Abstract
Die Identifizierung von funktionellen Fahrer Ereignisse in der Krebstherapie ist von zentraler Bedeutung, unser Verständnis der Krebsbiologie und unverzichtbar für die Entdeckung der nächsten Generation neuartiger Medikamente zu fördern. Es zeichnet sich ab, dass komplexere Modelle von Krebs sind vollständig erforderlich , um die Faktoren zu schätzen wissen , die Tumorentstehung in vivo fahren und die Wirksamkeit neuer Therapien erhöhen, die den Übergang von der präklinischen Modellen zu klinischen Studien zu machen.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Erzeugung von gleichmäßigen und reproduzierbaren Tumorsphäroide, die siRNA funktionelles Screening unterzogen werden kann. Diese Sphäroiden zeigen viele Merkmale, die in soliden Tumoren gefunden werden, die in der traditionellen Kultur Zwei-Dimension nicht vorhanden sind. Wir zeigen, dass mehrere häufig verwendete Brustkrebszelllinien zu diesem Protokoll zugänglich sind. Darüber hinaus stellen wir Proof-of-Principle-Daten, die die Brustkrebszelllinie BT474 verwendet wird, bestätigt ihreAbhängigkeit von Verstärkung des Faktor-Rezeptor des epidermalen Wachstums HER2 und Mutation von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat-3-Kinase (PIK3CA), wenn sie als Tumorsphäroide gewachsen. Schließlich sind wir die räumliche Wirkung dieser Abhängigkeiten Immunhistochemie weiter zu untersuchen können und bestätigen.
Introduction
Solide Tumoren zeigen signifikante histologischen, genetischen und mikroUmwelt intratumorale Heterogenität, die Patienten in der Lage, Klinikern eine große Herausforderung stellt erfolgreich zu behandeln. Die Mehrzahl der Modelle Roman zu identifizieren, zielgerichtete Therapien integrieren nicht viele dieser Funktionen. Tatsächlich aktuellen zielgerichtete Therapien in der Klinik verwendet wurden in den letzten zehn Jahren beschäftigt Screening Ansätze entwickelt, die unter zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen auf Krebszelllinien angewiesen gezüchtet. Obwohl dies über verschiedene Erfolge, wie Rezeptor - Tyrosin - Kinase - Inhibitoren gebracht hat, wird immer offensichtlich , dass komplexere Modelle von Krebs erforderlich sind , um vollständig die Faktoren erkennen , die Tumorigenese in vivo und erhöhen die Anzahl neuer Therapien fahren , die den Übergang von vorklinischen Modellen zu klinischen Studien. Darüber hinaus ist es nun auch ersichtlich , dass 2D - Kultursysteme zu reflektieren scheiternvivo Verhalten 1,2. Zum Beispiel in schlecht vaskularisierten Tumoren, da die Nachfrage nach Sauerstoff und Nährstoffen in der Mikroumgebung überflügeln Versorgung, Regionen mit hoher und niedriger Lieferungen entwickeln. Die Anwesenheit von geringen Sauerstoff (Hypoxie) in Tumoren, wie durch die immunhistochemische Färbung von Tumorschnitten für etablierte hypoxischen Marker wie Carboanhydrase IX (CAIX) detektiert wird , korreliert mit einem schlechteren klinischen Ergebnis in Brustkrebs 3,4 Somit beinhaltet Funktionen wie Hypoxie in Screening - Modelle verbessern können unsere Fähigkeit , neue Angriffspunkte für Medikamente zu entdecken , die in vivo wirksamer sein wird. Tatsächlich erfolgreich Targeting aggressive Tumoren , die Hypoxie enthalten ist eine klinische Priorität 5.
Die Verfälschung von herkömmlichen 2D-siRNA-Screening, in einem Versuch, genauer Elemente der von den Krebszellen in der Tumormikroumgebung angetroffen Bedingungen rekapitulieren, hat zur Identifizierung mehrerer Gene führte that wurden für das Tumorwachstum in vivo wichtig erwiesen. Dazu gehören funktionelle Genom Bildschirme durchgeführt unter niedrigen Serum - Bedingungen 6, hypoxischen Bedingungen 7 und in Kombination 8. Zum Beispiel silencing von 6-Phosphofructo-2-Kinase / Fruktose-2,6-bisphosphatase 4 (PFKFB4), ein Protein verantwortlich für die Regulierung Kohlenstoff eintritt Glykolyse, nur apoptosis in Prostatakarzinom Linien von Metastasierung abgeleitet induziert, wenn in niedrigen Serum gezüchtet. Silencing von PFKFB4 in normalen Prostatazelllinien unter den gleichen Bedingungen hatte keine Wirkung, während Erschöpfung der PFKFB4 vollständig das Wachstum von Prostata - Krebszelllinie Xenotransplantaten 6 abgetragenen.
