Enkel och effektiv produktion och rening av mus Myelin Oligodendrocyte Glykoprotein för experimentell autoimmun encefalomyelit Studies

Summary

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4⁺ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOG_tag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG_1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOG_tag or MOG_1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOG_tag protein. Immunization with either MOG_tag or MOG_1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introduction

MS är en sjukdom hos människor som kännetecknas av kronisk inflammation och neurodegeneration i CNS som tros för att drivas av en autoimmun respons riktas mot myelin. Förlusten av myelin och axoner över tiden resultera i den gradvisa minskningen av kognitiv och motorisk funktion ^1. "Experimentell autoimmun encefalomyelit" är ett samlingsnamn för djurmodeller av autoimmun sjukdom riktad mot CNS myelin. Som mänskliga MS, är EAE kännetecknas typiskt av immuncellinfiltration av CNS och, i vissa fall, demyelinering ^2. Men i vilken utsträckning en viss EAE-modellen liknar human MS delvis beror på arten eller stam som används och komplexiteten i den underliggande anti-myelinautoimmunt svar.

Anti-myelin autoimmunitet kan experimentellt inducerad på flera sätt, men den vanligaste metoden som används idag är att immunisera möss med en kort peptid av aminosyror som imiterar den immunodominanta CD4 <supp> + T-cellepitop av en myelinprotein. Detta motsvarar minimikravet för att framkalla en patogen respons. Kanske den vanligaste av dessa är ett 21 aminosyrapeptid härledd från myelin oligodendrocyt-glykoprotein (MOG _35-55), som används för att inducera EAE hos C57Bl / 6-möss ^tre. Men det är för vissa försöksändamål önskvärd eller ens nödvändigt att immunisera med större proteinantigener och faktiskt det finns flera fördelar med detta över immunisering med kort peptid. Först på grund av MHC-restriktion, korta peptider är oftast bara effektiva i ett mycket begränsat antal av stammar, medan större proteinantigener som representerar antingen hela proteinet eller en specifik domän kan behandlas normalt för presentation i flera stammar inavlade mus eller ens i olika arter ^4. För det andra är en större proteinantigen med förmåga att inducera en mer komplex immunsvar som innefattar flera typer av lymfocyter i antigenigenkänning, snarare än limiting antigen-igenkänning till CD4 ⁺ T-celler. Till exempel, B-celler via sin B-cellsreceptor (BCR) interagera direkt med hela snarare än bearbetat protein. Vi och andra har visat att B-celler aktiveras av MOG _35-55 immunisering inte känner igen MOG protein ^5. Eftersom B-celler har nyligen visat sig spela en patogen roll i människans MS ^6, EAE-modeller som innehåller B-celler vid autoimmun patologi blir allt viktigare.

Trots fördelarna med att använda större proteinantigener för att inducera EAE, kvarstår några kommersiellt tillgängliga källor för sådana proteiner. Faktiskt, medan korta peptider som MOG _35-55 kan syntetiseras mycket snabbt och till en relativt låg kostnad, de kommersiella alternativ för MOG-proteinet är begränsade och kostnad betydligt mer att köpa. Det finns dock flera expressionsvektorer tillgängliga för forskargrupper att generera MOG extracellulära domänen (MOG _1-125) själva. However, alla uttryckssystem som vi har identifierat i litteraturen är baserade på äldre tekniker som sedan har ersatts med mer effektiva uttryckssystem ^7. Vidare är de flesta är baserade på råtta eller människa MOG ^8. För vissa undersökningar av autoimmunitet hos möss, är en antigenbaserade på musen MOG autoantigen föredra. Slutligen, alla MOG-baserade proteiner som vi har identifierat, antingen kommersiella eller som expressionsvektorer, är fusionsproteiner som innehåller ytterligare aminosyror till MOG _1-125 bas. Dessa inkluderar en tagg för rening och oftast andra sekvenser också, många med en funktion som vi inte kunde identifiera.

Ta itu med dessa begränsningar, genererade vi ett nytt fusionsprotein baserat på musen MOG extracellulära domänen fusionerad till en tagg som innehåller tioredoxin att bekämpa den kända olösligheten av MOG-protein ^5. Markörsekvensen innehåller även en 6xHis-sekvens för rening och en TEV-proteas cleAvage webbplats som gör det möjligt att fullständigt avlägsnande av alla taggsekvenser, om så önskas. Detta är den enda metod som vi är medvetna om att generera ren MOG _1-125 protein. För att underlätta produktion av stora mängder protein, den MOG _1-125 sekvensen kodon-optimerad för bakteriell expression och MOG _tagg fusionsproteinet sattes in i pET-32 expressionssystem. Här beskriver vi i detalj protokollet för att producera och rena MOG _tag protein och ren MOG _1-125, med användning av icke-specialiserad utrustning som finns tillgänglig för de flesta immunologi laboratorier.

Protocol

1. Protein Induktion OBS: I följande steg, BL21 Escherichia coli bakterier transformerade med en Pet-32 vektor innehållande sekvensen för MOG tag fusionsprotein (se referens 5 och Figur 1) odlas till höga densiteter och därefter induceras att uttrycka MOG tag proteinet . Se figur 2 för den totala tidslinjen – Observera att dagarna är ungefärliga och alternativa stoppställen noteras i protokollet. Om börjar me…

Representative Results

När reningen är klar prover i steg 1,4, 2,1, 3,4, och den slutliga produkten från steg 6,4 bör köras på en proteingel (figur 3A). MOG taggen ska först visas som en kDa band i T O / N prov 31,86, men inte t 0, och bör vara det enda bandet i den slutliga ren produkt. För att testa om MOG tag proteinet har rätt vikt, kan MOG tag proteinet användas för att märka MOG-proteinspecifika B-celler genom FACS. Geno…

Discussion

Här har vi beskrivit ett protokoll för produktion av MOG _tag protein och hur man skapar ren MOG _1-125 från MOG _tag proteinet. Detta protokoll är baserad både på standard His-tagg baserade proteinreningsmetoder, liksom tidigare beskrivna protokollet för generering av en äldre MOG-baserade protein ^15. Även om det inte beskrivs här, är den primära användningen av MOG _tag protein för att inducera EAE genom immunisering med proteinantigen. Ett protokoll som…

Materials

BL21 E.coli– pet32-MOGtag	Kerfoot lab		These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	bio basic	AB0028	Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme	Bioshop	LYS702.10	Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Phosphate buffered saline	life technologies	20012-027	Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	The quality must be greater than 98% purity.
0.5M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nickel (II) sulfate	Bioshop	NIC700.500
His bind resin	EMD Millipore	69670-3	Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol	Commercial Alcohols	P016EAAN	Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid	Bioshop	ACE222.1
Sodium acetate trihydrate	Bioshop	SAA305.500
bovine serum albumin standard	bio-rad	500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate	bio-rad	500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate	Fisher scientific	BP120-500
Tris-base	Bioshop	TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing	Thermoscientific	68700
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148-25ml	This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease	lifetechnologies	12575-015	Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350	Bioshop	PEG335.1
polyethyleneglycol 8000	Bioshop	PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate	ebioscience	44-2404-21
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Eon microplate spectrometer	Biotek	11-120-611	This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software	BioTek
sodium dodecyl sulphate	Bioshop	SDS001
bromophenol blue	Bioshop	BRO777
Glycerol	Bioshop	GLY001
Protein desalting columns	Thermoscientific	89849
Glycine	Bioshop	GLN001
precast 12% polyacrylamide gel	bio-rad	456-1045
Rapid stain reagent	EMD Millipore	553215
Gel dock EZ imager	bio-rad	1708270
White Light Sample Tray	bio-rad	1708272	Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder	bio-rad	1610375