Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar partículas carregadas de alérgenos por citometria de fluxo. partículas de material particulado ambiental podem agir como portadores de alérgenos adsorvidos. Mostramos aqui que a citometria de fluxo, um método largamente usado para caracterizar os sólidos em suspensão> 0,5 um de diâmetro, pode ser usado para medir estas partículas carregadas com alérgeno.
Abstract
Citometria de fluxo é um método amplamente utilizado para quantificar os sólidos em suspensão, tais como células de bactérias ou em um intervalo de tamanho de 0,5 a algumas dezenas de micrómetros de diâmetro. Além de uma caracterização das propriedades de dispersão para a frente e lateralmente, que permite a utilização de marcadores fluorescentes rotulados como anticorpos para detectar respectivas estruturas. Utilizando coloração com anticorpo indirecta, por citometria de fluxo é utilizada aqui para quantificar alergénio de pólen de bétula (precisamente Bet v 1) -loaded partículas de 0,5 a 10 um de diâmetro de partículas inaláveis (PM10, tamanho de partícula ≤10 um de diâmetro). partículas PM10 podem actuar como transportadoras de alérgenos adsorvidas possivelmente transportá-los para o tracto respiratório inferior, onde pode desencadear reacções alérgicas.
Até agora, o conteúdo alergênico de PM10 foi estudado por meio de enzima ligada immunosorbent (ELISA) e microscopia eletrônica de varredura. ELISA mede a não dissolvido e a partículaalérgeno -bound. Em comparação com microscopia eletrônica de varredura, que podem visualizar partículas carregadas de alérgenos, citometria de fluxo pode ainda quantificá-los. Como conteúdo alergênico de ar ambiente pode desviar-se contagem de pólen de bétula, sintomas alérgicos talvez relacionar melhor com a exposição a alérgenos do que com contagem de pólen. Em conjunto com os dados clínicos, o método apresentado oferece a oportunidade de testar em experiências futuras se reacções alérgicas ao pólen de bétula antigénios estão associados ao teor de alérgeno de Bet v 1 de partículas PM10> 0,5 uM.
Introduction
A poluição do ar está sendo considerado como uma importante causa ambiental do aumento da incidência e gravidade das alergias respiratórias observadas nas últimas décadas 1-3. Além disso, houve um interesse crescente na distribuição de alergénios comuns em 4,5 poeira.
Pólen de vidoeiro pode provocar a febre do feno, mas também pode ser um gatilho importante da asma alérgica 8/6. pólen de bétula todo não é susceptível de entrar no tracto respiratório inferior ou pode ser encontrada em PM10, como um resultado do seu tamanho (22 um de diâmetro). No entanto, alérgenos de pólen de bétula como Bet v 1, o principal componente do pólen de bétula alérgeno, pode ser liberado após a ruptura pólen 9 e pode se ligar a partículas no ar ambiente 10, assim, possivelmente, entrar nas vias respiratórias inferiores. De facto, tem sido mostrado que a MP10 pode conter alérgenos biologicamente activos como demonstrado pela activação in vitro de basófilos de um pólen probando alérgica 11
Bet v conteúdo 1 alérgeno no MP10 tem sido estudada por extrair o respectivo alérgeno e quantificação subsequente com ELISA 12-14. Com a técnica de ELISA, o alérgeno dissolvido foi medida, mas a quantidade de partículas carregadas com alérgeno ainda permanecia desconhecida. Microscopia eletrônica de varredura revelou partículas carregadas de alérgenos, mas não permitem a quantificação 10,15.
Este estudo emprega citometria de fluxo para quantificar a proporção de partículas PM10 Bet v 1-carregados em amostras do ar ambiente. Devido ao limite de detecção do citómetro de fluxo apenas partículas maiores do que 0,5 um pode ser examinado. O> 0,5 m fração de PM10 será ainda referido como PM10> 0,5.
Protocol
NOTA: Este protocolo descreve a coloração indirecta das partículas PM10 com um anticorpo monoclonal (anticorpo monoclonal IgG1 de ratinho, clone MA-3B4) contra Bet v 1, o principal componente antigénio de pólen de bétula, além de uma aloficocianina (APC) marcado com anticorpo secundário (anti -Mouse anticorpo IgG1, clone A85-1) e subsequente análise num citómetro de fluxo. Com outros anticorpos adequados disponíveis, este método pode ser estendido para a detecção de outros antigénios ligados a partículas do ar ambiente.
1. PM10 Sampling
- Recolhe PM10 do ar ambiente em politetrafluoretileno (PTFE) filtros utilizando um amostrador de baixo volume com um caudal de 2,3 m 3 / hr (Figura 1). A caracterização do dispositivo de amostragem utilizado para as experiências aqui descritas encontra-se em 16. O tempo de funcionamento depende da quantidade necessária de PM10 (normalmente entre 1 e 10 dias).
- No final do tempo de incubação, remover o filtro do amostrador e congelá-lo em-20 ° C até à sua utilização.
Figura 1. Baixa de recolha a volume PM10. Exemplo de um amostrador de volume baixo PM10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Remoção 2. PM10 e contagem de partículas
- Deixe o degelo filtro de PTFE por cerca de 5 min. Em seguida, coloque o filtro em um poliestireno limpo placa de Petri (Figura 2A). Dê uma nova placa de Petri para cada filtro, se mais de um filtro é processado.
- Subsequentemente, sobrepor o filtro de PTFE com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Este protocolo é estabelecido para uma concentração de PM10 final do 8x10 6 partículas por ml (veja o passo 3.3). Para se obter, pelo menos, que a concentração de, utilizar o volume seguinte empírica de PBS para sobrepor o filtro com: Se o tempo de recolha de MP10 foi < 2 dias, 2 ml usar. Para tempos de incubação ≥2 dias, use 4 ml.
NOTA: De modo a aumentar a concentração de partículas da suspensão de PM10, suspensões de diferentes filtros podem ser reunidas, se esta é apropriada. - Segure o filtro de PTFE com uma pinça e pincel com uma escova de dentes elétrica com uma cabeça sensível escova para 1 min (Figuras 2B, 2C). Transferir a partícula-PBS-suspensão, suspensão PM10 doravante denominado, a um tubo de reacção limpo.
Figura 2. remoção PM10 com uma escova de dentes eléctrica. Um filtro de politetrafluoroetileno com PM10 amostrado é colocado numa placa de Petri de poliestireno (A) e é coberta com 4 ml de PBS. Então, PM10 é removido com uma escova de dentes elétrica (B: antes de escovar e C: após a escovação durante 1 min).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Medir a concentração de partículas de PM10, por exemplo, por utilização de um contador de partículas. Dilui-se um volume adequado de PM10 suspensão tal como a 50 ul em 10 ml de tampão isotónico de medição, medir três vezes e calcular o número total médio de partículas por ml. Certifique-se de usar um contador de partículas que pode detectar partículas de dimensão relevante.
3. Bet v 1 Coloração
- Calcular o número de tubos de reacção necessários para a análise da amostra: Pelo menos três são necessários tubos de reacção de: (i) um tubo com apenas amostra (controlo nativo) (ii) um tubo com amostra mais anticorpo secundário (controlo negativo), e ( iii) um tubo com a amostra mais anticorpo primário e secundário (amostra específica). Se medido pela primeira vez, preparar, pelo menos, dois tubos de reacção de (i) (ii),e (iii) ter material suficiente para ajustar adequadamente citômetro configurações (veja o passo 4.1).
- Calcula-se a quantidade de suspensão PM10 requerida para o número de tubos de reacção. Cada tubo de reacção requer 50 ul de suspensão.
- Ajustar a concentração de partículas medido no passo 2.4 para o volume da suspensão no passo 3.2 calculada para uma concentração final de 8x10 6 partículas por ml pela adição de uma quantidade apropriada de PBS.
NOTA: A suspensão PM10 restante pode ser congelada a -20 ° C para experiências futuras, embora para este protocolo recentemente preparado suspensão PM10 é recomendado. - Bloco de ligação inespecífica, completando a suspensão PM10 com albumina de soro bovino (BSA) a uma concentração final de 0,02%, utilizando uma solução de reserva, tal como BSA a 1% preparada com PBS. Vortex brevemente e incubar durante 20 min à temperatura ambiente.
- Para cada amostra a ser analisada por citometria de fluxo, transferir 50 ul da suspensão do passo 3.4 a ACtubo de reacção magra. Adicionar um anticorpo monoclonal de ratinho contra Bet v 1, a uma concentração final de 0,02 mg / mL para os tubos de reacção designadas por coloração específica, vortex brevemente e incubar durante 60 min à temperatura ambiente.
- Deixe os tubos de reacção, com a suspensão PM10-BSA designado para o controlo nativo e o controlo negativo também ficar durante 60 minutos à temperatura ambiente.
- Lavar todas as amostras pela adição de 500 ul de PBS suplementado com BSA a 0,02% a cada tubo de reacção, brevemente vórtice e centrifuga-se as amostras a 4700 xg, subsequentemente, durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma bomba de vácuo.
- Repita o passo 3.6.
- Determinar a quantidade total de anticorpo anti-IgG1 marcado com APC-secundário necessário: 1 ug de anticorpo dissolvido em 50 ul de PBS suplementado com 0,02% BSA por tubo de reacção. Dilui-se a quantidade apropriada de anticorpo com o respectivo volume de PBS suplementado com 0,02% de BSA.
- Adicionar 50 uL de anticorpo secundário diluído para todos os tubos de reacção excepto para o tubo de reacção designado para o controlo nativo. Suplementar o último com 50 ul de PBS suplementado com 0,02% de BSA. Vortex todas as amostras por alguns segundos.
- Incubar todas as amostras durante 30 min no escuro.
- Repita o passo 3.6 duas vezes.
- Adicionar 50 ul de PBS a cada tubo de reacção, de vórtice e analisar as amostras num citómetro de fluxo.
4. Análise de citometria de fluxo
- Usando o controle nativo, ajustar as seguintes citômetro parâmetros para otimizar a análise de dados.
- Ao utilizar o controlador de limite de dispersão para a frente (FSC) apresentada no quadro de controle do dispositivo, definir o limite FSC com o menor valor (200) e começar a análise.
- Ao usar o controlador de tensão de dispersão, ajustar o FSC e dispersão sideward (SSC) dessa forma que todas as partículas PM10 podem ser detectados e que a população de partículas está localizado aproximadamente no the meio do eixo FSC e na metade inferior do eixo SSC.
- Ao utilizar o controlador de tensão de fluorescência, ajustar a tensão de APC e uma outra tensão de fluorescência como isotiocianato de fluoresceína (FITC), o qual não emite no mesmo comprimento de onda como APC, se necessário. Certifique-se de que todas as partículas são visíveis na metade inferior de ambos os eixos de fluorescência.
- Consecutivamente, analisar cada uma das amostras, incluindo o controlo nativo e armazenar os dados do FSC, SSC, APC, e FITC de pelo menos 10.000 partículas por amostra.
- Avaliar os dados com o respectivo software. conteúdo alérgeno adsorvida na amostra específica pode ser quantificada de duas formas:
- Analisar a intensidade de fluorescência APC de todas as partículas (valor médio) como uma medida de Bet v 1 carga sobre todas as partículas PM10.
NOTA: Se a amostra específica contida alérgeno, APC intensidade de fluorescência deve aumentar na amostra específica em comparação com o controlo negativo. Em contraste, outro Fluorintensidades escence (por ex., FITC intensidade de fluorescência) não deve alterar significativamente. - Calcular a percentagem de partículas PM10 com anticorpo ligado anti-Bet v 1. Deste modo, no controlo negativo, definir uma porta em torno das partículas consideradas APC positivo, copiar e colar esse portão para a amostra específica e subtrair a percentagem de partículas APC positivos no controlo negativo a partir da percentagem de partículas de APC positivos na amostra específica.
- Analisar a intensidade de fluorescência APC de todas as partículas (valor médio) como uma medida de Bet v 1 carga sobre todas as partículas PM10.
Representative Results
Bet v 1 alérgeno adsorção de PM10> 0,5 partículas foi quantificado por coloração com anticorpo indirecta e subsequente análise num citómetro de fluxo. Uma amostra de PM10 de alta temporada de pólen serviu como modelo. Tal como indicado no passo 3.1, o controlo negativo consistiu de partículas de PM10 incubadas com anticorpo secundário marcado com APC única (Figura 3A). PM10 partículas coradas com anti-Bet v 1 de anticorpo mais anticorpo secundário exibido o alérgeno carregado partículas (Figura 3B). Tal como descrito no passo 4.3, foram usadas duas formas de quantificar a carga alérgeno: Por um lado, o valor da mediana da intensidade de fluorescência de todas as partículas da APC foi analisada sendo 137 para o controlo negativo e 904 para a amostra específica. Por outro lado, determinou-se a percentagem de partículas com o anticorpo ligado anti-Bet v 1: Um portão foi definido em torno das partículas de APC positivos no controlo negativo e subsequentemente copied e colado na amostra específica. No controlo negativo, 3% das partículas PM 10> 0,5 foram considerados positivos APC. Esta percentagem de partículas de falsos positivos foi subtraída a partir da percentagem de partículas positivas na amostra específica resultando em 77,5% de PM10 positivo APC> 0,5 partículas na amostra específica. Para provar que o anticorpo de ligação do anti-Bet v 1 observada era específica, a capacidade de ligação foi bloqueada com o antigénio correspondente antes da coloração. Isto diminuiu a ligação do anticorpo anti-Bet v 1 em 69%, se quantificada pela APC intensidade de fluorescência, e por 84%, quantificados por se percentagem de Bet v 1 PM10 positivo> 0,5 partículas (Figura 3C).
Figura 3. Bet v 1 alérgeno pode ser visualizada por citometria de fluxo. A APC intensidade de fluorescência de uma amostra de alta PM10 po de partículas ligadasllen estação coradas apenas com o APC anticorpo secundário marcado com (A), coradas com o anti-Bet v 1 de anticorpo primário e, subsequentemente, com o APC anticorpo secundário marcado com (B), e depois o bloqueio do anticorpo primário com o recombinante Bet v 1 de antigénio (C ). A APC porta P + foi criado em torno das partículas consideradas APC positiva (exibido em vermelho) e respectivas percentagens são dadas. Este número foi ligeiramente modificada a partir de 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para testar se este método poderia ser adotada para revelar diferenças na quantidade de adsorvida Bet v 1 conteúdo de PM10> 0,5 amostras de alta e de baixa temporada pólen, 13 MP10 de alta e 6 MP10 de baixa temporada de pólen foram analisados. Figura 4mostra diferenças significativas na intensidade de fluorescência APC e na proporção de Bet v 1 PM10 positiva> 0,5 partículas de MP10 de alta temporada de pólen em comparação com MP10 de baixa temporada de pólen. Ambos os métodos de quantificação mostrou decide resultados semelhantes.
Figura 4. MP10 de baixa e alta temporada de pólen diferem na sua quantidade de adsorvida Bet v 1. Baixo PM10 temporada de pólen foi coletado no outono / inverno 2013 (n = 6), alta pólen PM10 em Maio de 2012 e de 2013 (n = 13). (A) A intensidade de fluorescência APC de PM10> 0,5 partículas de alta temporada de pólen foi significativamente maior do que de baixa temporada de pólen (mediana / min / max alta temporada de pólen: 796/313/1097; mediana / min / max baixa temporada de pólen: 197 / 85/277). (B) PM10 da alta temporada de pólen contido significanTLY mais Bet v PM10 1-positivo> 0,5 partículas do que PM10 de baixa temporada de pólen (mediana / min / max alta temporada de pólen: 45,2 / 18,5 / 74,5, mediana / min / max baixa temporada de pólen: 11,8 / 4,4 / 19,8). Os diagramas de caixa mostram valores medianos (linha interna da caixa), 25. e 75. percentis, respectivamente (bordas superior e inferior da caixa) e valores mínimos e máximos (filamentos). *** P <0,001 versus baixa temporada de pólen, Mann Whitney U. Este número foi ligeiramente modificada a partir de 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Uma etapa fundamental do protocolo é a utilização de um filtro adequado para a recolha de partículas PM10 de ar ambiente (ver passo 1.1). O filtro tem de ser suficientemente forte para suportar escovagem dos dentes com uma escova de dentes eléctrica, e não todos os materiais de filtro de cumprir este requisito. O protocolo de coloração foi estabelecido com uma concentração de partículas PM10 de 8x10 6 partículas por ml. No entanto, se o material é limitado e agregação de amostras não é apropriado, o método provavelmente irá funcionar bem, mas as concentrações de anticorpos (ver passos 3.5 e 3.8) pode ter de ser ajustada.
Bet v 1 de coloração de partículas PM10 não resultou em populações distintas de partículas positivamente e negativamente manchadas. Isto pode ser causado pelas quantidades variáveis de Bet v 1 alérgeno adsorvidos em cada uma das partículas que vão de muito pouco, até um valor alto. Isto poderia resultar na expansão do sinal de APC deslocando assim a população em direcçãopositividade APC. Como é difícil separar o positivo das partículas negativas, dois métodos de quantificação foram utilizadas para determinar as diferenças no conteúdo de Bet v 1 de PM10> 0,5 espécimes: (i) quantificação relativa, medindo a mediana APC intensidade de fluorescência de todas as partículas e (ii) determinação da percentagem de partículas de APC positivos. Em relação ao Bet v 1 carga de partículas de baixa e alta temporada de pólen PM10> 0,5, ambos os métodos revelou resultados semelhantes. Ainda assim, a quantificação relativa por intensidade de fluorescência mediana de todas as partículas é recomendada, pois é independente de colocar o portão e, portanto, provavelmente, menos propenso a erros.
Até à data muitos estudos examinar o conteúdo alérgeno em partículas do ar ambiente através da extracção do respectivo alérgeno e quantificação subsequente com ELISA 5,12-14,17. Há uma diferença fundamental entre o procedimento descrito aqui eo quantificatioN com ELISA: ELISA quantifica o antigénio e extraiu-se dissolvido, enquanto que a citometria de fluxo analisa o antigénio ligado à partícula. Por meio de ELISA a Bet v 1 de carga das amostras de MP10 testados (n = 8) foi inferior ao limite de detecção de 1,2 ng / ml (dados não mostrados). Da mesma forma, Buters e outros não identificou Bet v 1 na PM <2,5 mm fração e apenas cerca de 7% no 10 m> PM> 2,5 mm fração, mas mais de 93% no PM> 10 mm fração do ar ambiente 13. Os resultados contrastantes de ELISA, por um lado, e a análise FACS, por outro lado, podem ser causadas por diferenças no método de detecção em combinação com a sensibilidade divergente. Mais pesquisas no entanto é necessário para compreender plenamente essa diferença.
Um método para visualizar-partícula ligada antígeno é microscopia eletrônica de varredura 10,14. Por microscopia de varrimento de electrões, Ormstad et ai. Bet v 1 visualizado na superfície das partículas suspensas foscopartículas de fuligem r amostrado na alta temporada de pólen e, em menor medida, as partículas amostradas na baixa temporada de pólen 15. Além disso, a partir de alérgenos do pólen, látex e também P-glucanos foram encontrados para ser adsorvido em partículas de combustão no ar ambiente 10. Este método, no entanto, não permite a quantificação do alergénio ligada à partícula.
Com o uso de citometria de fluxo, com ligação a partículas Bet v 1 alérgeno puderam ser quantificados. Assim, a citometria de fluxo pode oferecer uma nova maneira de caracterizar os 10 a 0,5 um fracção biológica de PM10, como com outros anticorpos adequados na mão, este método pode ser estendido para a detecção de outros antigénios em partículas do ar ambiente, por exemplo, bolor, ácaros do pó alérgenos ou LPS. Como partículas PM10 adsorver não só material biológico, mas também produtos químicos e metais com bastante facilidade, ligação inespecífica de anticorpos podem, no entanto, constitui um problema. Se um novo anticorpo é testado, um passo crítico é provar ligam específicaing. Isto pode ser realizado por, por exemplo, bloqueando a capacidade de ligação do anticorpo específico com o antigénio correspondente, antes de corar 11.
Como Bet v 1 conteúdo do ar ambiente pode ser diferente da contagem de pólen de bétula 12,13,18, sintomas alérgicos talvez relacionar melhor com o nível de alérgenos do que com pólen contar 14,18. Assim, o método apresentado em conjunto com dados clínicos permite examinar em experimentos futuros se reacções alérgicas para Birch corresponder à carga alérgeno Bet v 1 de PM10> 0,5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/hr |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55 mm, H 15 mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5 ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1.4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
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