Abstract
تحديد الأحداث سائق وظيفية في سرطان أمر أساسي لتعزيز فهمنا للبيولوجيا السرطان والتي لا غنى عنها لاكتشاف الجيل القادم من أهداف عقار جديد. أصبح من الواضح أن المزيد من النماذج المعقدة من السرطان يطلب منها أن نقدر العوامل المساهمة التي تدفع تكون الأورام في الجسم الحي، وزيادة فعالية العلاجات الجديدة التي تجعل الانتقال من نماذج ما قبل السريرية إلى التجارب السريرية.
هنا نقدم منهجية لتوليد الأجسام الشبه الكروية الورم موحدة وقابلة للتكرار التي يمكن أن تخضع لفحص وظيفي سيرنا. هذه الأجسام الشبه الكروية تعرض العديد من الخصائص التي توجد في الأورام الصلبة التي ليست موجودة في الثقافة يومين البعد التقليدية. وتبين لنا أن العديد من خطوط خلايا سرطان الثدي شيوعا هي قابلة للهذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم إثبات صحة المبدأ البيانات باستخدام سرطان الثدي خط الخلية BT474، مؤكدا علىالاعتماد على التضخيم من عامل نمو البشرة مستقبلات HER2 وتحور فوسفتيدلينوستول-4،5-biphosphate 3-كيناز (PIK3CA) عندما نمت كما الكروية الورم. وأخيرا، ونحن قادرون على مواصلة التحقيق والتأكد من تأثير المكاني لهذه التبعيات باستخدام المناعية.
Introduction
الأورام الصلبة عرض النسيجية كبيرة، وراثي والجزئي البيئي التجانس داخل الورم، الذي يعرض الأطباء مع تحديا كبيرا في القدرة على علاج المرضى بنجاح. غالبية النماذج المستخدمة لتحديد رواية استهدفت العلاجات لا تتضمن الكثير من هذه الميزات. في الواقع، لقد تم تطوير العلاجات المستهدفة الحالية المستخدمة في عيادة في العقد الماضي باستخدام نهج الفرز التي تعتمد على خطوط الخلايا السرطانية المزروعة في ظل ظروف ثنائي الأبعاد (2D) الثقافة. على الرغم من أن هذا أدى إلى نجاحات مختلفة، مثل مثبطات مستقبلات التيروزين كيناز، أصبح من الواضح أن المزيد من النماذج المعقدة من السرطان المطلوبة لنقدر تماما العوامل المساهمة التي تدفع تكون الأورام في الجسم الحي، وزيادة عدد من العلاجات الجديدة التي تجعل الانتقال من نماذج ما قبل السريرية إلى التجارب السريرية. وعلاوة على ذلك، فإنه الآن بتقدير جيد أن أنظمة ثقافة 2D تفشل لتعكس فيفيفو سلوك 1،2. على سبيل المثال، في أورام أوعية دموية سيئة، حيث أن الطلب على الأوكسجين والمواد المغذية داخل المكروية يفوق العرض، ومناطق من الولادات العالية والمنخفضة تتطور. وجود الأكسجين المنخفض (نقص الأكسجين) في الأورام، والكشف عنها من قبل تلطيخ المناعى من المقاطع الورم لعلامات نقص الأوكسجين إنشاء مثل الأنهيدراز الكربونيك التاسع (CAIX)، يرتبط مع نتائج السريرية الأكثر فقرا في سرطان الثدي 3،4 ميزات وهكذا دمج مثل نقص الأكسجين في نماذج الفحص قد يؤدي إلى تعزيز قدرتنا على اكتشاف أهداف المخدرات الرواية التي سوف تكون أكثر فعالية في الجسم الحي. في الواقع، تمكنت بنجاح من استهداف الأورام العدوانية التي تحتوي على نقص الأكسجين هو الأولوية السريرية 5.
ويغير التقليدية فحص 2D سيرنا، في محاولة لتلخيص أكثر دقة عناصر من الشروط التي الخلايا السرطانية التي واجهتها في المكروية الورم، وأدى إلى تحديد عدة جينات عشرفي وقد وجد أن تكون مهمة لنمو الورم في الجسم الحي. وتشمل هذه الشاشات الجينومية الوظيفية التي تجرى في ظروف المصل منخفضة 6، 7 ظروف نقص الأوكسجين وفي تركيبة 8. على سبيل المثال، إسكات 6 فوسفو-2-كيناز / الفركتوز-2،6-Biphosphatase 4 (PFKFB4)، وهو بروتين مسؤول عن تنظيم الكربون تحلل الدخول، يتسبب فقط في موت الخلايا المبرمج خطوط سرطان البروستاتا المستمدة من ورم خبيث عندما نمت في مصل الدم المنخفض. كان إسكات PFKFB4 في خطوط خلايا البروستاتا الطبيعية في ظل نفس الظروف أي تأثير، في حين، ونضوب PFKFB4 ذاب تماما نمو البروستاتا خط الخلايا السرطانية xenografts 6.
