.
      1. Inkuber de re-suspenderes cellene i en ny 10 cm plate ved 37 ° C i 30 min, og samle inn de flytende cellene. Vask cellene med kald PBS.
    2. Inkuber 3 x 10 6 splenocytter fra milt fra C57BL / 6 Rag1 - / - mus med 5 uM ovalbumin peptidet i 200 ul media (OVA 323-339) ved 4 ° C i 30 minutter i en 96 brønners plate 11.
    3. Bland Tregs med OVA 323-339 splenocytes på et 1: 4 forhold (bruk 0,75 x 10 6 Tregs). Inkuber ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 40 timer. I de siste 4 timer, tilsett 4 mL fortynnet Brefeldin A i kulturen (faktiske konsentrasjonen 1,000x, fortynnet i 1x kultur media).
    4. Høste cellene med 0,25% trypsin (som i trinn 2.5), vask med 10% NaN3 og 0,5 M EDTA-løsning (FACS-buffer), blokk med 100 ul fortynnet (sluttkonsentrasjon 10 ug / ml) Fc blokkering 2.4G2, og beis for overflatemarkører, CD4, CD8, TCRVα2, og TCRVβ5 som i trinn 3.2.3-3.2.4.
    5. Fiksere cellene med en 4% paraformaldehydløsning i PBS og permeabilize med 100 ul av 1 x permeabiliseringsbuffer etter celleoverflatefarging. Forsiktig! Paraformaldehyd er allergifremkallende, kreftfremkallende, og giftig.
    6. Flekk cellene med fluorkrom-konjugerte TGF-β og IL-10 i 20 minutter i mørket. Bruk 0,200 mikrogram av antistoff / 10 6 celler diluted i 100 ul PBS. Detektere den intracellulær produksjon av TGF-β og IL-10 med en 15-farge strømningscytometer (figur 2).
    7. Vask cellene tre ganger med kald FACS-buffer før den flowcytometrisk analyse 11.
  4. In vivo utholdenhet av Ag-spesifikke IPSC-tregs.
    1. Etter 8 dager med co-kultur på OP9-DL1-DL4-IA B-celler, overføre IPSC-avledet pre-Tregs (Thy1.2) som i trinn 3.3.1 til Thy 1.1 congenic mus (4-6 uker gamle) via en nålevenen injeksjon uten bedøvelse. Forut for utførelse av haleveneinjeksjon, dilatere halevenen ved hjelp av en infrarød lampe i 5 min. Etter nålevenen utvidelse, plasserer du muse i en rainer og adoptiv overføring 3 x 10 6 celler resuspendert i 200 mL PBS ved å injisere gjennom halevenen.
    2. Seks uker etter treg overføring, avlive mus ved CO 2 kvelning fulgt ved halshugging. Kontroller at mice er ikke puster. Åpne bukhulen ved å kutte den ytre huden av peritoneum ved hjelp av saks og pinsett og trekke det forsiktig tilbake for å avsløre den indre huden fôr bukhulen. Isoler milten og perifere lymfeknuter injisert Thy 1.1 congenic mus.
    3. Samle celler fra milt og lymfeknuter ved hjelp av mekanisk bryte for å gi en enkeltcelle-suspensjon. Cellene inkuberes med 5 ml ACK lyseringsbuffer i 5 minutter ved romtemperatur for å lysere røde blodceller. Utlevering og vaske gjenværende splenocytter eller lymfocytter med 10 ml kald FACS-buffer.
    4. Etter vaskingen, behandle cellene med Fc-blokkering 2.4G2 ved 4 ° C i 20 minutter som i trinn 3.2.2 og flekken med 100 ul fortynnede fluorokromkonjugerte-konjugert anti-Thy 1.2 antistoffer.
    5. Vask cellene med 10 ml FACS-buffer og videre til flowcytometrisk analyse 11.

