Enkel og effektiv produktion og oprensning af Mouse Myelin oligodendrocyt Glycoprotein for Eksperimentel Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Summary

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4⁺ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOG_tag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG_1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOG_tag or MOG_1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOG_tag protein. Immunization with either MOG_tag or MOG_1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introduction

MS er en human sygdom karakteriseret ved kronisk inflammation og neurodegeneration af CNS, som menes at være drevet af en autoimmun reaktion rettet mod myelin. Tabet af myelin og axoner over tid resultere i gradvis nedgang af kognitiv og motorisk funktion ^1. "Experimental Autoimmune Encephalomyelitis" er en samlebetegnelse for dyremodeller for autoimmun sygdom rettet mod CNS myelin. Som menneskelige MS, er EAE typisk kendetegnet ved immun celle infiltration af CNS og i nogle tilfælde, demyelinisering ^2. Men i hvilken grad en given EAE model ligner human MS delvis afhænger af art eller stamme anvendes, og af kompleksiteten af ​​den underliggende anti-myelin autoimmun reaktion.

Anti-myelin autoimmunitet kan eksperimentelt induceret på flere måder, men den mest almindelige metode i dag er at immunisere mus med et kort peptid af aminosyrer efterligner den immunodominante CD4 <sup> + T-celleepitop af et myelinprotein. Dette repræsenterer minimumskravet til at inducere en patogen respons. Måske den mest almindelige af disse er en 21 aminosyre peptid afledt fra myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG _35-55), som anvendes til at inducere EAE i C57BL / 6-mus ^3. For nogle eksperimentelle formål er det imidlertid ønskeligt eller endog nødvendigt at immunisere med større proteinantigener og faktisk er der flere fordele ved denne end immunisering med kort peptid. Første på grund af MHC-restriktion, korte peptider er sædvanligvis kun effektive i et meget begrænset udvalg af stammer, mens større proteinantigener repræsenterer enten hele proteinet eller et bestemt domæne kan behandles normalt til præsentation i flere indavlede musestammer eller endog i forskellige arter ^fire. Sekund, et større protein-antigen er i stand til at inducere en mere kompleks immunrespons inkorporerer flere typer af lymfocytter i antigengenkendelse, snarere end limiting antigengenkendelse til CD4 ⁺ T-celler. For eksempel B-celler via deres B-celle receptor (BCR) interagere direkte med hele snarere end forarbejdet protein. Vi og andre har vist, at B-celler aktiveres af MOG _35-55 immunisering ikke anerkender MOG protein ^5. Da B-celler for nylig blev påvist at spille en patogen rolle i human MS ^6, EAE-modeller, der inkorporerer B-celler i autoimmune patologi er stadig vigtigere.

Trods fordelene ved at anvende større proteinantigener at inducere EAE, er der stadig nogle kommercielt tilgængelige kilder for sådanne proteiner. For selv korte peptider som MOG _35-55 kan syntetiseres meget hurtigt og til en relativt lav pris, de kommercielle muligheder for MOG protein er begrænsede, og omkostningerne væsentligt mere at købe. Ikke desto mindre er der flere ekspressionsvektorer til rådighed for forskergrupper til at generere MOG ekstracellulære domæne (MOG _1-125) selv. However, alle de ekspressionssystemer, som vi har identificeret i litteraturen er baseret på ældre teknologier, der siden er blevet erstattet med mere effektive ekspressionssystemer ^7. Endvidere er de fleste er baseret på rotte- eller human MOG ^8. For nogle undersøgelser af autoimmunitet i mus, et antigen baseret på musen MOG autoantigenet foretrækkes. Endelig har alle MOG-baserede proteiner, som vi har identificeret, enten kommercielle eller som ekspressionsvektorer, er fusionsproteiner indeholdende yderligere aminosyrer til MOG _1-125 basen. Disse omfatter et tag til oprensning og sædvanligvis andre sekvenser samt, hvoraf mange med en funktion vi ikke kunne identificere.