في لوحة طويلة من خطوط خلايا سرطان الثدي، وإسكات أحادية كربوكسيلاز نقل 4 (MCT4) أدى بشكل تفضيلي في الحد من نمو خط الخلية تحت ظروف نقص الأوكسجين. تم التحقق من صحة هذا الضعف في الجسم الحي في سرطان الثدي خط الخلية xenogra المتعامدةFTS. وكان ربما أكثر لافت للنظر، إسكات أسيتيل التميم مخلقة 2 (ACSS2)، وهو الانزيم المسؤول عن تحويل خلات إلى أسيتيل التميم، وانخفاض عدد الخلايا السرطانية تحت ظروف الإجهاد المغذيات (انخفاض الأكسجين والدم) ولكن القليل أو أي تأثير في ظل ظروف ثقافة العادية 8. أثرت الاجتثاث من ACSS2 نمو الثدي وسرطان البروستاتا xenografts مما يشير إلى أن التدرجات الغذائية لا وجود لها في عزلة داخل المكروية الورم وأن الخلايا الموجودة في هذه المناطق ضرورية لتطور الورم 8. وعلاوة على ذلك، تم العثور على ACSS2 أيضا أن من المهم في الإصابة بالورم الأرومي الدبقي وسرطان الخلايا الكبدية 9،10، مما يعني أن زيادة النشاط ACSS2 في الأورام يمكن أن تكون آلية الأساسية التي تدعم النمو في ظل ظروف غير مواتية.
بشكل جماعي، هذه الدراسات تثبت أن تلخص الظروف التي واجهتها في الجسم الحي وأداء شاشات سيرنا يسمح لتحديد زأنيس الأساسية للبقاء على قيد الحياة سرطان. وكذلك تؤثر على نمو الخلايا السرطانية 2D تحت ظروف الإجهاد المغذيات، تحول دون استنزاف الجينات المستهدفة في هذه الدراسات السرطان نمو كروي خط الخلية، وهو ما يعكس ما لوحظ في xenografts الورم 6،8. وهكذا، الكروية خط الخلايا السرطانية تحتوي على العديد من الشروط التي واجهتها في المكروية الورم الذي نقل حساسية لإسكات ACSS2. في الواقع، الكروية عرض التدرجات المواد الغذائية (المصل والأوكسجين)، والتغيرات في درجة الحموضة، وثلاثي الأبعاد (3D) خلية خلية الاتصال، ولكن أيضا، وتعديلات في سرعته التكاثري مع الخلايا التي تمر اعتقال دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج. ويتمثل ذلك من خلال وجود في الكروية سرطان المناطق الميتة، وهي ميزة لا توجد في ثقافة 2D التقليدية.
وقد تم بالفعل استخدام الكروية الخلايا السرطانية كما النماذج ذات الصلة أكثر بيولوجيا لفحص مثبطات جزيء صغير ولكن هذا يسمح فقط للتحقق من صحة فعالية مركب أو تطويعها لأغراض أخرى من كومبوجهاز الأمم المتحدة الإنمائي تصميم أصلا لأمراض أخرى (11). طرق كروي الفحص الحالية لا تسمح لتحليل نضوب جين معين في الإنتاجية العالية من الطريقة عالية المحتوى. هنا، نحن تصف لأول مرة، خط أنابيب علم الجينوم وظيفية لكشف تبعيات جينية معينة باستخدام تكنولوجيا الصغيرة بالتدخل RNA (سيرنا) في سرطان الكروية خط الخلية. لقد قمنا بتصميم مكتبة مفصل مع الرناوات siRNAs استهداف 200 من الجين المتحول في أغلب الأحيان في سرطانات الثدي البشرية وتقييم تأثير استنفاد الجينات على حجم كروي والنشاط الأيضي في BT474 الكروية سرطان الثدي. كنا قادرين على بقوة وبتكاثر كشف عن تأثير ERBB2 وPIK3CA إسكات في الثقافات 3D. وعلاوة على ذلك، فإننا لا يمكن تقييم أثر نضوب الجينات على بنية المكانية الكروية BT474 باستخدام المناعية.
Protocol
1. إعداد لوحات سيرنا 96-جيدا
ملاحظة: الحواف الخارجية للوحة 96-جيدا أكثر عرضة للتبخر مقارنة مع الآبار الأخرى، وبالتالي الحد من كمية الرناوات siRNAs إلى 60 في 96-جيدا لوحة. ملء الآبار الخارجي مع المتوسط العادي أو برنامج تلفزيوني للحد من هذه. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن شاشة التحقق من الزيارات للتخفيف من التحيز لوحة.