In einer erweiterten Gruppe von Brustkrebs-Zelllinien, führte das Silencing von mono-Carboxylase Transporter 4 (MCT4) bevorzugt zur Verringerung der Zelllinie Wachstum unter den Bedingungen der niedrigen Sauerstoff. Diese Schwachstelle wurde in vivo in Brustkrebs-Zelllinie orthotroper xenogra validiertfts. Vielleicht auffallend meisten Silencing von Acetyl-CoA-Synthetase-2 (ACSS2), ein Enzym, das zur Umwandlung von Acetat in Acetyl-CoA, reduziert Krebszellzahl unter Nährstoffstressbedingungen (niedrige Sauerstoff und Serum), aber hatte wenig oder keine Wirkung unter normalen Kulturbedingungen 8. Abtragung von ACSS2 beeinflusst das Wachstum von Brust- und Prostatakrebs Xenotransplantaten was darauf hindeutet , dass die Nährstoff Gradienten existieren nicht isoliert in der Tumor - Mikroumgebung und dass Zellen , die 8 für die Tumorprogression wesentlich in diesen Regionen befinden sind. Darüber hinaus 9,10, was darauf hindeutet , dass eine erhöhte ACSS2 Aktivität in Tumoren könnte ein grundlegender Mechanismus sein , dass das Wachstum unter ungünstigen Bedingungen unterstützt als wichtig bei Glioblastom und hepatozellulären Karzinomen ACSS2 wurde auch gefunden.
Zusammengefasst beweisen diese Studien , dass die Bedingungen in vivo angetroffen rekapituliert und Durchführung siRNA - Bildschirme für die Identifizierung von g erlaubtenen von wesentlicher Bedeutung für Krebs Überleben. Neben 2D - Wachstum von Krebszellen unter Nährstoffstressbedingungen beeinflussen, Erschöpfung von Zielgenen in diesen Studien gehemmt Sphäroid Wachstum Krebszelllinie, Spiegeln , was in Tumorxenografte 6,8 beobachtet wurde. So enthalten Krebszelllinie Sphäroiden mehrere der Bedingungen im Tumormikromilieu angetroffen, die Empfindlichkeit gegenüber ACSS2 Silencing verleihen. Tatsächlich zeigen Sphäroide Nährstoff Gradienten (Serum und Sauerstoff), Veränderungen in pH, dreidimensionale (3D) Zell-Zell-Kontakt, sondern auch Veränderungen in proliferative celerity mit Zellen, Zellzyklusarrest und Apoptose unterzogen. Dies wird veranschaulicht durch die Anwesenheit in Krebs Sphäroide nekrotischer Bereiche, ein Merkmal nicht in herkömmlichen 2D-Kultur gefunden.
kleine Molekül-Inhibitoren zu screenen, aber dies ermöglicht nur für die Validierung der Verbindung Wirksamkeit oder die Umwidmung von Kompo Krebszelle Sphäroiden wurden bereits als biologisch relevanten Modelle verwendet wordenunds ursprünglich entwickelt für andere Krankheiten 11. Strom Sphäroid Screeningverfahren für die Analyse von spezifischen Gens Verarmungs nicht in einem Hochdurchsatz-Hoch Gehalt Weise ermöglichen. Hier beschreiben wir zum ersten Mal, eine funktionelle Genomik-Pipeline für die Aufdeckung spezifischer Gen-Abhängigkeiten unter Verwendung von small interfering RNA (siRNA) Technologie in der Krebszelllinie Sphäroiden. Wir haben eine maßgeschneiderte Bibliothek mit siRNAs die 200 am häufigsten mutierten Gene in menschlichen Brustkrebs und bewertet die Auswirkungen der Gen-Depletion auf Sphäroid Größe und die metabolische Aktivität in BT474 Brustkrebs Sphäroiden Targeting. Wir konnten robust und reproduzierbar die Auswirkungen von ERBB2 und PIK3CA-Silencing in 3D Kulturen erkennen. Außerdem konnten wir die Auswirkungen von Gen Depletion auf die räumliche Architektur von BT474 Sphäroide beurteilen Immunhistochemie.
Protocol
1. Herstellung von 96-Well-Platten siRNA
HINWEIS: Die Außenkanten einer 96-Well-Platte sind anfälliger für Verdampfung im Vergleich zu anderen Vertiefungen begrenzen somit die Menge an siRNAs bis 60 pro 96-well-Platte. Füllen Sie äußere Brunnen mit klarem Medium oder PBS diese zu begrenzen. Darüber hinaus wird ein Validierungs Bildschirm Zugriffe empfohlen Platte Vorurteile zu lindern.
