Abstract
זיהוי של אירועי נהג תפקודיים בסרטן הוא מרכזי בקידום ההבנה שלנו של ביולוגית הסרטן והכרחי על הגילוי של הדור הבא של מטרות תרופה חדשניות. זה נהיה ברור כי מודלים מורכבים יותר של סרטן נדרשים להעריך במלואה את הגורמים התורמים שמניעים tumorigenesis in vivo ולהגדיל את היעילות של טיפולים חדשניים שהופכים את המעבר ממודלים טרום קליניים ניסויים קליניים.
כאן אנו מציגים מתודולוגיה להפקה spheroids גידול אחיד לשחזור שניתן נתון ההקרנה פונקציונלית siRNA. spheroids אלה מפגינים מאפיינים רבים הנמצאים בגידולים מוצקים שאינם נוכחים בתרבות דו מימד המסורתית. אנו מראים כי שורות תאים כמה נפוץ סרטן השד ניתן בפרוטוקול זה. יתר על כן, אנו מספקים הוכחה של עיקרון נתוני ניצול BT474 שורת תאי סרטן השד, מאשר שלהםהתלות הגברה של הקולטן לגורם הצמיחה אפידרמיס HER2 ו מוטציה של phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) כאשר גדל כמו spheroids הגידול. לבסוף, אנו מסוגלים לבדוק את העניין לעומק ולאשר את ההשפעה המרחבית של תלות אלה באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
Introduction
גידולים מוצקים להציג היסטולוגית משמעותית, גנטי מייקרו-סביבתי ההטרוגניות תוך-גידול, המציג קלינאים עם אתגר משמעותי יכולת לטפל בחולים בהצלחה. רוב המודלים המשמשים לזהות רומן ממוקד טיפולים לא לשלב רב של תכונות אלה. אכן, טיפולים ממוקדים נוכחיים מנוצלים במרפאת פותחו בעשור האחרון העסיקו גישות הקרנה המסתמכות על שורות תאי הסרטן גדלות תחת דו ממדים (2D) תנאי תרבות. אמנם זה הביא הצלחות שונות, כגון מעכבי טירוזין קינאז קולטן, מתחוור כי מודלים מורכבים יותר של סרטן נדרשים להעריך במלואה את הגורמים התורמים שמניעים tumorigenesis in vivo ו להגדיל את מספר טיפולים חדשים שהופכים את המעבר מודלים פרה-קליניים ניסויים קליניים. יתר על כן, הוא מעריך כעת גם כי מערכות תרבות 2D מצליחות לשקףvivo התנהגות 1,2. לדוגמא, בגידולי vascularized גרועים, שכן ביקוש חמצן וחומרים מזינים במייקרו-הסביבה להצליח לספק, אזורים של משלוחים גבוהים ונמוכים לפתח. בנוכחות חמצן נמוך (היפוקסיה) אל תוך גידולים, כפי שזוהה על ידי מכתים immunohistochemical סעיפי גידול סמנים היפוקסי ותיקים כגון anhydrase פחמתית IX (קיי), עולה בקנה אחד עם תוצאות קליניות עניות בסרטן השד 3,4 תכונות שילוב לפיכך כגון היפוקסיה לתוך מודלי הקרנה עשויה לשפר את היכולת שלנו לגלות מטרות תרופה חדשניות כי תהיינה יעיל יותר in vivo. ואכן, בהצלחה מיקוד גידולים אגרסיביים המכילים היפוקסיה היא בעדיפות קלינית 5.
שינוי של ההקרנה המסורתית 2D siRNA, בניסיון ליתר דיוק לשחזר אלמנטים של התנאים בהם נתקלים תאים סרטניים במיקרו-סביבה של הגידול, הוביל לזיהוי של מספר גנים הבבית כבר נמצא כחשוב לצמיחת גידול in vivo. אלה כוללים מסכי גנומית תפקודיים להתבצע בתנאים בסרום נמוכים 6, תנאי חוסר חמצן 7 ו בשילוב 8. לדוגמה, השתקת 6-Phosphofructo-2-קינאז / פרוקטוז-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), חלבון האחראי על ויסות הגליקוליזה הזנת פחמן, רק לאפופטוזיס בקווים סרטן הערמונית נגזר גרורות כאשר גדל בסרום נמוך. השתקת PFKFB4 בשורות תאי ערמונית נורמליות באותם תנאים לא הייתה השפעה, ואילו, דלדול של PFKFB4 לחלוטין ablated הצמיחה של שורת תאי סרטן ערמונית xenografts 6.