4. I Vivo Modning og bekjempelse av autoimmun leddgikt

  • Generer konstruksjonene som i trinn 2.1.
  • Utfør retroviral transduksjon 9 som i trinn 2.2.
  • In vivo differensiering og artritt-induksjon i mus.
    1. Skille OT-II TCR / foxp3-omformet iPSCs (OT-II-foxp3 / iPSCs), foxp3-omformet iPSCs, og DsRed omsatte iPSCs på OP9-DL1-DL4-IA b stromale celler i nærvær av cytokiner mFlt-3L og mIL-7 til 8 dager som beskrevet i trinn 2.1 - 2.6.
    2. Trypisinize alle tre typer celler fra 10 cm plate, og re-suspendere celler fra hver 10 cm plate i 10 ml friskt medium. Tilsett celler til en ny 10 cm plate, og går tilbake til inkubatoren i 30 min. Etter 30 minutter, samle flytende celler.
    3. Pass cellene gjennom en 70 mikrometer celle sil for å fjerne cellegrupper og telle ved hjelp av en hemocytometer. Juster cellene til en konsentrasjon på 1,5 x 10 7 celler / ml i kald PBS og filtrer på nytt hvis det er nødvendig. Hold celler på is inntil adoptiv celle overføring i mus. Injisere 200 ul av cellesuspensjonen (3 x 10 6 celler) i tre ulike grupper av 4 - 6 uker gamle hunn C57BL / 6 mus gjennom halevenen, som beskrevet i 3.4.1
    4. På dag 10 etter celleoverføringen, injisere mus med 100 ug av MBSA emulgert i Freunds komplette adjuvans ved roten av halen ved anvendelse av en 1 ml sprøyte.
    5. På dag 17, bedøve mus bruker en isofluran vaporizer (i henhold til IACUC retningslinjer). Utnytte 4-5% isofluran for induksjon og 1-2% for vedlikehold. Indusere artritt ved intraartikulær injeksjon av 20 ug mBSA i 10 ul PBS i venstre kneleddet og 20 ug mBSA og 100 ug OVA helhet i 10 ul PBS i den høyre kneledd. Mat og gelpack kan plasseres på sengetøy gulvet etter leddgikt har utviklet. Mus vil bli avlivet: Body Tilstand Score (BCS) på 2/5 eller døende, alvorlig kakeksi og / eller vedvarende recumbency (en 24-timers periode), og alvorlighetsgraden scorer 4. I poengsum4, erytem og kraftig hevelse omfatte ankel, fot og sifre, eller ankyloses av lem.
  • Karakterisering av OT-II TCR / foxp3-transduced iPSCs.
    1. Bruk et fluorescerende mikroskop (20X) for å visualisere reparerte levende DsRed + GFP + celler.
    2. Undersøk genet integrasjon og uttrykk av både Western blot og flowcytometri 11.
  • Treg utvikling og modning.
    1. I uke 2, 4 og 6 etter celleoverføringen, avlive musene. For aktiv dødshjelp, i hvert bur bruke 1-2 liter CO 2 i første trinn. Så snart dyret har mistet bevisstheten og øke strømningshastigheten for CO2 i en 4 - 5 l / min. Avlive mus ved CO 2 innånding. Isoler milt og avløp lymfeknutene ved å kutte den ytre huden av peritoneum ved hjelp av saks og pinsett og trekke det forsiktig tilbake for å avsløre den indre huden fôr bukhulen.
    2. Samle enkel cellesuspensjon from milt og lymfeknuter ved mekanisk nedbryting ved hjelp av et cellefilter og en 1 ml sprøyte i 1% IPSC media. Sentrifuger konisk rør inneholdende media ved 400 g i 5 min. Re-suspen cellepelleten i 5 ml ACK lyseringsbuffer for å lysere røde blodceller. Re-sentrifuge ved 1000 rpm i 5 min. Re-suspen cellepelleten og vaske de gjenværende splenocytter eller lymfocytter med kald FACS-buffer. Følg trinn 3.4.4 - 3.4.5 og fortsett til flowcytometrisk analyse.
  • Intracellulær farging.
    1. På dag 50 etter smitte, isolere milt og avløp lymfeknutene i mus (som i trinn 4.5.1) etter euthanization av CO 2 innånding fulgt ved halshugging.
    2. Samle enkel cellesuspensjon fra milten og lymfeknutene ved mekanisk nedbryting ved hjelp av et cellefilter og en 1 ml sprøyte. Inkuber splenocytter ved værelsestemperatur i 5 minutter med 5 ml ACK lyseringsbuffer for å lysere røde blodceller. Samle og vaske de resterende splenocytes eller lymfocytter med kaldt FACS buffer. Følg trinn 3.2.3 - 3.2.4, men flekken med overflatemarkører CD4, CD8, CD25, og TCRVβ5.
    3. Fortsett å fikse celler for intracellulær farging som beskrevet i 3.3.5 - 3.3.7 og analysere intracellulær cytokin produksjon (TGF-β og IL-10) fra IPSC-avledet Tregs og gate på live CD4 + CD25 + celler.