For at løse disse begrænsninger, genereret vi en hidtil ukendt fusionsprotein baseret på musen MOG ekstracellulære domæne fusioneret til et mærke indeholdende thioredoxin at bekæmpe den kendte uopløselighed MOG protein ^5. Tag-sekvensen indeholder også en 6xHis sekvens for oprensning og en TEV protease cleavage site, der muliggør fuldstændig fjernelse af alle tag-sekvenserne, hvis det ønskes. Dette er den eneste metode, som vi er opmærksomme på at generere ren MOG _1-125 protein. For at lette produktionen af store mængder protein, det MOG _1-125 sekvensen blev kodon-optimeret til bakteriel ekspression og MOG _tag fusionsproteinet blev indsat i pET-32 ekspressionssystem. Her beskriver vi i detaljer protokollen til at producere og rense MOG _tag protein, og ren MOG _1-125, ved hjælp af ikke-specialiseret udstyr til rådighed for de fleste immunologi laboratorier.

Protocol

1. Protein Induktion BEMÆRK: I de følgende trin, BL21 Escherichia coli-bakterier transformeret med en PET-32 vektor, der indeholder sekvensen for MOG tag fusionsproteinet (se reference 5 og figur 1) dyrkes til høje tætheder og derefter induceret til at udtrykke MOG tag protein . Se figur 2 for den samlede tidslinje – bemærk, at dagen er omtrentlige og alternative stop-punkter er noteret i protokollen. Hvis man sta…

Representative Results

Når oprensningen er fuldført, prøver opsamlet i trin 1.4, 2.1, 3.4, og slutproduktet fra trin 6.4 skal køres på et protein gel (figur 3A). MOG tag bør først fremstå som en 31,86 kDa bånd i T O / N prøve, men ikke t 0, og bør være det eneste band i det endelige rent produkt. For at teste, om MOG tag protein er korrekt foldet, kan MOG tag proteinet anvendes til mærkning MOG-protein specifikke B-celler ved …

Discussion

Her har vi beskrevet en protokol for produktion af MOG _tag protein og hvordan man kan generere ren MOG _1-125 fra MOG _tag protein. Denne protokol er baseret både på standard His-mærke baseret proteinoprensningsmetoder, samt en tidligere beskrevet protokol for frembringelse af en ældre MOG-baserede protein ^15. Selvom det ikke beskrives her, den primære brug af MOG _tag protein er at inducere EAE gennem immunisering med proteinantigen. En protokol der beskriver, hv…

Materials

BL21 E.coli– pet32-MOGtag	Kerfoot lab		These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	bio basic	AB0028	Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme	Bioshop	LYS702.10	Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Phosphate buffered saline	life technologies	20012-027	Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	The quality must be greater than 98% purity.
0.5M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nickel (II) sulfate	Bioshop	NIC700.500
His bind resin	EMD Millipore	69670-3	Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol	Commercial Alcohols	P016EAAN	Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid	Bioshop	ACE222.1
Sodium acetate trihydrate	Bioshop	SAA305.500
bovine serum albumin standard	bio-rad	500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate	bio-rad	500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate	Fisher scientific	BP120-500
Tris-base	Bioshop	TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing	Thermoscientific	68700
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148-25ml	This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease	lifetechnologies	12575-015	Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350	Bioshop	PEG335.1
polyethyleneglycol 8000	Bioshop	PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate	ebioscience	44-2404-21
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Eon microplate spectrometer	Biotek	11-120-611	This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software	BioTek
sodium dodecyl sulphate	Bioshop	SDS001
bromophenol blue	Bioshop	BRO777
Glycerol	Bioshop	GLY001
Protein desalting columns	Thermoscientific	89849
Glycine	Bioshop	GLN001
precast 12% polyacrylamide gel	bio-rad	456-1045
Rapid stain reagent	EMD Millipore	553215
Gel dock EZ imager	bio-rad	1708270
White Light Sample Tray	bio-rad	1708272	Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder	bio-rad	1610375