בהרכב מורחב של שורות תאי סרטן השד, השתקת טרנספורטר מונה-carboxylase 4 (MCT4) הובילה מועדף להפחתת צמיחת שורת תאים בתנאים של רמות חמצן נמוכים. פגיעות זו קיבלה תוקף in vivo ב xenogra orthotropic קו תאי סרטן השדFTS. אולי הכי בולט, השתקה של synthetase Acetyl-CoA 2 (ACSS2), אנזים האחראי על ההפיכה תצטט לתוך אצטיל-CoA, מספר תאי סרטן מופחת בתנאי קיצון מזין (חמצן נמוך בדם) אבל היה מעט או ללא השפעה בתנאי תרבות הנורמליות 8. אבלציה של ACSS2 השפיעו על הצמיחה של xenografts סרטן השד והערמונית דבר המצביע על כך שהפרשי מזין אינם קיימים בבידוד במיקרו-סביבה של הגידול וכי תאים הנמצאים באזורים אלו חיוניים התקדמות הגידול 8. יתר על כן, ACSS2 נמצאה גם להיות חשוב גליובלסטומה קרצינומה hepatocellular 9,10, דבר המצביע על כך פעילות ACSS2 מוגברת בגידולים יכול להיות מנגנון יסודי התומכת בצמיחה בתנאים נחותים.
ככלל, מחקרים אלה מוכיחים כי משחזרת התנאים נתקלו in vivo וביצוע מסכי siRNA מאפשרת זיהוי של gEnes חיונית להישרדות סרטן. כמו גם להשפיע על גדילת תאים סרטניים 2D בתנאי קיצון מזין, דלדול של גני מטרה במחקרים אלה מעכבות צמיחה אליפטית קו תאים סרטניים, שיקוף מה נצפתה xenografts הגידול 6,8. לפיכך, spheroids קו תאים סרטניים מכילים כמה מן התנאים נתקל במיקרו-סביבה של הגידול המקנים רגישות השתקה ACSS2. ואכן, spheroids להציג הדרגתיים מזינים (סרום וחמצן), שינויים ב- pH, תלת ממדי (3D) קשר בין תאים, אלא גם, שינויי חישת שגשוג עם תאים שעברו עיכוב מחזור תא אפופטוזיס. זה בא לידי ביטוי על ידי נוכחות spheroids סרטן של אזורים נמקי, תכונה לא נמצא בתרבות 2D המסורתית.
spheroids תאים סרטניים כבר שימשו מודלים רלוונטיים יותר ביולוגית להקרין מעכבי מולקולה קטנה אבל זה מאפשר רק עבור אימות של יעילות מתחם או repurposing של רכיבי מדיהunds במקור לעצב עבור מחלות אחרות 11. שיטות הקרנה אליפטית נוכחיות אינן מאפשרות הניתוח של דלדול גן ספציפי בתוך תפוקה גבוהה של אופן גבוה תוכן. כאן אנו מתארים בפעם הראשונה, צינור גנומיקה תפקודית לחשיפת תלות גן ספציפי ניצול RNA התערבות קטנה (siRNA) הטכנולוגיה spheroids קו תאים סרטניים. עצבנו ספרייה העידה עם siRNAs מיקוד 200 הגנים שעברו מוטציה בתדירות הגבוהה ביותר של סרטן השד אנושי הערכתי את ההשפעה של דלדול גן על גודל אליפטית ופעילות מטבולית spheroids סרטן שד BT474. הצלחנו וחסונה ו reproducibly לזהות את ההשפעה של ERBB2 ו PIK3CA השתקה בתרבויות 3D. יתר על כן, אנחנו יכולים להעריך את ההשפעה של דלדול הגן על ארכיטקטורת מרחבית של spheroids BT474 באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
Protocol
1. הכנת צלחות siRNA 96-היטב
הערה: השוליים החיצוניים של צלחת 96-גם נוטים יותר אידוי לעומת בארות אחרות, ובכך להגביל את כמות siRNAs 60 לכל 96-גם צלחת. מלאו בארות חיצוניות עם מדיום רגיל או PBS להגביל זה. בנוסף, מסך אימות של להיטים מומלץ להקל הטיות צלחת.