  • Infiltrasjon av Ag-spesifikke Tregs i knærne og undertrykkelse av leddgikt.
    1. Etter trinn (4.3 - 4.3.6) på dag 7-14 etter leddgikt induksjon, avlive mus ved CO 2 innånding fulgt ved halshugging (i henhold til IACUC retningslinjer). Fjern hår fra knærne med en elektrisk hårklipperen og skjære knærne ved kirurgisk prosedyre.
    2. Fjern skinnet fra bena ved å lage et snitt i bakbenet med butt-end saks og kutt i huden over låret og ned til ankelen. Forsiktig skrelle huden over benet og foten til utsette muskelen. Fjernemuskel fra benet forsiktig uten å skade kneleddet.
      1. Skjær bakben like over bekken / hofteleddet og skjær tibia bruker skarpe dissekere saks.
    3. Fix knærne i 4% formalin i 48 timer. Avkalke knærne ved å bruke 2,5 M maursyre; skylling tre ganger i xylen i 3 minutter, skylles to ganger i 100% etanol, skylles to ganger i 95% etanol, skylles to ganger i avionisert vann i 2 minutter, og avkalk i 1 mM EDTA. Behandle ved en sub-koketemperatur (90 ° C) i 20 min.
    4. Avkjøl fast vev i 30 min. Skyll den med 1x PBS i 4 min og legge den i parafin. Dehydrere vev gjennom en serie av etanol bad for å fortrenge vann, og deretter infiltrere dem med voks. Deretter legge de infiltrert vev i voksblokker. Utfør både vertikal og horisontal seksjonering for farging. Forbered 4 mikrometer seksjoner med en glidende mikrotom.
    5. Utfør immunfluorescens flekker på seksjonene etter standard prosedyrer av deparaffinization og rehydrering hjelp xylen og etanol 12.
    6. Blokkere endogen peroksidase-aktivitet ved å dyppe objektglasset i en tilstrekkelig mengde av 3% hydrogenperoksidløsning i 3 minutter etter Ag henting. Blokkere lysbilder for ikke-spesifikk binding i 3% BSA i PBS ved romtemperatur i et fuktig kammer i 60 min.
    7. Flekke seksjoner med 200 ul fluorokromkonjugerte konjugert TCRVβ5 antistoff fortynnet 1: 100 i blokkering løsning. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur i en 75 - 100% fuktet kammer, og vaskes 5 ganger i 1 x PBS i 5 min.
    8. Counterstain lysbildene for nukleær farging med en antifade reagens som inneholder DAPI. Tilsett ca 300 ul av den fortynnede DAPI fargeløsning (300 nM i 1 x PBS) for dekkglass, slik at sikker på at hele dekkglass er dekket. Oppbevar glir i mørke ved 4 ° C inntil analyse under et fluorescerende mikroskop (figur 3).
  • Leddgikt undertrykkelse analysen
    1. Mål hevelse i begge knærne til musene før leddgikt induksjon ved hjelp av en ekstern måler caliper å etablere en baseline.
    2. Følg trinn (4.3 - 4.3.6) for leddgikt induksjon og treg overføring. Mål muse knærne med en ekstern måler caliper etter treg overføring.
    3. Beregn prosent økning i kneet diameter: prosent økning = (Kne diameter på dag 1 - Knee diameter på dag 0) / Knee diameter på dag 0.
  • Måling av felles ødeleggelse og inflammatorisk celleinfiltrasjon i knærne ved histologi (figur 4).
    1. På dag 7 etter leddgikt induksjon, avlive mus som tidligere beskrevet og avgifts knærne ved kirurgisk prosedyre. Se trinn 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Fix knærne i 4% formalin, avkalke i EDTA, og bygge inn i parafin. Se trinn 4.7.3
    3. Fjern begge knærne, fikse i 10% formalin, og forkalkninger i Formical-4. Embed vev i parafin, seksjon 4 mikrometer, og flekken med hematoxyli og eosin (H & E) eller safranin O farging (som i trinn 4.7.7) og observere under et mikroskop.
    4. Bruk H & E flekker å evaluere bein erosjon med en semi-kvantitativ scoring system (0: ingen erosjoner, 4: utvidet erosjoner og ødeleggelse av bein). Bruk safranin O farging for å evaluere tapet av proteoglykaner og scorer med en semi-kvantitativ poengsystem (0: ingen tap av proteoglykaner, 3: fullstendig tap av farging for proteoglykaner).
      1. Bruk en semi-kvantitativ scoring system å score inflammatorisk celleinfiltrasjon på H & E beiset lysbilder (0: ingen celle infiltrasjon, 4: florerte celle infiltrasjon). Evaluere score ved å undersøke begge knærne i en blindet måte.