- Verdünnen Sie die siRNAs auf 250 bis 500 ng / & mgr; l in reduzierten Serummedium (gemäß den Empfehlungen des Herstellers) und aliquote 10 ul in die entsprechenden Vertiefungen der Ultra-Low-Befestigungsplatte. Führen Sie alle Bildschirme in dreifacher Ausfertigung.
HINWEIS: Integrieren geeigneten nicht-Targeting (negativ) und zu töten (positiv, wie UBB und PLK1) siRNA Kontrollen in der Plattendesign Transfektionseffizienz, um sicherzustellen, beurteilt werden. Die Verwendung von Low-Befestigungsplatten für die siRNA Arbeit kritisch ist, als Zellen zur Transfektion Mischung gegeben werden. Wir können nicht ausschließen, dass einige Hersteller Ultra-Low-BefestigungPlatten können subtile Effekte auf Sphäroid Wachstum haben. Als solches empfehlen wir, dass diese durch den Endverbraucher getestet werden. - Abdeckplatten mit Klebedichtungen und bei -20 ° C.
2. Reverse-Transfektion von Zelllinien
- Am Tag des Bildschirms, auftauen die Platten bei Raumtemperatur und Spin für 5 min bei 1000 × g eine Tischzentrifuge verwenden. In 10 ul reduziert Serum-Medium, das die optimierte-Transfektionsreagenz in jede Vertiefung einer Mehrkanalpipette mit. Lassen Platten für 15 min zur Transfektion Komplexe, die siRNA zu bilden.
ANMERKUNG: Diese Studie der Brustkrebs-Zelllinie BT474 für funktionelle genomische Screening (kultiviert in glucosereichem DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika) verwendet. - Verwendung geeigneten Volumen Zellinie spezif trypsinize die Zellen gescreent werden (0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA), bis sie aus dem Kolben abzulösen, Neutralisierenic Medium und Spin für 5 min bei 1000 × g auf einer Tischzentrifuge Trypsin zu entfernen. Die Zellen mit einem geeigneten Volumen des Mediums und bestimmen Anzahl genaue Zelle einen Zellenzähler verwendet wird.
HINWEIS: In der Regel 5.000 Zellen pro Vertiefung für Sphäroidformation getestet in den meisten Zelllinien ausreichend sind. Es ist wichtig, genau die Zellen als eine Einzelzellsuspension für die genaue Größenvergleiche zählen. - Verdünnte Zellen zu 5000 Zellen pro 180 & mgr; l in kaltes Medium (4 ° C).
HINWEIS: Die Zugabe von rekonstituierten Basalmembran Matrixkomponenten werden negativ Transfektionseffizienz auswirken und es wird empfohlen, dass es nicht verwendet wird. Die Zelllinie Optimierung Sphäroid Bildungsfähigkeit und Zuschlags Wirksamkeit zu bestätigen, sollte vor dem Bildschirm ausgeführt werden. - Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Reservoir, Pipette zu mischen und fügen 180 ul zu jeder Vertiefung der 96-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte enthält, die siRNA zuvor hergestellten (2.1).
- Centrifuge die Platte bei 1000 xg in einer vorgekühlten Zentrifuge 4 ° C für 10 min und dann wieder auf 37 ° C Gewebekultur-Inkubator.
- HINWEIS: Die Zellen als Mosaik im Boden der Vertiefungen erscheinen. Im Laufe der nächsten 12 - 24 h aggregieren die Zellen zusammen eine einzelne Kugel zu bilden.
- Nach 24 h beobachten die Zellen in der Mitte des Brunnens eine einzelne Sphäroid bilden. Je 100 & mgr; l Vollmedium zu jeder Vertiefung Wachstum zu fördern.
- Füllt Medium nach drei Tagen. Entfernen Sie vorsichtig 100 ul Medium aus jeder Vertiefung und mit 100 & mgr; l frisches Medium.
- Am Tag 7 quantifizieren die automatisierte Sphäroid Größe auf einem Plattenlesegerät, das quantitativ Sphäroid Wachstum im Laufe der Zeit zu überwachen (siehe Abschnitt 3).
- Danach bestimmen Lebensfähigkeit Zelle eines lumineszenten die Lebensfähigkeit der Zellen Farbstoff (siehe Abschnitt 4) verwendet wird.
3. Automatische Bildaufnahme
- Scannen Sie die Platten auf einem Tisch-Mikro-Well-Platte Zytometers am 7. Tag.