- تمييع الرناوات siRNAs إلى 250-500 نانوغرام / ميكرولتر في خفض سيرم (حسب توصيات الشركة الصانعة) وقسامة 10 ميكرولتر من آبار المناسبة من لوحة مرفق منخفضة للغاية. أداء جميع الشاشات في ثلاث نسخ.
ملاحظة: تتضمن عدم استهداف (سلبية) وقتل (إيجابية، مثل UBB وPLK1) الضوابط المناسبة سيرنا في تصميم لوحة لضمان كفاءة ترنسفكأيشن يمكن تقييم. استخدام لوحات التعلق منخفض للعمل سيرنا أمر بالغ الأهمية، كما سيتم إضافة الخلايا إلى خليط ترنسفكأيشن. نحن لا نستطيع أن نستبعد بعض الشركات المصنعة منخفضة للغاية التعلققد يكون لوحات آثار خفية على النمو كروي. على هذا النحو فإننا نوصي بأن هذه يتم اختبارها من قبل المستخدم النهائي. - بطانات مع أختام لاصقة ومخزن في -20 درجة مئوية.
2. عكسي ترنسفكأيشن من الخط خلية
- في يوم من الشاشة، وتذويب لوحات في درجة حرارة الغرفة وتدور لمدة 5 دقائق في 1000 x ج باستخدام جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. إضافة 10 ميكرولتر من انخفاض سيرم التي تحتوي على كاشف الأمثل ترنسفكأيشن إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. ترك لوحات لمدة 15 دقيقة للمجمعات ترنسفكأيشن التي تحتوي على سيرنا لتشكيل.
ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة خط سرطان الثدي خلية BT474 للفحص الجيني وظيفية (مثقف في ارتفاع DMEM الجلوكوز (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) والمضادات الحيوية). - يعرض للتريبسين الخلايا ليتم عرضه (0.05٪ التربسين و 0.53 ملي EDTA) حتى فصل من القارورة، تحييد باستخدام حجم مناسب من specif خط الخليةجيم المتوسطة وتدور لمدة 5 دقائق في 1000 x ج على مقعد بين كبار الطرد المركزي لإزالة التربسين. و resuspend الخلايا مع حجم مناسب من المتوسط وتحديد عدد الخلايا دقيقة باستخدام عداد الخلية.
ملاحظة: عادة 5000 خلية لكل جيدا كافية لتكوين كروي في معظم خطوط الخلايا التي تم اختبارها. ومن المهم أن العد بدقة الخلايا كما تعليق خلية واحدة لإجراء مقارنات حجم دقيقة. - تمييع الخلايا إلى 5000 خلية لكل ميكرولتر 180 في المتوسط الباردة (4 درجة مئوية).
ملاحظة: سيتم إضافة عناصر مصفوفة الغشاء القاعدي المعاد تؤثر سلبا على كفاءة ترنسفكأيشن ومن المستحسن أن لا يتم استخدامه. خلية خط الأمثل لتأكيد قدرة كروي تشكيل وفعالية ضربة قاضية يجب أن يتم تنفيذ قبل الشاشة. - نقل تعليق خلية إلى الخزان، الماصة لخلط وإضافة 180 ميكرولتر من كل بئر من 96 جيد جدا منخفض لوحة مرفق يحتوي على سيرنا معدة مسبقا (2.1).
- Centrifugالبريد لوحة في 1000 x ج في precooled 4 درجات مئوية الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة ثم العودة إلى حاضنة الثقافة 37 ° C الأنسجة.
- ملاحظة: سوف تظهر الخلايا كما فسيفساء في قاع الآبار. على مدى المقبلة 12-24 ساعة الخلايا وتجميع معا لتشكيل مجال واحد.
- بعد 24 ساعة، ومراقبة الخلايا تشكل كروي واحد في وسط البئر. إضافة 100 ميكرولتر من المتوسط كاملة إلى كل بئر لتشجيع النمو.
- تجديد المتوسطة بعد ثلاثة أيام. إزالة بلطف 100 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من متوسطة جديدة.
- في يوم 7، قياس حجم كروي الآلي على قارئ لوحة التي يمكن رصد كميا نمو كروي على مر الزمن (انظر القسم 3).
- بعد ذلك، وتحديد بقاء الخلية باستخدام الانارة صبغ بقاء الخلية (انظر القسم 4).
3. الآلي الحصول على الصور
- مسح لوحات على المقعد العلوي، الصغيرة بشكل جيد لوحة التصوير الكريات في يوم 7.
- <لى> افتح البرنامج، حدد ما يلي: '96 -well لوحة "، حدد نوع لوحة المناسب وإدخال اسم التجربة. ملاحظة: يمكن أيضا إضافة أي معلومات إضافية في البرنامج.