    • 5. Måling av bentap i knærne med høy oppløsning Micro-computertomografi (micro-CT) System

    1. På dag 10 etter leddgikt induksjon, bedøver mus med 2% isofluran og forberede for bildebehandling.
    2. posisjon mice med knærne vendt oppover i kammeret.
    3. Bruk en høy oppløsning mikro-CT-systemet for å skaffe seg in vivo avbildning av benet arkitekturen rundt knærne av musene.
    4. Utfør mikro-CT med en 2,2 mm lengde, inkludert mus kneledd med følgende parametre: 10,5 mikrometer voxel størrelse på 55 kv, 145 uA 200 msek integrasjonstiden, 211 bilder.
    5. Import mikro-CT-bilder og fange frontal flyet bilder etter ytterligere bildebehandling (volumgjengivelse og transformasjon) (figur 5).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Som vist her, på dag 28, Ag-spesifikke Tregs hovedsakelig uttrykt CD3 og Ag-spesifikke TCR, to T-celle-markører. CD3 + TCRVβ5 + befolkningen uttrykte CD4. De fleste av CD3 + TCRVβ5 + CD4 + -celler også uttrykt CD25, CD127, og CTLA-4, som vanligvis blir uttrykt ved høye nivåer i naturlig forekommende t reg (nTregs) og i T-celler som uttrykker foxp3 ectopically. Foxp3 uttrykk i IPSC-avledet celler vedvarte selv etter langvarig in vitro stimulering med Notch ligand, som oppdaget av intracellulær farging analysert ved flowcytometri (figur 1). I tillegg er det Ag-spesifikke IPSC-Tregs produsert suppressive cytokiner, slik som TGF-β og IL-10, når de ble stimulert in vitro med Ag-pulserte splenocytter (figur 2), som indikerer den IPSC-Tregs hadde potensielle suppressive aktivitet. Fluorescens mikros avslørt at flere foxp3 + celler var tilstede i OVA-behandlede enn PBS-behandlede knær; det var ingen foxp3 + celler som finnes i knærne hos mus som fikk de DsRed + vektor-transduced iPSCs. Mange flere CD4 + foxp3 + TCRVβ5 + celler som presenteres i knærne av mus som fikk iPSCs transduced med MiDR-TCR-foxp3 enn MiDR-foxp3 (figur 3). Disse observasjonene tyder på at Ag-spesifikke IPSC-Tregs migrere til AIA kneet etter adoptiv overføring til mottaker mus. De overførte IPSC-avledede celler vesentlig redusert den inflammatoriske svelling kneet når OVA var til stede, men hadde ingen effekt på kontroll kne som kun ble injisert med MBSA i den murine modellen (figur 4); redusert bentap i cellen, overføring kneet visualisert ved høy oppløsning mikro-CT-systemet (figur 5).

    tp_upload / 54720 / 54720fig1.jpg "/>
    Figur 1:. Differensiering av Ag-spesifikke IPSC-Tregs Murine iPSCs ble omformet med en konstruksjon: MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-foxp3 inneholder gener av OVA-spesifikke TCR og foxp3. De gen-transduserte celler (DsRed +) ble ko-dyrket på OP9-DL1-DL4-IA-B-celler i nærvær av mFlt3L og mIL-7. (A) Morfologi av T regs celledifferensiering på dag 0, 7, 14 og 22. (B) Strømningscytometrisk analyse for proteinet ekspresjon av IPSC-avledede celler på dag 28. CD3 + TCRVβ5 + celler ble gated som indikert (R1) og analysert for ekspresjon av CD4 og CD8, med CD25, CD127, CTLA- 4, og foxp3 vist for celler gated som CD4 + CD8 - celler (R2). (mørke linjer; skraverte områdene viser isotype kontroller) klikk her for å se en largeh versjon av denne figuren.