- <li> Öffnen Sie die Software, wählen Sie die folgenden Schritte aus: '96 -well Platte ", wählen Sie den entsprechenden Typenschild und geben Sie einen Testnamen. HINWEIS: Alle zusätzlichen Informationen auch in die Software hinzugefügt werden können.
- Wählen Sie die 'Tumorsphere' Anwendung. Ändern Sie den Fokus, so dass der Sphäroid im Fokus und hat einen optimalen Kontrast.
HINWEIS: Wir empfehlen 'Bild basiert Fokus "als bedeutende Schwankungen in Sphäroid Größen zu erwarten sind. - Wählen Sie die Brunnen, die Abtastung erfordern und "Scan starten".
- Mit der Platte Scanner-Software, stellen Sie sicher, dass die Objektmaske genau die Sphäroid Größe darstellt. Tun Sie dies , indem Sie die Koloniedurchmesser, Grenzerweiterung, Mindeststärke und Präzision Einstellungen anpassen, die spezifisch für jede Zelllinie getestet 11,12.
HINWEIS: Der Sphäroid Bereich wird dann berechnet werden, um die Software-Algorithmus. Zum Beispiel, um genau den Bereich des BT474 Sphäroiden berechnen für sieben Tage einstellen Präzision zu "hoch" ein gewachsend die minimalen Koloniedurchmesser bis 200 & mgr; M. Dies sollte eine geeignete Sphäroid Maske Vertreter der Sphäroid-Bereich erzeugen.
HINWEIS: Diese Daten können dann von der Maschine ausgeführt werden, die Export-Funktion verwenden, in der Form eines kommentierten Datendatei. Datum ist Platte Median normalisiert, kombiniert und analysiert entweder durch Z-Score oder streng standardisierte mittlere Differenz (SSMD) siRNAs zu identifizieren, die einen statistisch signifikanten Effekt auf Sphäroid Bereich hatte.
4. Bestimmung der Zell Viability
- Nach Sphäroid Bereich berechnet worden ist, bestimmen die Lebensfähigkeit eines lumineszenten Zelle Lebensfähigkeit Farbstoff verwendet. Bereiten Sie das Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Entfernen Sie vorsichtig 100 ul Medium aus jeder Vertiefung und mit 100 & mgr; l der Lebensfähigkeit Farbstoff. Die Platten für 15 Minuten dann scannen Sie ein Leuchtplattenlesegerät verwendet wird.
HINWEIS: Diese Daten können dann von der Maschine ausgeführt werden, die Export-Funktion verwenden, in indie Form eines kommentierten Datendatei. Datum ist Platte Median normalisiert, kombiniert und analysiert entweder durch Z-Score oder streng standardisierte mittlere Differenz (SSMD) siRNAs zu identifizieren, die einen statistisch signifikanten Effekt auf Sphäroid Lebensfähigkeit hatte.
Representative Results
Sphäroid - Assays in Ultra-Low - Befestigung 96-Well - Platten bieten einen hohen Durchsatz phänotypische Beurteilung für potenzielle Onkogenizität in einem Kontext, der mehr rekapituliert leicht die physiologischen in Tumoren in vivo gefunden Bedingungen. Tatsächlich zeigten die Krebszelllinien MCF10DCIS.com und BT474 Form eng Sphäroid Strukturen (Abbildung 1A) und immunhistologische Untersuchung von Sphäroid Abschnitte unterschiedliche räumliche Veränderungen der zellulären und Kernmorphologie. Im Laufe der Zeit entwickeln einige Sphäroiden wie BT474 Sphäroiden nekrotischen Regionen, ein gemeinsames Merkmal von aggressiven soliden Tumoren (Abbildung 1B). Einige Sphäroiden entwickeln keine nekrotischen Kerne, wie die MDA-MB-231 - Zelllinie, aber in der Proliferationsmarker Ki67, die invers korreliert mit gespaltenen caspsase-3 - Expression, einem Marker der Apoptose (Abbildung 1C) Anzeige markiert Variation tun. Um festzustellen, dass mehrere Zelllinien tatsächlich recep sindtive zu BT474 siRNA-vermittelte Gen-Silencing, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 und JIMT1 Zellen wurden für sieben Tage mit siRNA Reverse-transfiziert. Das Vorhandensein von Transfektionsreagenz (mock) oder Transfektion von Steuer siRNAs hatte keinen Einfluss auf Sphäroid Lebensfähigkeit, während des essentiellen Gens Ubiquitin B (UBB) deutlich reduziert Sphäroid Lebensfähigkeit in allen getesteten Zelllinien (1D) zum Schweigen zu bringen.