- حدد التطبيق "Tumorsphere". تغيير التركيز بحيث كروي هو في التركيز وعلى النقيض الأمثل.
ملاحظة: نوصي "صورة التركيز على أساس" كما اختلافات كبيرة في أحجام كروي من المتوقع. - حدد الآبار التي تتطلب مسح و "مسح البداية".
- باستخدام برنامج الماسح الضوئي لوحة، وتأكد من أن قناع كائن يمثل بدقة حجم كروي. القيام بذلك عن طريق ضبط إعدادات قطر مستعمرة، اتساع الحدود، والحد الأدنى سمك والدقة، الخاصة بكل خط اختبار الخلية 11،12.
ملاحظة: سيتم بعد ذلك احتساب مساحة كروي باستخدام خوارزمية البرنامج. على سبيل المثال، لحساب دقيق لمنطقة الكروية BT474 نمت لمدة سبعة أيام ضبط الدقة إلى 'العالية' لتعيين د الحد الأدنى لقطر مستعمرة إلى 200 ميكرومتر. هذا يجب أن ينتج ممثل قناع كروي المناسب للمنطقة كروي.
ملاحظة: يمكن بعد ذلك يتم تصدير هذه البيانات من الجهاز، وذلك باستخدام وظيفة التصدير، في في شكل ملف البيانات المشروح. التاريخ هو لوحة متوسط تطبيع، جنبا إلى جنب وتحليلها إما عن طريق ض النتيجة أو موحد صارم فرق المتوسط (SSMD) لتحديد الرناوات siRNAs التي كان لها تأثير ذو دلالة إحصائية في منطقة كروي.
4. تحديد بقاء الخلية
- بعد أن تم احتساب مساحة كروي، تحديد صلاحية استخدام الانارة صبغ الخلايا قدرتها على البقاء. تحضير كاشف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إزالة بعناية 100 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من صبغ جدوى. احتضان لوحات لمدة 15 دقيقة ثم مسح باستخدام قارئ لوحة الانارة.
ملاحظة: يمكن بعد ذلك يتم تصدير هذه البيانات من الجهاز، وذلك باستخدام وظيفة التصدير، في فيشكل ملف البيانات المشروح. التاريخ هو لوحة متوسط تطبيع، جنبا إلى جنب وتحليلها إما عن طريق ض النتيجة أو موحد صارم فرق المتوسط (SSMD) لتحديد الرناوات siRNAs التي كان لها تأثير ذو دلالة إحصائية على حيوية كروي.
Representative Results
المقايسات كروي في مرفق لوحات 96-جيدا منخفضة للغاية تقديم تقييم المظهرية الإنتاجية العالية للقدرة التوريم المحتملين في السياق الذي يلخص بسهولة أكبر على الظروف الفسيولوجية وجدت في الأورام في الجسم الحي. والواقع أن خطوط الخلايا السرطانية MCF10DCIS.com وشكل BT474 الهياكل كروي ضيقة (الشكل 1A) والتحقيق immunohistological من أقسام كروي أظهرت التغيرات المكانية متميزة في التشكل الخلوي والنووي. مع مرور الوقت، وبعض الأجسام الشبه الكروية مثل الكروية BT474 تطوير المناطق الميتة، وهي سمة مشتركة من الأورام الصلبة العدوانية (الشكل 1B). بعض الكروية لا تتطور النوى الميتة، مثل خط الخلية MDA-MB-231، ولكن هل عرض تفاوت ملحوظ في علامة التكاثري Ki67، الذي يرتبط عكسيا مع المشقوق caspsase 3 التعبير، علامة على موت الخلايا المبرمج (الشكل 1C). لإثبات أن خطوط الخلايا متعددة هي في الواقع رجبTIVE إلى بوساطة سيرنا إسكات الجينات BT474، MCF10DCIS.com، MDA-MB-231 و خلايا JIMT1 و transfected العكس مع سيرنا لمدة سبعة أيام. وكان وجود كاشف ترنسفكأيشن (وهمية) أو ترنسفكأيشن من الرناوات siRNAs مراقبة أي تأثير على قابلية كروي، بينما إسكات الجينات الضروري اليوبيكويتين ب (UBB) انخفاضا كبيرا الجدوى كروي في جميع خطوط الخلايا اختبار (1D الشكل).