- לדלל את siRNAs 250 - 500 ng / μL במדיום סרום מופחת (לפי המלצות יצרן) ו aliquot 10 μL על הבארות המתאימות צלחת המצורף אולטרה-הנמוך. בצע את כל המסכים בשלושה עותקים.
הערה: שלב המתאים ללא מיקוד (שלילי) והרג (חיובי, כגון UBB ו PLK1) שולטת siRNA בעיצוב הצלחת על מנת להבטיח יעילות transfection ניתן להעריך. שימוש צלחות נמוכה התקשרות עבור עבודת siRNA הוא קריטי, כמו תאים יתווספו לתערובת transfection. אנחנו לא יכולים לשלול כי חלק מהיצרנים מצורף אולטרה-נמוכהצלחות יכולות להיות השפעות עדינות על צמיחה אליפטית. וככזה אנו ממליצים אלה נבדקים על ידי משתמש הקצה. - אטמים עם חותמות ולאחסן דבק ב -20 ° C.
2. Transfection ההפוך של שורת תאים
- ביום של המסך, להפשיר את הצלחות בטמפרטורת החדר ומסובב למשך 5 דקות XG ב 1000 באמצעות צנטריפוגות הספסל העליון. הוסף 10 μL של מדיום סרום מופחת המכילים את מגיב transfection אופטימיזציה היטב כל באמצעות פיפטה רבה. השאירו צלחות במשך 15 דקות עבור מתחמי transfection המכילים siRNA להיווצר.
הערה: מחקר זה נצל את סרטן שד תא קו BT474 להקרנה גנומית תפקודית (בתרבית DMEM גלוקוז גבוהה (בינוני הנשר השונה של Dulbecco) בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS) ואנטיביוטיקה). - Trypsinize את התאים שיוקרנו (טריפסין 0.05% ו 0.53 mM EDTA) עד שניתקו מהבקבוק, לנטרל באמצעות נפח מתאים של specif שורת תאיםic בינוני ספין במשך 5 דקות XG ב 1000 על צנטריפוגות ספסל עליונים להסיר טריפסין. Resuspend התאים עם נפח מתאים של המדיום ולקבוע מספר הסלולרי מדויק באמצעות מונה תא.
הערה: בדרך כלל 5,000 תאים לכל טוב מספיקים להיווצרות אליפטית על פני רוב שורות תאים הנבדקות. חשוב לספור את התאים במדויק כמו השעית תא בודדת להשוואות גודל מדויקות. - לדלל תאי 5,000 תאים לכל 180 μL במדיום קר (4 ° C).
הערה: התוספת של רכיבי מטריצת קרום במרתף מחדש תשפיע באופן שלילי יעילות transfection ומומלץ כי הוא אינו בשימוש. אופטימיזציה הקו הסלולרית כדי לאשר קיבולת ויוצרי אליפטית ויעילות מציאה צריכה להתבצע לפני המסך. - מעביר את השעית התא למאגר, pipet לערבב ולהוסיף 180 μL היטב כל הצלחת המצורפת אולטרה-נמוך 96-היטב המכילה את siRNA שהוכן קודם לכן (2.1).
- Centrifugדואר הצלחת XG ב 1000 בצנטריפוגה 4 ° C precooled למשך 10 דקות ולאחר מכן לחזור חממה בתרבית רקמה 37 ° C.
- הערה: התאים יופיעו כמו פסיפס בתחתית הבארות. במהלך 12 הבאות - 24 השעות התאים המצרפי יהיו ביחד כדי ליצור כדור בודד.
- לאחר 24 שעות, להתבונן התאים יוצרים אליפטית יחיד במרכז הבאר. הוספת 100 μL של בינוני מלא כל טוב כדי לעודד את הצמיחה.
- לחדש בינוני לאחר שלושה ימים. הוצא בעדינות 100 μL של המדיום מבאר כל ולהוסיף 100 μL של מדיום חדש.
- ביום 7, לכמת את גודל אליפטית האוטומטית על קורא צלחת שיכולה לפקח צמיחת אליפטית כמותית לאורך זמן (ראה סעיף 3).
- לאחר מכן, לקבוע כדאיות התא באמצעות צבע כדאיות התא זורח (ראה סעיף 4).
3. תמונה אוטומטית רכישה
- סרוק את הצלחות על הדמיה צלחת הספסל העליון, מיקרו-היטב cytometer ביום 7.
- <li> פתח את התוכנה, בחר את האפשרויות הבאות: צלחת "טוב -96 ', בחר את סוג הצלחת המתאים וזן שם ניסוי. הערה: כל מידע נוסף ניתן גם להוסיף לתוך התוכנה.
- בחר את היישום 'Tumorsphere'. לשנות את המיקוד כך אליפטית בפוקוס יש ניגודיות אופטימלית.
הערה: אנו ממליצים על דימוי מבוסס מיקוד "כמו וריאציות משמעותיות בגדלים אליפטית צפויות. - בחר את הבארות הדורשות סריקה 'סריקה התחל ".
- שימוש בתוכנת סורק הצלחת, להבטיח כי מסכת האובייקט מייצגת את הגודל אליפטית במדויק. עושים זאת על ידי התאמת קוטר המושבה, התרחבות הגבול, הגדרות עובי ודיוק מינימום, באופן ספציפי עבור כל שורת תאים נבדק 11,12.
הערה: אזור אליפטית אז יחושב באמצעות אלגוריתם תוכנה. לדוגמה, כדי לחשב את השטח במדויק spheroids BT474 גדל במשך שבעה ימים להתאים דיוק ל 'גבוהה'ד להגדיר את קוטר מושבת מינימום 200 מיקרומטר. פעולה זו אמורה לייצר נציג מסכה אליפטית מתאים של אזור אליפטית.
הערה: נתונים אלה לאחר מכן ניתן לייצא מהמכונה, באמצעות פונקציית היצוא, בשינה בצורת קובץ נתונים מבואר. תאריך הוא צלחת החציוני מנורמלת, בשילוב ונותח באמצעות כשל או הבדל סטנדרטי ממוצע לחלוטין (SSMD) לזהות siRNAs אשר השפיע באופן מובהק סטטיסטי על אזור אליפטית.
4. קביעת כדאיות התא
- לאחר באזור אליפטית חושב, לקבוע את הכדאיות באמצעות צבע תא כדאיות זורח. כן מגיב בהתאם להוראות היצרן.
- מוציאים בזהירות 100 μL של המדיום מבאר כל ולהוסיף 100 μL של צבע הכדאיות. דגירת צלחות במשך 15 דקות ולאחר מכן סרוקות באמצעות קורא צלחת זורח.
הערה: נתונים אלה לאחר מכן ניתן לייצא מהמכונה, באמצעות פונקציית היצוא, ב בבצורת קובץ נתונים מבואר. תאריך הוא צלחת החציוני מנורמלת, בשילוב ונותח באמצעות כשל או הבדל סטנדרטי ממוצע לחלוטין (SSMD) לזהות siRNAs אשר השפיע באופן מובהק סטטיסטי על כדאיות אליפטית.