Wir haben eine menschliche siRNA-Bibliothek, die die am häufigsten mutierten Gene in nicht ausgewählten, ER + HER2 + und dreifach negativem Brustkrebs umfasst. Diese Bibliothek besteht aus Genen bekannter Funktion, wie MYC, PIK3CA und TP53 und diejenigen, deren Beitrag zur Karzinogenese wird nicht hergestellt. Der Bildschirm enthält auch mehrere Nicht-Targeting - Steuerung siRNAs (Control # 1, Control # 2) und siRNAs essentielle Gene Targeting, wie PLK1 und UBB, die wirken , als Kontrollen (Tabelle 1) zu töten. Wir wählten die Brust canc zu verwendener Zelllinien BT474, da sie ohne Zusatz von rekonstituierten Basalmembran leicht Sphäroide bilden, werden Arbeitspferd Zelllinien etabliert und einer bekannten genomischen Architektur aufweisen. Zum Beispiel sind BT474 - Zellen positiv für den Östrogenrezeptor (ER +), überexprimieren den humanen epidermalen Wachstumsfaktor - Rezeptor 2 (HER2 +) und Hafen Mutationen in TP53 (E285K) und PIK3CA (K111N) 13.
Verwendung des Protokolls oben dargelegt, überwacht wir die Auswirkungen Gen Abreicherung auf Sphäroid Größe und Lebensfähigkeit nach sieben Tagen von siRNA Rückwärts Transfektion (1E) hatten. Interessanterweise haben die meisten Gene hat keinen signifikanten Effekt auf die Sphäroid - Bereich oder die Lebensfähigkeit (2A). Silencing von FOXO3, PIK3CA, ErbB2 und SF3B1 führte zu den bedeutendsten reproduzierbare Reduktion der Sphäroid Größe. Diese Reduktion wurde auch in Sphäroid Lebensfähigkeit nach ErbB2 und SF3B1 Silencing beobachtet. Erfreulich ist, dass wir confIRMED die Auswirkungen von PIK3CA, ErbB2 und SF3B1 Silencing auf Sphäroid Größe Hellfeldmikroskopie (2B). Wir zuvor SF3B1 als essentielles Gen in zahlreichen Zelllinie Modelle identifiziert und stellt somit siSF3B1 eine gute Tötung Kontrolle zusätzlich zu UBB 14. Interessanterweise aller Gene 200 nur das Silencing von E-Cadherin in einer signifikanten Zunahme der Lebensfähigkeit Sphäroid (2A). Untersuchung der Sphäroid Morphologie zeigten , dass E-Cadherin - Silencing in einem vollständigen Zusammenbruch der Sphäroid - Architektur geführt, mit lebenden Zellen auf dem Boden der Nieder Befestigung ruht gut (2B). Manuelle Wiederaufnahme der Untersuchung des Sphäroiden Volumen Bildschirmdaten zeigten, dass dies hatte auch beobachtet worden, hatte aber aus dem Bereich Quantifizierung eliminiert aufgrund des Objekts über den eingestellten Größenbeschränkungen zu sein. Wie bereits hervorgehoben, überexprimiert BT474 Zellen den Rezeptor-Tyrosinkinase-HER2 und beherbergen eine onkogene Mutation in PIK3CA (K111N). Wir haben bestätigt , dass Silencing von ErbB2 und PIK3CA in reduzierter Sphäroid Lebensfähigkeit führte, während der Transfektion mit nicht-Targeting - Kontrollen keine Wirkung (2C) hatte.
Als nächstes untersuchten wir den Einfluss von siRNA Abreicherung auf Sphäroid Histologie. BT474 Sphäroiden wurden Reverse-transfiziert mit nicht-Targeting-Kontroll-siRNA und siRNAs Targeting PIK3CA, ErbB2 und UBB. Silencing von ErbB2 und UBB führte zu einer Verringerung der pro-proliferative Markers verglichen Ki67 siRNA (2D) zu steuern. Die Aktivierung des pro-apoptotische Marker gespalten Caspase-3 erst nach UBB-Silencing beobachtet wurde, dass die Depletion von HER2 und PIK3CA was darauf hindeutet, nicht in die Apoptose führte aber waren Zytostatikum eher als zytotoxische. Tatsächlich silencing von HER2 und PIK3CA hat in der Proteinexpression der Zellzyklus-Arrest-Protein p27 in einer Erhöhung im Vergleich zu transfizierten Sphäroide steuern.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass BT474 Zellen durch onkogene HER2 und PIK3CA angetrieben signalisieren, wenn sie als 3D-Sphäroiden gewachsen Noch wichtiger ist, zeigen diese Ergebnisse, dass es möglich ist, zu. Design und eine maßgeschneiderte siRNA Screening-Bibliothek von Hunderten von Genen in Krebszelllinie Sphäroiden robust und reproduzierbar umzusetzen.
Abbildung 1: Zelllinie Optimierung für 3-dimensionale Wachstum. A. Die Brustkrebs-Zelllinien, MCF10DCIS.com und BT474 wurden in niedrigen Befestigungsplatten für 7 Tage. Hell repräsentative Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop genommen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. B. MCF10DCIS.com und BT474 Sphäroide wurden für 28 Tage kultiviert. 4 Tage - 100 & mgr; l frisches Medium wurde alle drei wieder aufgefüllt. Sphäroide wurden in 3,8% Formaldehyd, e fixiertmBedded, geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Repräsentative Bilder werden bei niedrigen und hohen Vergrößerung gezeigt. Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m und 33 & mgr; m, respectively. C. MDA-MB-231 Sphäroiden wurden für 21 Tage kultiviert. 4 Tage - 100 & mgr; l frisches Medium wurde alle drei wieder aufgefüllt. Sphäroide wurden in 3,8% Formaldehyd, eingebettet, geschnitten und gefärbt mit Ki67 und gespalten Caspase-3 fixiert. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231, und JIMT1 Zelllinien wurden Reverse transfiziert mit mock (Transfektionsreagenz nur) und die Steuer siRNAs und UBB, ultra-low Befestigungsplatten wurden gesponnen dann Sphäroiden zu bilden. Frisches Medium (100 ul) wurde an den Tagen 1 zugegeben und 4. Nach 7 Tagen wurde die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von zwei unabhängigen biologischen dreifach durchgeführt Replikaten normalisiert # 1 zu steuern. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines unpa berechnetired Students t-Test (p <0,05). E. Ein Flussdiagramm , das die umgekehrte Transfektionsprotokoll zusammenfassend verwendet , um funktionell Gen in Abhängigkeit Krebszelllinie Sphäroide abzufragen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Functional Genomic Untersuchung von BT474 Sphäroiden Deckt Onkogene Abhängigkeiten. A. BT474 - Zellen wurden umgekehrt mit dem menschlichen siGENOME siRNA - Bibliothek 200-Gen in dreifacher Ausfertigung transfiziert. Sphäroid Größe und Lebensfähigkeit beobachtet. Rohdatenwerte waren Platte Median normalisiert und Z-Scores berechnet wurden signifikante Ausreißer zu identifizieren , größer ist als das 1,7fache der Standardabweichung der Platte Median 15. Hinweis Rand Gene ErbB2, SF3B1, PLK1 und UBB einnd E-cad. siRNAs, die signifikant erhöht oder verringert Sphäroid Bereich und Lebensfähigkeit sind in blau und rot schattiert, wo Rot die Kontrolle siRNA die abbildet. B. Die Zellen wurden Reverse - transfiziert mit nicht-Targeting - Steuerung, E-Cadherin (E-Cad), PIK3CA, ErbB2 oder UBB siRNA und dann in einem Ultra-Low - Befestigungsplatte gesponnen Sphäroiden zu bilden. Nach 7 Tagen Hellfeld Vertreter Sphäroid Bilder wurden einem inversen Mikroskop genommen werden. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. C. Die Zellen wurden Reverse - transfiziert mit nicht-Targeting - Steuerung, PIK3CA, ErbB2 oder UBB siRNA und dann in einem Ultra-Low - Befestigungsplatte gesponnen Sphäroiden zu bilden. Nach 7 Tagen wurde die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von zwei unabhängigen biologischen dreifach durchgeführt Replikaten normalisiert # 1 zu steuern. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines ungepaarten t-Test (p <0,05) berechnet. D. Nach 7 Tagen wurden die Sphäroide fixiert, eingebettet, geschnitten und gefärbtfür H & E, Ki67, Cleaved Caspase-3 und p27. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Beachten Sie die H & E der siControl Sphäroiden kleiner erscheinen aufgrund eines Artefakts der Verarbeitung und individuellen intakten Sphäroiden zur Färbung gewählt. Dies schließt jedoch nicht aus den Änderungen mit den gescannten Bildern und die Lebensfähigkeit der Zellen beobachteten Ergebnisse beeinträchtigen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-Targeting-1 | TP53 | DST | KMT2C | Unbehandelte 1 | FCGBP | ARID1B | FBXM7 | TTC40 | Non-Targeting-2 | ||
| GATA3 | TTN | MUC12 | MUC4 | Ahnak | HUWEI1 | DNAH11 | ITPR2 | ABCA13 | CREBBP | ||
| MAP2K4 | PIK3CA | F5 | APOB | ANKRD30A | MUC17 | DNAH17 | LAMA2 | AS | CSMD2 | ||
| STARD9 | USH2A | FAT3 | LPR2 | CSMD3 | MYO18B | DNAH5 | MDN1 | ARHGAP5 | DNAH9 | ||
| CXCR3 | MUC16 | RB1 | PKHD1L1 | DNAH2 | SYNE2 | DYNC1H1 | PClo | CACNA1B | ErbB2 | ||
| PLK1 | SYNE1 | LYST | PTEN | SPTA1 | Unbehandelte 2 | VHL | RYR1 | COL6A3 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-Targeting-1 | ENAM | RYR2 | BRCA2 | Unbehandelte 1 | FMN2 | HECW1 | LAMB4 | SI | Non-Targeting-2 | ||
| FHOD3 | MACF1 | RYR3 | C2ORF16 | DMD | FRG1 | HERC2 | MYH11 | STAB1 | ZDBF2 | ||
| GOLGA6L2 | NEB | SMG1 | CACNA1E | DNA14 | GCC2 | HIVEP2 | NIPBL | TANC1 | ZNF536 | ||
| HMCN1 | NF1 | UBR5 | CACNA1F | DYNC2H1 | GON4L | HYDIN | PKD1L1 | TF | ANK3 | ||
| HRNR | OBSCN | USP34 | CYMA5 | FAM208B | GPR112 | ITSN2 | RNF213 | TPR | ASPM | ||
| PLK1 | PCDH15 | XIRP2 | COL7A1 | FLG2 | Unbehandelte 2 | VHL | SAGE1 | UNC80 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-Targeting-1 | DCHS2 | MUC5B | ZFHX4 | Unbehandelte 1 | MYO9A | SPHKAP | CXORF22 | NCOR1 | VPS13D | ||
| DMXL2 | MXRA5 | ANK2 | KIAA1210 | PRUNE2 | TCHH | DANH6 | NOTCH2 | ANKRD12 | |||
| BIRC6 | DNAH10 | TENM1 | Geldautomat | LRP1 | SCN10A | VPS13C | DNAH7 | SPEN | C5ORF42 | ||
| CDH1 | DNAH3 | PEG3 | DIDO1 | MAP1A | SCN2A | IPTR3 | ERBB3 | SRRM2 | CCDC88A | ||
| CUBN | NOCK11 | RELN | DNAH8 | MED12 | SHROOM2 | CEP350 | FAT4 | SZT2 | CHD4 | ||
| PLK1 | EYS | SACS | KIAA1109 | MED13 | Unbehandelte 2 | KMT2A | VPS13A | UBB | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-Targeting | QSER1 | ARID1A | WDFY3 | Unbehandelte 1 | SDK1 | TEX15 | LAMA1 | Non-Targeting-2 | |||
| COL14A1 | SHROOM3 | ATRX | EFCAB5 | SF3B1 | CBFB | AHNAK2 | |||||
| CSMD1 | TBX3 | KIAA0947 | FOXA1 | ITPR1 | DDX3X | KIF4A | |||||
| MEFV | UBR4 | MYCBP2 | INPPL1 | FLG | HECTD4 | FAT2 | |||||
| MGAM | VCAN | NBEAL1 | MAP3K1 | AKAP9 | GPR98 | FOXO3 | |||||
| PLK1 | ZNF462 | SETX | NRP1 | HERC1 | Unbehandelte 2 | VHL | UBB | ||||
Tabelle 1: Plattenlayout und Menschen siRNA Bibliothek De-Faltung. Die Tabelle enthält den Inhalt jedes der siRNA-Pools und das Layout für die niedrigen Befestigungsplatten in dem Bildschirm verwendet.
Discussion
Dreidimensionale Modelle von Krebs werden zunehmend eingesetzt, um die Wirksamkeit von bekannten und neuen Verbindungen zu bewerten, die entworfen wurden, um selektiv Krebszellen abzutöten. Krebszelle Sphäroiden sind Strukturen , die Bedingungen mehr ähnlich denen begegnet in Tumoren in vivo zeigen, so dass Verbindungen , die Wirksamkeit in 3D erhöht haben , sind eher eine Wirkung in vivo zu haben. Allerdings sind diese Modalitäten nicht zur Identifizierung von potentiell neuen Targets ermöglichen, die nicht Gegenstand der Wirkstoffdesign bekannt ist, dass erhebliche Wirksamkeit bei der Behandlung von Krebs haben kann.
Wir entwickelten eine siRNA funktionellen Genomik Ansatz, der für bis zu sieben Tage in der Krebszelllinie Sphäroiden für langlebige Gen-Silencing erlaubt. Es gibt mehrere wichtige Schritte des Protokolls, die eine Optimierung erfordern, bevor ein siRNA-Bildschirm durchgeführt werden kann. Die Fähigkeit, in einem großen Maßstab reproduzierbar tragfähige Sphäroiden zu bilden, ist wesentlich. Darüber hinaus ist einppropriate Transfektionsbedingungen sollte konsequent optimiert werden. Wir schlagen vor, trialing verschiedene Transfektionsreagenzien mit geeigneten nicht-Targeting und Kontrollen vor dem Versuch den Bildschirm zu töten. Wir konnten zeigen, dass viele häufig verwendete Brustkrebs-Zelllinien zu zeigen, nämlich BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 und JIMT1 zu siRNA-Transfektion zugänglich waren. Darüber hinaus haben wir Proof-of-Prinzip liefern Daten Screening der 200 am häufigsten mutierten Gene bei Brustkrebs in BT474 Sphäroiden, bestätigt ihre Abhängigkeit von Amplifikation von HER2 und onkogene Mutation von PIK3CA. Interessanterweise silencing des Transkriptionsfaktors FOXO3 führte zu einer Verringerung in Sphäroid Größe, aber keine signifikante Wirkung auf die Lebensfähigkeit. FOXO3 ist bekannt , die als Reaktion auf Hypoxie zu regulieren, die metabolische Kapazität von Krebszellen , so dass sie zu verändern 16 leichter an ihre Umgebung anzupassen. Diese Rolle könnte möglicherweise mit der Lebensfähigkeit der Zellen Lesen stören, wie es ATP Fülle erkennt, Einer der wichtigsten Produkte des Zellstoffwechsels.
Zur Unterstützung der Beobachtung einer Reduktion in Sphäroid Größe wurde gefunden , dass Silencing FOXO3 in HeLa gezeigt, Tumorwachstum und Apoptose induziert 17 beeinträchtigt Xenotransplantaten. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Gene die Fähigkeit von Krebszellen beeinflussen können ihre 3D-Architektur zu erhalten, die in False Positives führen könnte. Beispielsweise Zuschlags von E-Cadherin in Folge der Auflösung von BT474 Sphäroid Struktur. Dies hatte zuvor berichtet E-Cadherin - Antikörper durch gezielte 18. Wie bei jedem Screening-Plattform sollten potenzielle Ziele, um die Reproduzierbarkeit der Wirkung beobachtet zu beurteilen, werden gescreent. Es gibt Grenzen für die Technik, nämlich die vorübergehende Natur der siRNA-vermittelten Knock-Down. Sustained zum Schweigen zu bringen länger als sieben Tage nicht erreichbar mit siRNA.
Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es mit verschiedenen anderen Biom gekoppelt werden kann,tric Farbstoffe diese nicht nur die Sphäroid Lebensfähigkeit beurteilen zu können, zum Beispiel, räumliche Informationen von Sphäroid Hypoxie zu geben oder Apoptose durch Überwachung Zellen. Darüber hinaus, weil die Plattenleser Scans relativ schnell und nicht-invasiv sind, kann die Wirkung von siRNAs auf Sphäroid Größe im Laufe der Zeit nicht nur an der experimentellen Endpunkt bewertet werden. Tatsächlich untersuchen wir derzeit mehrere dieser Möglichkeiten innerhalb unserer Screening-Pipeline. Ein alternativer Ansatz, die 3D-Kulturen nutzt neue Abhängigkeiten zu identifizieren, ist die Verwendung von chemischen Bibliotheken, die entweder ein breites Spektrum von Zielen oder bestimmte Familien von Proteinen hemmen. Tatsächlich Bitler et al. Diese gezielte Ansatz genutzt , um die synthetische Letalität Interaktion zwischen ARID1A Status und EZH2 - Inhibitoren in ovarian klarzelligen Karzinomen 19 zu identifizieren. Die Entdeckung des CRISPR-Cas9 Gen Bearbeitungstechnologie hat zur Entwicklung von genetischen Screens in organoiden Kulturen und in vivo ebenfalls erlaubt. Jedoch tSein Ansatz ist auf mit geeigneten Tieranlagen abhängig und 20 unerschwinglich teuer werden kann.
Abschließend glauben wir , dass wir ein Protokoll dargelegt haben , dass genauer modelliert die Sauerstoff- und Nährstoff Gradienten, die Merkmale der Tumor - Mikroumgebung in vivo sind, so dass für die Identifizierung von neuen Targets bei Krebs oder robuste Validierung von festgelegten Zielen. Außerdem kann unser Protokoll für jede Art von Zelllinie angewendet werden, die Sphäroide und somit bildet, kann routinemäßig in der Gemeinschaft der Krebsforschung für siRNA Hochdurchsatz-Screens verwendet werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200 μL) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10 μL) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1, 000 μL) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5 mL) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture CO2; Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
References
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