    Figur 2
    Figur 2: Funksjonelle analyser av I n Vitro Differensiert Ag-spesifikke Tregs Murine IPSC-tregs ble stimulert av splenocytter. (APC, T regs / APC = 1: 4) og pulset med OVA 323-339 peptid. Intracellulær cytokin produksjon (TGF-β og IL-10) ble analysert ved flowcytometri etter gating på live CD4 + CD25 + celler. (Mørke linjer; skraverte områdene viser isotype kontroller) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3: Ag-spesifikke IPSC-Tregs infiltrere i kneledd. Ag-spesifikke IPSC-tregs ble adoptiv overført til C57BL / 6 mus. Kort tid etter induksjon artritt (dager 7 - 14), ble knærne fjernet og farget for immunohistologi (skala barer: 20 um). Mus som fikk OVA-spesifikke IPSC-Tregs har et stort antall TCRVβ5 + celler i knærne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4: adoptiv overføring av Ag-spesifikke IPSC-Tregs lindrer AIA i Mus Murine iPSCs ble transduced med retroviral konstruksjon MiDR, MiDR-foxp3, eller MiDR-TCR-foxp3 og samtidig var dyrket på OP9-DL1 / DL4 /. IA B-celler. På dag 7, gense-transduserte celler (3 x 10 6 / mus) var endoptively overført inn i hunn C57BL / 6 mus som ble indusert med AIA to uker etter celleoverføringen. På dagen etter induksjonen artritt, ble artritt alvorlighetsgraden overvåkes ved måling av kneet diameteren. (AC) Prosent økning i kneet diameter. Økning i kne diameter ble beregnet på grunnlag av preinjection kne diameter for hver mus før injeksjon på dag 0. Arthritis resultatet ble bedømt ved å undersøke begge knærne på en blindet måte; hvert kne ble tildelt en poengsum (0: ingen synlig hevelse eller misfarging, 1: synlig hevelse med eller uten misfarging, 2: moderat hevelse med misfarging, 3: alvorlig hevelse med misfarging). I hver gruppe ble fem mus brukt, og data som er representative for tre uavhengige eksperimenter. Data blir representert som gjennomsnittet ± SD. (D) Den midlere å utføre på dag 7 for begge knærne fra fem mus. Data blir representert som gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (** p <0,01, *** p <0,001, to-veis ANOVA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 5
    Figur 5:. Ag-spesifikke IPSC-Tregs migrere til OVA Støpt Kne og redusere bentap IPSC-tregs ble adoptiv overført til C57BL / 6 mus. Innen 21 dager etter induksjon artritt ble musene bedøvet og benet arkitekturen rundt muse knærne ble avbildet ved mikro-CT-systemet. Mus som mottok OT-II TCR / foxp3 gen-transduserte murine IPSC-Tregs oppviser betydelig reduksjon av bentap sammenlignet med kontroll mus som mottok vektor-transduserte iPSCs. (A) skanninger ble utført med et 2,2 mm lengde, og bildene ble tatt etter videre bildebehandling (volumgjengivelse og transformasjon;skala barer. 1 mm) (B) Bone volum rundt kneleddet ble evaluert med tredimensjonal rekonstruksjon av mikro-CT-bilder, og bein volum inne i volumet av interesse ble beregnet (skala barer:. 1 mm) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I denne protokollen, er et kritisk punkt in vitro differensiering av TCR / foxp3 gen-transduced iPSCs. In vitro Notch signale induserer utviklingen mot T-cellen avstamning. For å skille iPSCs i CD4 + foxp3 + Tregs, brukte vi OP9-DL1 / DL4 / IA B-celler, noe som sterkt uttrykte MHC II (IA b) molekyler. De fleste av de iPSCs differensiere til CD4 + celler. Imidlertid, etter at overflaten TCR uttrykk, mange differensierte pre-T-celler miste evnen til å differensiere og til slutt dø. Som et resultat av celletallet av de IPSC-avledede funksjonelle Tregs reduserer dramatisk etter fire uker med in vitro differensiering. For å unngå dette, kan tilsetting av IL-2 forbedre celle overlevelse på disse tidspunktene. En alternativ metode for å drive modning og overlevelse av Ag-spesifikke forhånds Tregs er å overføre den pre-Tregs som har differensiert in vitro i en uke i mus. Disse pre-Tregs kan continue differensiere og modning in vivo i ytterligere tre uker. Ved hjelp av denne metoden, kan en funksjonell Ag-spesifikke Treg befolkningen genereres fra iPSCs, som er nTregs-aktig og har evnen til å undertrykke autoimmun leddgikt i murine modell.

