Summary

Enkel och effektiv produktion och rening av mus Myelin Oligodendrocyte Glykoprotein för experimentell autoimmun encefalomyelit Studies

Published: October 27, 2016
doi:

Summary

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introduction

MS är en sjukdom hos människor som kännetecknas av kronisk inflammation och neurodegeneration i CNS som tros för att drivas av en autoimmun respons riktas mot myelin. Förlusten av myelin och axoner över tiden resultera i den gradvisa minskningen av kognitiv och motorisk funktion 1. "Experimentell autoimmun encefalomyelit" är ett samlingsnamn för djurmodeller av autoimmun sjukdom riktad mot CNS myelin. Som mänskliga MS, är EAE kännetecknas typiskt av immuncellinfiltration av CNS och, i vissa fall, demyelinering 2. Men i vilken utsträckning en viss EAE-modellen liknar human MS delvis beror på arten eller stam som används och komplexiteten i den underliggande anti-myelinautoimmunt svar.

Anti-myelin autoimmunitet kan experimentellt inducerad på flera sätt, men den vanligaste metoden som används idag är att immunisera möss med en kort peptid av aminosyror som imiterar den immunodominanta CD4 <supp> + T-cellepitop av en myelinprotein. Detta motsvarar minimikravet för att framkalla en patogen respons. Kanske den vanligaste av dessa är ett 21 aminosyrapeptid härledd från myelin oligodendrocyt-glykoprotein (MOG 35-55), som används för att inducera EAE hos C57Bl / 6-möss tre. Men det är för vissa försöksändamål önskvärd eller ens nödvändigt att immunisera med större proteinantigener och faktiskt det finns flera fördelar med detta över immunisering med kort peptid. Först på grund av MHC-restriktion, korta peptider är oftast bara effektiva i ett mycket begränsat antal av stammar, medan större proteinantigener som representerar antingen hela proteinet eller en specifik domän kan behandlas normalt för presentation i flera stammar inavlade mus eller ens i olika arter 4. För det andra är en större proteinantigen med förmåga att inducera en mer komplex immunsvar som innefattar flera typer av lymfocyter i antigenigenkänning, snarare än limiting antigen-igenkänning till CD4 + T-celler. Till exempel, B-celler via sin B-cellsreceptor (BCR) interagera direkt med hela snarare än bearbetat protein. Vi och andra har visat att B-celler aktiveras av MOG 35-55 immunisering inte känner igen MOG protein 5. Eftersom B-celler har nyligen visat sig spela en patogen roll i människans MS 6, EAE-modeller som innehåller B-celler vid autoimmun patologi blir allt viktigare.

Trots fördelarna med att använda större proteinantigener för att inducera EAE, kvarstår några kommersiellt tillgängliga källor för sådana proteiner. Faktiskt, medan korta peptider som MOG 35-55 kan syntetiseras mycket snabbt och till en relativt låg kostnad, de kommersiella alternativ för MOG-proteinet är begränsade och kostnad betydligt mer att köpa. Det finns dock flera expressionsvektorer tillgängliga för forskargrupper att generera MOG extracellulära domänen (MOG 1-125) själva. However, alla uttryckssystem som vi har identifierat i litteraturen är baserade på äldre tekniker som sedan har ersatts med mer effektiva uttryckssystem 7. Vidare är de flesta är baserade på råtta eller människa MOG 8. För vissa undersökningar av autoimmunitet hos möss, är en antigenbaserade på musen MOG autoantigen föredra. Slutligen, alla MOG-baserade proteiner som vi har identifierat, antingen kommersiella eller som expressionsvektorer, är fusionsproteiner som innehåller ytterligare aminosyror till MOG 1-125 bas. Dessa inkluderar en tagg för rening och oftast andra sekvenser också, många med en funktion som vi inte kunde identifiera.

Ta itu med dessa begränsningar, genererade vi ett nytt fusionsprotein baserat på musen MOG extracellulära domänen fusionerad till en tagg som innehåller tioredoxin att bekämpa den kända olösligheten av MOG-protein 5. Markörsekvensen innehåller även en 6xHis-sekvens för rening och en TEV-proteas cleAvage webbplats som gör det möjligt att fullständigt avlägsnande av alla taggsekvenser, om så önskas. Detta är den enda metod som vi är medvetna om att generera ren MOG 1-125 protein. För att underlätta produktion av stora mängder protein, den MOG 1-125 sekvensen kodon-optimerad för bakteriell expression och MOG tagg fusionsproteinet sattes in i pET-32 expressionssystem. Här beskriver vi i detalj protokollet för att producera och rena MOG tag protein och ren MOG 1-125, med användning av icke-specialiserad utrustning som finns tillgänglig för de flesta immunologi laboratorier.

Protocol

1. Protein Induktion OBS: I följande steg, BL21 Escherichia coli bakterier transformerade med en Pet-32 vektor innehållande sekvensen för MOG tag fusionsprotein (se referens 5 och Figur 1) odlas till höga densiteter och därefter induceras att uttrycka MOG tag proteinet . Se figur 2 för den totala tidslinjen – Observera att dagarna är ungefärliga och alternativa stoppställen noteras i protokollet. Om börjar me…

Representative Results

När reningen är klar prover i steg 1,4, 2,1, 3,4, och den slutliga produkten från steg 6,4 bör köras på en proteingel (figur 3A). MOG taggen ska först visas som en kDa band i T O / N prov 31,86, men inte t 0, och bör vara det enda bandet i den slutliga ren produkt. För att testa om MOG tag proteinet har rätt vikt, kan MOG tag proteinet användas för att märka MOG-proteinspecifika B-celler genom FACS. Geno…

Discussion

Här har vi beskrivit ett protokoll för produktion av MOG tag protein och hur man skapar ren MOG 1-125 från MOG tag proteinet. Detta protokoll är baserad både på standard His-tagg baserade proteinreningsmetoder, liksom tidigare beskrivna protokollet för generering av en äldre MOG-baserade protein 15. Även om det inte beskrivs här, är den primära användningen av MOG tag protein för att inducera EAE genom immunisering med proteinantigen. Ett protokoll som…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.

Materials

BL21 E.coli– pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
  9. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , (2016).
  10. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).

Play Video

Cite This Article
Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

View Video