لقد قمنا بتصميم مكتبة سيرنا الإنسان التي تشملها الجينات الطافرة في أغلب الأحيان في غير محدد، ER +، HER2 + وثلاثية سرطان الثدي السلبية. وتتكون هذه المكتبة من جينات وظيفة معروفة، مثل MYC، PIK3CA وTP53 وأولئك الذين لم يتم تأسيس المساهمة في التسرطن. يحتوي على شاشة أيضا العديد من الرناوات siRNAs السيطرة استهداف غير (التحكم # 1، التحكم رقم 2) والرناوات siRNAs استهداف الجينات الأساسية، مثل PLK1 وUBB، والتي تكون بمثابة قتل الضوابط (الجدول 1). لقد اخترنا لاستخدام كانكون الثديإيه خطوط الخلايا BT474 لأنها تشكل بسهولة الكروية بدون إضافة الغشاء القاعدي أعيد تشكيلها، وإنشاء خطوط الخلايا العمود الفقري ولها بنية الجينوم المعروفة. على سبيل المثال، خلايا BT474 إيجابية لمستقبلات هرمون الاستروجين (ER +)، بإفراط على الإنسان مستقبلات عامل نمو البشرة 2 (HER2 +) والطفرات ميناء في TP53 (E285K) وPIK3CA (K111N) 13.
توظيف بروتوكول المبينة أعلاه، فإننا رصدها زيارتها استنزاف الجينات تؤثر على حجم كروي وقدرتها على البقاء بعد سبعة أيام من سيرنا ترنسفكأيشن العكسي (الشكل 1E). ومن المثير للاهتمام، فإن غالبية الجينات لا يكون لها تأثير كبير على منطقة كروي أو جدوى (الشكل 2A). أدى إسكات FOXO3، PIK3CA، ERBB2 وSF3B1 في الحد استنساخه الأكثر أهمية في حجم كروي. وقد لوحظ هذا الانخفاض أيضا في جدوى كروي بعد ERBB2 وSF3B1 إسكات. مشجع، ونحن أسيوطirmed تأثير PIK3CA، ERBB2 وSF3B1 إسكات على حجم كروي باستخدام المجهر مشرق الميدان (الشكل 2B). حددنا سابقا SF3B1 كما جين أساسي في العديد من نماذج خط الخلية، وبالتالي يمثل siSF3B1 تحكم قتل جيدة بالإضافة إلى UBB 14. ومن المثير للاهتمام، وأدى كل الجينات 200 فقط إسكات E-كادهيرين في زيادة كبيرة في جدوى كروي (الشكل 2A). وأظهر التحقيق في التشكل كروي أن E-كادهيرين إسكات أدى إلى انهيار كامل للبنية كروي، مع خلايا قابلة للحياة ترتكز على الجزء السفلي من المرفق منخفض بشكل جيد (الشكل 2B). وأظهرت إعادة التحقيق اليدوي للبيانات الشاشة حجم كروي أن هذا قد احتفل به ولكن تم القضاء عليها من القياس الكمي المنطقة نظرا لكائن يجري فوق قيود حجم مجموعة. كما سلط الضوء عليها سابقا، والخلايا BT474 بإفراط مستقبلات التيروزين كيناز HER2 وتؤوي طفرة أنكجنيك في PIK3CA (K111N). أكدنا أدى ذلك إسكات ERBB2 وPIK3CA في انخفاض الجدوى كروي، في حين أن ترنسفكأيشن مع الضوابط غير تستهدف أي تأثير (الشكل 2C).
نحن المقبل التحقيق في تأثير استنفاد سيرنا على الأنسجة كروي. و transfected الكروية BT474 العكس مع عدم توجيه سيرنا السيطرة والرناوات siRNAs تستهدف PIK3CA، ERBB2 وUBB. أدى إسكات ERBB2 وUBB في الحد من علامة الموالية للالتكاثري Ki67 مقارنة للسيطرة على سيرنا (الشكل 2D). تفعيل علامة الموالية لأفكارك المشقوق كاسباس 3 لوحظ فقط بعد UBB إسكات، مما يشير إلى أن استنزاف HER2 وPIK3CA لم يسفر عن موت الخلايا المبرمج ولكن كانت تثبيط الخلايا بدلا من السامة للخلايا. في الواقع، إسكات HER2 وPIK3CA لم ينتج عنه زيادة في بروتين تعبير من دورة الخلية P27 البروتين اعتقال مقارنة للسيطرة على الكروية transfected.
والأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> أخذت معا، وتظهر هذه النتائج التي يقودها خلايا BT474 التي كتبها أنكجنيك HER2 وPIK3CA يشير عندما نمت كما الكروية 3D الأهم من ذلك، تظهر هذه النتائج أنه من الممكن ل. تصميم وتنفيذ مكتبة فحص سيرنا مفصل مئات من الجينات في الكروية خط الخلايا السرطانية بقوة وبتكاثر.
الشكل 1: خلية الخط الأمثل لنمو 3-الأبعاد. ، كانت A. خطوط خلايا سرطان الثدي MCF10DCIS.com وBT474 مثقف في لوحات مرفق خفيفة لمدة 7 أيام. واتخذت صورة تمثيلية Brightfield باستخدام مجهر مقلوب. الحانات النطاق = 100 ميكرون. تم مثقف ب MCF10DCIS.com وBT474 الكروية لمدة 28 يوما. تم تجديد 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة كل 3-4 أيام. كانت ثابتة الكروية في 3.8٪ الفورمالديهايد، والبريدmbedded، مقطوع وملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E). وتظهر الصور التمثيلية في انخفاض وارتفاع التكبير. تمثل الحانات مقياس 100 ميكرون و 33 ميكرون، على التوالي. تم مثقف جيم MDA-MB-231 الكروية لمدة 21 يوما. تم تجديد 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة كل 3-4 أيام. كانت ثابتة الكروية في 3.8٪ الفورمالديهايد، جزءا لا يتجزأ، مقطوع وملطخة Ki67 والمشقوق كاسباس 3. وتظهر الصور التمثيلية. الحانات النطاق = 100 ميكرون. و transfected D. BT474، MCF10DCIS.com، MDA-MB-231، وJIMT1 خطوط الخلايا العكس مع وهمية (كاشف ترنسفكأيشن فقط) والرناوات siRNAs السيطرة وUBB، ثم تم نسج لوحات مرفق منخفضة للغاية لتشكيل الأجسام الشبه الكروية. تمت إضافة المتوسطة الطازجة (100 ميكرولتر) في أيام 1 و 4. بعد 7 أيام، وكان كميا بقاء الخلية. تمثل البيانات يعني ± SD اثنين من مكررات البيولوجية مستقلة أجريت في ثلاث نسخ تطبيع للسيطرة على # 1. تم احتساب الدلالة الإحصائية باستخدام إدارة بريد الأمم المتحدةطلاب IRED اختبار t (ع <0.05). E. رسم تخطيطي تدفق يلخص بروتوكول ترنسفكأيشن العكسي المستخدمة لاستجواب وظيفيا الاعتماد الجينات في سرطان الكروية خط الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحقيق الجينوم الوظيفي للBT474 الأجسام الشبه الكروية يكشف أنكجنيك التبعيات. و transfected خلايا A. BT474 العكس مع مكتبة سيرنا siGENOME الإنسان-200 الجينات في ثلاث نسخ. وقد لوحظ حجم كروي وقدرتها على البقاء. وكانت قيم البيانات الخام حسبت لوحة متوسط تطبيع وض عشرات لتحديد القيم المتطرفة كبيرة أكبر من 1.7x الانحراف المعياري لوحة متوسط 15. ملاحظة الجينات النائية ERBB2، SF3B1، PLK1 وUBB لالثانية E-نذل. مظللة الرناوات siRNAs التي أدت إلى زيادة أو خفض مساحة كروي وقدرتها على البقاء في الأزرق والأحمر، حيث يصور أحمر ال سيرنا السيطرة. و transfected ب خلايا العكس مع عدم توجيه السيطرة، E-كادهيرين (E-CAD)، PIK3CA، ERBB2 أو UBB سيرنا ثم نسج في لوحة مرفق منخفضة للغاية لتشكيل الأجسام الشبه الكروية. بعد 7 أيام، brightfield واتخذت صورة كروي تمثيلية باستخدام مجهر مقلوب. الحانات النطاق = 100 ميكرون. و transfected جيم خلايا العكس مع عدم توجيه السيطرة، PIK3CA، ERBB2 أو UBB سيرنا ثم نسج في لوحة مرفق منخفضة للغاية لتشكيل الأجسام الشبه الكروية. بعد 7 أيام، وكان كميا بقاء الخلية. تمثل البيانات يعني ± SD اثنين من مكررات البيولوجية مستقلة أجريت في ثلاث نسخ تطبيع للسيطرة على # 1. تم احتساب الدلالة الإحصائية باستخدام الطلاب المفردة اختبار t (ع <0.05). D. بعد 7 أيام، تم إصلاحها الكروية، جزءا لا يتجزأ، مقطوع والملونلH & E، Ki67، ملصوق كاسباس 3، وP27. وتظهر الصور التمثيلية. الحانات النطاق = 100 ميكرون. لاحظ H & E من الكروية siControl يبدو أصغر بسبب الحرفية من الكروية تجهيز والفردية على حالها الذي تم اختياره لتلطيخ. ولكن هذا لا ينتقص من التغيرات الملحوظة مع الصور الممسوحة ضوئيا والنتائج بقاء الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| غير تستهدف 1 | TP53 | التوقيت الصيفي | KMT2C | غير المعالجة 1 | FCGBP | ARID1B | FBXM7 | TTC40 | غير تستهدف 2 | ||
| GATA3 | TTN | MUC12 | MUC4 | AHNAK | HUWEI1 | DNAH11 | ITPR2 | ABCA13 | CREBBP | ||
| MAP2K4 | PIK3CA | F5 | APOB | ANKRD30A | MUC17 | DNAH17 | LAMA2 | ACE | CSMD2 | ||
| STARD9 | USH2A | FAT3 | LPR2 | CSMD3 | MYO18B | DNAH5 | MDN1 | ARHGAP5 | DNAH9 | ||
| CXCR3 | MUC16 | RB1 | PKHD1L1 | DNAH2 | SYNE2 | DYNC1H1 | PCLO | CACNA1B | ERBB2 | ||
| PLK1 | SYNE1 | LYST | PTEN | SPTA1 | غير المعالجة 2 | VHL | RYR1 | COL6A3 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| غير تستهدف 1 | ENAM | RYR2 | BRCA2 | غير المعالجة 1 | FMN2 | HECW1 | LAMB4 | SI | غير تستهدف 2 | ||
| FHOD3 | MACF1 | RYR3 | C2ORF16 | DMD | FRG1 | HERC2 | MYH11 | STAB1 | ZDBF2 | ||
| GOLGA6L2 | نب | SMG1 | CACNA1E | DNA14 | GCC2 | HIVEP2 | NIPBL | TANC1 | ZNF536 | ||
| HMCN1 | NF1 | UBR5 | CACNA1F | DYNC2H1 | GON4L | HYDIN | PKD1L1 | TF | ANK3 | ||
| HRNR | OBSCN | USP34 | CYMA5 | FAM208B | GPR112 | ITSN2 | RNF213 | نظام الحماية المؤقت | ASPM | ||
| PLK1 | PCDH15 | XIRP2 | COL7A1 | FLG2 | غير المعالجة 2 | VHL | SAGE1 | UNC80 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| غير تستهدف 1 | DCHS2 | MUC5B | ZFHX4 | غير المعالجة 1 | MYO9A | SPHKAP | CXORF22 | NCOR1 | VPS13D | ||
| DMXL2 | MXRA5 | ANK2 | KIAA1210 | PRUNE2 | TCHH | DANH6 | NOTCH2 | ANKRD12 | |||
| BIRC6 | DNAH10 | TENM1 | ماكينة الصراف الآلي | LRP1 | SCN10A | VPS13C | DNAH7 | SPEN | C5ORF42 | ||
| CDH1 | DNAH3 | PEG3 | DIDO1 | MAP1A | SCN2A | IPTR3 | ERBB3 | SRRM2 | CCDC88A | ||
| CUBN | NOCK11 | RELN | DNAH8 | MED12 | SHROOM2 | CEP350 | FAT4 | SZT2 | CHD4 | ||
| PLK1 | EYS | SACS | KIAA1109 | MED13 | غير المعالجة 2 | KMT2A | VPS13A | UBB | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| غير الاستهداف | QSER1 | ARID1A | WDFY3 | غير المعالجة 1 | SDK1 | TEX15 | LAMA1 | غير تستهدف 2 | |||
| COL14A1 | SHROOM3 | ATRX | EFCAB5 | SF3B1 | CBFB | AHNAK2 | |||||
| CSMD1 | TBX3 | KIAA0947 | FOXA1 | ITPR1 | DDX3X | KIF4A | |||||
| MEFV | UBR4 | MYCBP2 | INPPL1 | FLG | HECTD4 | FAT2 | |||||
| MGAM | VCAN | NBEAL1 | MAP3K1 | AKAP9 | GPR98 | FOXO3 | |||||
| PLK1 | ZNF462 | SETX | NRP1 | HERC1 | غير المعالجة 2 | VHL | UBB | ||||
الجدول 1: تخطيط لوحة وسيرنا الإنسان مكتبة دي الالتواء. يحتوي الجدول على محتوى كل من برك سيرنا وتخطيط لوحات مرفق المنخفضة المستخدمة في الشاشة.
Discussion
يجري استخدام نماذج ثلاثية الأبعاد للسرطان على نحو متزايد لتقييم فعالية من المركبات المعروفة والجديدة التي تم تصميمها لقتل انتقائي الخلايا السرطانية. الكروية الخلايا السرطانية هي هياكل التي تعرض ظروف أكثر مماثلة لتلك التي واجهتها في الأورام في الجسم الحي، وبالتالي المركبات التي زادت فعالية في 3D هم أكثر عرضة ليكون لها تأثير في الجسم الحي. ومع ذلك، هذه الطرائق لا تسمح لتحديد أهداف محتملة الرواية التي لم تكن موضوع تصميم الأدوية التي يمكن أن يكون لها فعالية كبيرة في علاج السرطان.
قمنا بتطوير سيرنا علم الجينوم الوظيفي النهج الذي سمح لإسكات الجينات دائم لمدة تصل إلى سبعة أيام في سرطان الكروية خط الخلية. هناك العديد من الخطوات الهامة للبروتوكول التي تتطلب التحسين قبل لا يمكن أن يؤديها شاشة سيرنا. القدرة على تكوين الأجسام الشبه الكروية قابلة للحياة استنساخه على نطاق واسع أمر ضروري. علاوة على ذلك،شروط ترنسفكأيشن ppropriate ينبغي أن يكون الأمثل بدقة. نقترح عليك تجريب عدة الكواشف ترنسفكأيشن مختلفة مع عدم استهداف المناسب وقتل الضوابط قبل محاولة الشاشة. كنا قادرين على إظهار أن العديد من يشيع استخدامها خطوط خلايا سرطان الثدي، وهي BT474، كانت MCF10DCIS.com، MDA-MB-231 وJIMT1 قابلة للسيرنا ترنسفكأيشن. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم إثبات صحة المبدأ البيانات فحص 200 من الجين المتحول في أغلب الأحيان في سرطان الثدي في الكروية BT474، أكدت اعتمادها على التضخيم من HER2 وطفرة أنكجنيك من PIK3CA. ومن المثير للاهتمام، أدى إسكات FOXO3 عامل النسخ إلى انخفاض في حجم كروي ولكن ليس له تأثير كبير على قدرتها على البقاء. ومن المعروف FOXO3 لتنظيم استجابة لنقص الأكسجين، وتغيير القدرة على التمثيل الغذائي للخلايا السرطانية مما يسمح لهم للتكيف بسهولة أكبر مع بيئتها 16. هذا الدور الذي يمكن أن يحتمل تتداخل مع القراءة بقاء الخلية كما يكشف ATP وفرة، واحدة من المنتجات الرئيسية للاستقلاب الخلية.
ودعما للمراقبة انخفاض في حجم كروي، فقد تبين أن إسكات FOXO3 في هيلا xenografts ضعف نمو الورم ويتسبب موت الخلايا المبرمج 17. من المهم أن نلاحظ أن بعض الجينات قد تؤثر على قدرة الخلايا السرطانية على الاحتفاظ الهندسة المعمارية 3D، والتي يمكن أن تؤدي إلى ايجابيات كاذبة. على سبيل المثال، أدت ضربة قاضية من E-كادهيرين في حل BT474 هيكل كروي. تم الإبلاغ عن هذا مسبقا باستخدام E-كادهيرين المستهدفة الأجسام المضادة 18. كما هو الحال مع أي منصة الفرز، يجب rescreened الأهداف المحتملة لتقييم استنساخ تأثير ملاحظتها. هناك قيود على هذه التقنية، وهي طبيعة عابرة للضربة قاضية الجينات بوساطة سيرنا. كانت متواصلة إسكات أكثر من سبعة أيام لا يمكن تحقيقها مع سيرنا.
وميزة هذا النهج هو أنه يمكن أن يقترن مع مختلف إحيائية أخرىالأصباغ TRIC ليس فقط تلك التي تقيم الجدوى كروي، على سبيل المثال، وإعطاء المعلومات المكانية من نقص الأكسجة كروي أو مراقبة الخلايا التي تمر موت الخلايا المبرمج. وعلاوة على ذلك، لأن بمسح لوحة القارئ سريعة نسبيا وغير الغازية، وتأثير الرناوات siRNAs على حجم كروي يمكن تقييم مرور الوقت بدلا من مجرد عند نقطة نهاية التجريبية. في الواقع، ونحن حاليا بصدد استكشاف العديد من هذه السبل في خط أنابيب الفحص والتدقيق. نهجا بديلا التي تستخدم الثقافات 3D لتحديد تبعيات جديدة هو استخدام المكتبات الكيميائية التي تمنع أي مجموعة واسعة من الأهداف أو أسر معينة من البروتينات. في الواقع، Bitler وآخرون. تستخدم هذه الطريقة تستهدف التعرف على التفاعل الفتك الاصطناعية بين الحالة ARID1A ومثبطات EZH2 في المبيض سرطان الخلايا واضحة (19). وقد سمح اكتشاف كريسبر-Cas9 تكنولوجيا التحرير الجين أيضا لتطوير شاشات الوراثية في الثقافات عضي وفي الجسم الحي. ومع ذلك، رمنهجه يعتمد على وجود مرافق الحيوانات المناسبة ويمكن أن تكلف باهظة 20.
في الختام، ونحن نعتقد أننا قمنا بتحديد البروتوكول الذي أكثر دقة النماذج الأكسجين والمغذيات التدرجات، التي هي من سمات المكروية الورم في الجسم الحي، والسماح لتحديد أهداف سرطان جديدة أو التحقق من صحة قوية من الأهداف المحددة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق بروتوكول لدينا أي نوع من خط الخلية التي تشكل الكروية، وبالتالي يمكن استخدامها بشكل روتيني في المجتمع أبحاث السرطان للشاشات سيرنا الإنتاجية العالية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200 μL) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10 μL) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1, 000 μL) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5 mL) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture CO2; Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
References
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