    For å forbedre effektiviteten av in vivo utvikling av Ag-spesifikke IPSC-Tregs, ulike forbindelser (for eksempel retinsyre, gelectin) 13,14 eller undertrykkende cytokiner (for eksempel TGF-β, IL-10), kan brukes etter adoptiv overføring av pre-tregs. I tillegg til å øke celleoverlevelse, kan denne kombinerte metode opprettholde foxp3 uttrykk 14,15 og forbedre kvaliteten på det Ag-spesifikke IPSC-Tregs.

    Et potensielt problem som kan oppstå for in vivo Treg utvikling er generell immunsuppresjon, noe som resulterer i komplikasjoner under infeksjoner eller påfølgende vekttap. Et stort antall Ag-spesifikke Tregs utvikling i vivo kan forverre infeksjoner. I dette tilfellet, en selvmordsgen, den induserbare caspase 9 (ICasp9) 15,16, kan bli innlemmet i TCR / foxp3 vektor. Denne tilnærmingen muliggjør fjerning av stamcelle-avledede Tregs ved injeksjon av en liten bioinert-molekyl dimerisering middel (AP1903) for å "stenge av" generering av stamcelle-avledet Tregs, som vil overvinne dette potensielle problemet.

    En selv Ag er en typisk protein gjenkjent av immunsystemet i vert som lider av en autoimmun lidelse individ. Denne selv-Ag er målet for immunsystemet, og de korrelerte T-cellene blir ikke slettet. For å generere egen Ag spesifikke Tregs, er bruken av TCR transduksjon et godt valg. En selv Ag (som varmesjokkprotein) spesifikk TCR kan bli omformet til moden CD4 + CD25 + Tregs fra perifere mononukleære blodceller (PBMC), og denne metode har blitt benyttet i kliniske forsøk. Alternativt, som desbert i denne protokollen, ved hjelp av genet transduksjon av selv Ag bestemt TCR med foxp3 og stimulering med Notch signalering, stamcelle-avledet Tregs kan være selv Ag spesifikk Tregs.

    Cell-baserte terapier for autoimmune sykdommer som benytter konstruert Tregs kan være nyttig 17. Selv TCR transduksjon i T-celler har vist seg å være trygge, gjennomførbart, og gjelder i kliniske studier, er det fortsatt store sikkerhetsproblemer på grunn av autoimmunitet forårsaket av kryssreaksjon med friskt vev 18. Videre bruker dagens metoder, genmodifisert Tregs vanligvis har en kortsiktig persistens in vivo 19. Alternativt, er en lovende kilde for utvikling av store mengder monoklonale Ag-spesifikke Tregs stamceller. Embryoniske stamceller (ESCS) har den beste pluripotency og selvfornyelse, men det er ikke mulig å få dem fra pasienter. Selv om enkelt isolert fra perifert blod, hematopoetiske stamceller (HSCs) er multi-potente stamceller og kan ekspanderes i cellekultur på samme måte som ESCs 20. Present IPSC teknologien har avansert til en mer effektiv produksjon av PSC fra pasientenes somatiske celler ved transduksjon av ulike transkripsjonsfaktorer. En rekke metodiske forbedringer har blitt utviklet de siste årene for å generere iPSCs av maksimalt redusere potensielle farer som immunogenisitet og tumorigenicity. Sammenlignet med ESCs, iPSCs har identisk pluripotency og selvfornyelse. Som et resultat, kan IPSC teknologi gir en fordel i utviklingen av pasient og / eller sykdomsspesifikke pscs. Bruken av iPSCs å utvikle Ag-spesifikke Tregs kan videre innenfor celle-baserte terapier for autoimmune sykdommer 10,11.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Dette prosjektet ble finansiert delvis under tilskudd fra National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 og K18CA151798), American Diabetes Association (1-16-IBS-281), og Pennsylvania Department of Health (Tobakk Settlement Funds) til JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
    2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
    3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
    4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
    5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
    6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
    7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
    8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
    9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. , e3986 (2012).
    10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
    11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
    12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. , (2007).
    13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
    14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
    15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
    16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
    17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66 (2010).
    18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
    19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
    20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

    Tags

    Immunologi regulatoriske T-celler pluripotent stamcelle celledifferensiering antigen-indusert artritt mus autoimmune sykdommer
    Utvikling av stamcelle-avledet Antigen-spesifikke Regulatoriske T-cellene mot autoimmunitet
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P.,… More

    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter