Summary

Enkel og effektiv produktion og oprensning af Mouse Myelin oligodendrocyt Glycoprotein for Eksperimentel Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Published: October 27, 2016
doi:

Summary

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introduction

MS er en human sygdom karakteriseret ved kronisk inflammation og neurodegeneration af CNS, som menes at være drevet af en autoimmun reaktion rettet mod myelin. Tabet af myelin og axoner over tid resultere i gradvis nedgang af kognitiv og motorisk funktion 1. "Experimental Autoimmune Encephalomyelitis" er en samlebetegnelse for dyremodeller for autoimmun sygdom rettet mod CNS myelin. Som menneskelige MS, er EAE typisk kendetegnet ved immun celle infiltration af CNS og i nogle tilfælde, demyelinisering 2. Men i hvilken grad en given EAE model ligner human MS delvis afhænger af art eller stamme anvendes, og af kompleksiteten af ​​den underliggende anti-myelin autoimmun reaktion.

Anti-myelin autoimmunitet kan eksperimentelt induceret på flere måder, men den mest almindelige metode i dag er at immunisere mus med et kort peptid af aminosyrer efterligner den immunodominante CD4 <sup> + T-celleepitop af et myelinprotein. Dette repræsenterer minimumskravet til at inducere en patogen respons. Måske den mest almindelige af disse er en 21 aminosyre peptid afledt fra myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG 35-55), som anvendes til at inducere EAE i C57BL / 6-mus 3. For nogle eksperimentelle formål er det imidlertid ønskeligt eller endog nødvendigt at immunisere med større proteinantigener og faktisk er der flere fordele ved denne end immunisering med kort peptid. Første på grund af MHC-restriktion, korte peptider er sædvanligvis kun effektive i et meget begrænset udvalg af stammer, mens større proteinantigener repræsenterer enten hele proteinet eller et bestemt domæne kan behandles normalt til præsentation i flere indavlede musestammer eller endog i forskellige arter fire. Sekund, et større protein-antigen er i stand til at inducere en mere kompleks immunrespons inkorporerer flere typer af lymfocytter i antigengenkendelse, snarere end limiting antigengenkendelse til CD4 + T-celler. For eksempel B-celler via deres B-celle receptor (BCR) interagere direkte med hele snarere end forarbejdet protein. Vi og andre har vist, at B-celler aktiveres af MOG 35-55 immunisering ikke anerkender MOG protein 5. Da B-celler for nylig blev påvist at spille en patogen rolle i human MS 6, EAE-modeller, der inkorporerer B-celler i autoimmune patologi er stadig vigtigere.

Trods fordelene ved at anvende større proteinantigener at inducere EAE, er der stadig nogle kommercielt tilgængelige kilder for sådanne proteiner. For selv korte peptider som MOG 35-55 kan syntetiseres meget hurtigt og til en relativt lav pris, de kommercielle muligheder for MOG protein er begrænsede, og omkostningerne væsentligt mere at købe. Ikke desto mindre er der flere ekspressionsvektorer til rådighed for forskergrupper til at generere MOG ekstracellulære domæne (MOG 1-125) selv. However, alle de ekspressionssystemer, som vi har identificeret i litteraturen er baseret på ældre teknologier, der siden er blevet erstattet med mere effektive ekspressionssystemer 7. Endvidere er de fleste er baseret på rotte- eller human MOG 8. For nogle undersøgelser af autoimmunitet i mus, et antigen baseret på musen MOG autoantigenet foretrækkes. Endelig har alle MOG-baserede proteiner, som vi har identificeret, enten kommercielle eller som ekspressionsvektorer, er fusionsproteiner indeholdende yderligere aminosyrer til MOG 1-125 basen. Disse omfatter et tag til oprensning og sædvanligvis andre sekvenser samt, hvoraf mange med en funktion vi ikke kunne identificere.

For at løse disse begrænsninger, genereret vi en hidtil ukendt fusionsprotein baseret på musen MOG ekstracellulære domæne fusioneret til et mærke indeholdende thioredoxin at bekæmpe den kendte uopløselighed MOG protein 5. Tag-sekvensen indeholder også en 6xHis sekvens for oprensning og en TEV protease cleavage site, der muliggør fuldstændig fjernelse af alle tag-sekvenserne, hvis det ønskes. Dette er den eneste metode, som vi er opmærksomme på at generere ren MOG 1-125 protein. For at lette produktionen af store mængder protein, det MOG 1-125 sekvensen blev kodon-optimeret til bakteriel ekspression og MOG tag fusionsproteinet blev indsat i pET-32 ekspressionssystem. Her beskriver vi i detaljer protokollen til at producere og rense MOG tag protein, og ren MOG 1-125, ved hjælp af ikke-specialiseret udstyr til rådighed for de fleste immunologi laboratorier.

Protocol

1. Protein Induktion BEMÆRK: I de følgende trin, BL21 Escherichia coli-bakterier transformeret med en PET-32 vektor, der indeholder sekvensen for MOG tag fusionsproteinet (se reference 5 og figur 1) dyrkes til høje tætheder og derefter induceret til at udtrykke MOG tag protein . Se figur 2 for den samlede tidslinje – bemærk, at dagen er omtrentlige og alternative stop-punkter er noteret i protokollen. Hvis man sta…

Representative Results

Når oprensningen er fuldført, prøver opsamlet i trin 1.4, 2.1, 3.4, og slutproduktet fra trin 6.4 skal køres på et protein gel (figur 3A). MOG tag bør først fremstå som en 31,86 kDa bånd i T O / N prøve, men ikke t 0, og bør være det eneste band i det endelige rent produkt. For at teste, om MOG tag protein er korrekt foldet, kan MOG tag proteinet anvendes til mærkning MOG-protein specifikke B-celler ved …

Discussion

Her har vi beskrevet en protokol for produktion af MOG tag protein og hvordan man kan generere ren MOG 1-125 fra MOG tag protein. Denne protokol er baseret både på standard His-mærke baseret proteinoprensningsmetoder, samt en tidligere beskrevet protokol for frembringelse af en ældre MOG-baserede protein 15. Selvom det ikke beskrives her, den primære brug af MOG tag protein er at inducere EAE gennem immunisering med proteinantigen. En protokol der beskriver, hv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.

Materials

BL21 E.coli– pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
  9. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , (2016).
  10. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).

Play Video

Cite This Article
Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

View Video