Representative Results
מבחני אליפטית בהתקשרות אולטרה-נמוכה 96-גם הצלחות לספק הערכה פנוטיפי תפוקה גבוהה עבור oncogenicity פוטנציאל בהקשר זה יותר בקלות משחזר את התנאים הפיזיולוגיים נמצא בסרטן in vivo. אכן, שורות תאי הסרטן MCF10DCIS.com וצורת BT474 מבנים אליפטית חזקים (איור 1 א) וחקירת immunohistological סעיפים אליפטית הראו שינויים מובחנים במורפולוגיה הסלולר גרעינית. במשך הזמן, כמה spheroids כגון spheroids BT474 לפתח אזורים נמקי, תכונה משותפת של גידולים מוצקים אגרסיבי (איור 1B). Spheroids מסוימת אינה לפתח ליבות נימקים, כגון קו הסלולרי מד"א- MB-231, אבל לעשות תצוגת וריאציה מסומנת בסמן השגשוג Ki67, אשר ביחס הפוכים בקורלציה עם ביטוי caspsase -3 בקע, סמן של אפופטוזיס (איור 1 ג). כדי לקבוע כי שורות תאים מרובים הם אכן רג'פמגני אוזניים כדי BT474 להשתקת גנים בתיווך siRNA, MCF10DCIS.com, מד"א- MB-231 ותאי JIMT1 היו transfected הפוכה עם siRNA במשך שבעה ימים. הנוכחות של מגיב transfection (מדומה) או transfection של siRNAs מלאה לא הייתה השפעה על כדאיות אליפטית, תוך השתקה של הגן חיוני יוביקוויטין B (UBB) הכדאיות אליפטית הקטינה באופן משמעותי בכל שורות תאים שנבדקו (איור 1D).
עצבנו ספריית siRNA אנושית שהקיפה את הגנים שעברו מוטציה בתדירות הגבוהה ביותר שלא נבחר, ER +, HER2 + וסוגי סרטן שד שלילי לשלושה סמנים. ספריה זו כוללת גנים של פונקציה ידועה, כגון MYC, PIK3CA ו TP53 ואלה שתרומתם סרטן אינו מבוסס דיו. המסך כולל גם מספר siRNAs השליטה הלא מיקוד (בקרת # 1, בקרת # 2) ו siRNAs מיקוד גנים חיוניים, כגון PLK1 ו UBB, אשר פועלים כמו הרג שולטת (טבלה 1). בחרנו להשתמש canc השדאה שורות תאי BT474 כפי שהם יוצרים קושי spheroids ללא תוספת של קרום במרתף מחדש, מוקמות שורות תאי סוס עבודה ויש ארכיטקטורת גנומי ידועה. לדוגמא, תאי BT474 הם חיוביים עבור קולטן אסטרוגן (ER +), ביטוי היתר לקולטן גורם הגדילה באפידרמיס אדם 2 (HER2 +) ומוטציות נמל TP53 (E285K) ו PIK3CA (K111N) 13.
העסקת הפרוטוקול שתואר לעיל, אנו פיקוח דלדול גן ההשפעה היה על גודל כדאיות אליפטית לאחר שבעה ימים של transfection ההפוכה siRNA (האיור 1E). מעניין לציין, כי רוב הגנים לא להיות השפעה מהותית על תחום אליפטית או כדאיות (איור 2 א). השתקת FOXO3, PIK3CA, ERBB2 ו SF3B1, הביא לקיטון לשחזור המשמעותי ביותר גודל אליפטית. הפחתה זו נצפתה גם כדאיות אליפטית לאחר השתקת ERBB2 ו SF3B1. בנימה מעודדת, אנו confirmed השפעת PIK3CA, ERBB2 ו SF3B1 השתקה על גודל אליפטית באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2 ב). כבר זיהינו SF3B1 כמו גן חיוני במודלים שורת תאים רבים ובכך siSF3B1 מייצג פקד הרג טוב בנוסף UBB 14. מעניין לציין, כי כל 200 גנים בלבד והשתקת E-cadherin הביאה לעלייה משמעותית הכדאיות אליפטית (איור 2 א). חקירת מורפולוגיה אליפטית הראתה כי E-cadherin השתקה הביאה פירוט מלא של אדריכלות אליפטית, עם תאי קיימא הנשענים על הקרקעית של הקובץ המצורף הנמוך היטב (איור 2 ב). reinvestigation הידני של נתוני מסך נפח אליפטית הראה כי גם זה נצפה אבל שנוטרל מן כימות באזור בשל חפץ להיות מעל מגבלות גודל סט. מודגש כמו בעבר, תאי BT474 overexpress טירוזין קינאז קולטן HER2 נמל מוטציה שבעור ב PIK3CA (K111N). אנו מאשרים כי השתקת ERBB2 ו PIK3CA הביאה כדאיות אליפטית מופחתת ואילו transfection עם פקדים ללא מיקוד לא הייתה השפעה (איור 2 ג).
הבא חקרנו את ההשפעה של דלדול siRNA על היסטולוגיה אליפטית. spheroids BT474 היו transfected הפוכה עם siRNA השליטה הלא מיקוד siRNAs מיקוד PIK3CA, ERBB2 ו UBB. השתקת ERBB2 ו UBB הביאה לירידה של הסמן פרו-שגשוג Ki67 לעומת שליטת siRNA (איור 2 ד). ההפעלה של הסמן פרו-אפופטוטיים בקעה caspase-3 נצפה רק לאחר השתקת UBB, הדבר המצביע על דלדול של HER2 ו PIK3CA לא לגרום אפופטוזיס אבל היה cytostatic ולא ציטוטוקסיות. ואכן, השתקת HER2 ו PIK3CA לא לגרום לעלייה בביטוי חלבון של p27 חלבון מעצר התא מחזור לעומת שליטה spheroids transfected.
אף אוזן גרון "FO: keep-together.within-page =" 1 "> יחדיו, תוצאות אלה מראים כי תאי BT474 מונעים על ידי בשעור HER2 ו PIK3CA איתות כאשר גדל כמו spheroids 3D יתרה מכך, תוצאות אלו מראים כי אפשר. לתכנן וליישם ספריית הקרנת siRNA העידה של מאה גני spheroids קו תאים סרטניים וחסון ו reproducibly.
איור 1: אופטימיזציה Cell קו לצמיחת 3 ממדים. א שורות תאי סרטן השד, MCF10DCIS.com ו BT474 היו בתרבית צלחות מצורפות נמוכות למשך 7 ימים. תמונות מייצגות Brightfield נלקחו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. ב MCF10DCIS.com ו spheroids BT474 היו בתרבית במשך 28 ימים. 100 μL של תקשורת הטריה היה מתחדש כל 3 - 4 ימים. Spheroids היה קבוע 3.8% פורמלדהיד, דוארmbedded, מחולק ומוכתמים hematoxylin ו eosin (H & E). נציג תמונות מוצגות בהגדלה נמוכה וגבוהה. ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר ו 33 מיקרומטר, בהתאמה. ג spheroids מד"א- MB-231 היו בתרבית במשך 21 ימים. 100 μL של תקשורת הטריה היה מתחדש כל 3 - 4 ימים. Spheroids תוקנו בפורמלין 3.8%, מוטבע, מחולק ומוכתם Ki67 ו ביקע caspase-3. נציג תמונות מוצגות. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. ד BT474, MCF10DCIS.com, מד"א- MB-231, ו JIMT1 שורות תאים היו transfected הפוכות עם (מגיב transfection בלבד) המדומה ואת siRNAs המלא UBB, צלחות מצורפות נמוכות במיוחד היו הסתחררו יוצרי spheroids. בינוני טרי (100 μl) נוספה בימים 1 ו- 4. לאחר 7 ימים, כדאיות התא היה לכמת. נתונים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שני משכפל ביולוגי עצמאי בוצע בשלושה עותקים המנורמלים לשלוט # 1. מובהקות סטטיסטיות חושבו באמצעות unpaסטודנטים IRED מבחן t (p <0.05). א תרשים זרימה המסכם את פרוטוקול transfection הפוכה נהג לחקור תלות גן פונקציונלי spheroids קו תאים סרטניים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: חקירת הגנום פונקציונלי של תלות בשעור חושף BT474 Spheroids. תאי א BT474 היו transfected הפוכות עם ספריית siRNA siGENOME אדם 200-גן בשלושה עותקים. גודל ואת הכדאיות אליפטית נצפו. ערכים נתונים גולמיים היו מנורמל ו- Z-score החציוני צלחת חושבו לזהות חריגות משמעותיות יותר מאשר 1.7x סטיית התקן של צלחת 15 החציוני. הערה גנים הפריפריה ERBB2, SF3B1, PLK1 ו UBBnd E-CAD. siRNAs כי גדל באופן משמעותי או מופחת באזור ואת כדאיות אליפטית מוצללות בצבעים כחול ואדום, שבו אדום מתאר את השליטה siRNA. תאים ב היו transfected הפוכות עם שליטה ללא מיקוד, E-cadherin (E-CAD), PIK3CA, ERBB2 או UBB siRNA ואז הסתובבו צלחת מצורפת נמוכה במיוחד כדי ליצור spheroids. לאחר 7 ימים, Brightfield תמונות אליפטית נציג נלקחו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. תאי ג היו transfected הפוכות עם ללא מיקוד שליטה, PIK3CA, ERBB2 או UBB siRNA ואז הסתובבו צלחת מצורפת נמוכה במיוחד כדי ליצור spheroids. לאחר 7 ימים, כדאיות התא היה לכמת. נתונים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שני משכפל ביולוגי עצמאי בוצע בשלושה עותקים המנורמלים לשלוט # 1. המובהקות הסטטיסטית חושבה באמצעות מבחן t-מזווג סטודנטים (p <0.05). ד לאחר 7 ימים, spheroids שתוקן, מוטבע, מחולק ומוכתםעבור H & E, Ki67, ביקע caspase-3, ו p27. נציג תמונות מוצגות. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. הערה H & E של spheroids siControl להיראות קטנות יותר עקב artefact של spheroids עיבוד הפרט ללא פגע שנבחר מכתים. עם זאת אין בכך כדי לגרוע מן השינויים שנצפו עם התמונות הסרוקות ותוצאות כדאי תא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ללא מיקוד 1 | TP53 | DST | KMT2C | מטופל 1 | FCGBP | ARID1B | FBXM7 | TTC40 | ללא מיקוד 2 | ||
| GATA3 | TTN | MUC12 | MUC4 | AHNAK | HUWEI1 | DNAH11 | ITPR2 | ABCA13 | CREBBP | ||
| MAP2K4 | PIK3CA | F5 | apoB | ANKRD30A | MUC17 | DNAH17 | LAMA2 | אֵס | CSMD2 | ||
| STARD9 | USH2A | FAT3 | LPR2 | CSMD3 | MYO18B | DNAH5 | MDN1 | ARHGAP5 | DNAH9 | ||
| CXCR3 | MUC16 | RB1 | PKHD1L1 | DNAH2 | SYNE2 | DYNC1H1 | PCLO | CACNA1B | ERBB2 | ||
| PLK1 | SYNE1 | LYST | PTEN | SPTA1 | מטופל 2 | VHL | RYR1 | COL6A3 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ללא מיקוד 1 | ENAM | RYR2 | BRCA2 | מטופל 1 | FMN2 | HECW1 | LAMB4 | סִי | ללא מיקוד 2 | ||
| FHOD3 | MACF1 | RYR3 | C2ORF16 | DMD | FRG1 | HERC2 | MYH11 | STAB1 | ZDBF2 | ||
| GOLGA6L2 | חוֹד | SMG1 | CACNA1E | DNA14 | GCC2 | HIVEP2 | NIPBL | TANC1 | ZNF536 | ||
| HMCN1 | NF1 | UBR5 | CACNA1F | DYNC2H1 | GON4L | HYDIN | PKD1L1 | TF | ANK3 | ||
| HRNR | OBSCN | USP34 | CYMA5 | FAM208B | GPR112 | ITSN2 | RNF213 | TPR | ASPM | ||
| PLK1 | PCDH15 | XIRP2 | COL7A1 | FLG2 | מטופל 2 | VHL | SAGE1 | UNC80 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ללא מיקוד 1 | DCHS2 | MUC5B | ZFHX4 | מטופל 1 | MYO9A | SPHKAP | CXORF22 | NCOR1 | VPS13D | ||
| DMXL2 | MXRA5 | ANK2 | KIAA1210 | PRUNE2 | "טש | DANH6 | NOTCH2 | ANKRD12 | |||
| BIRC6 | DNAH10 | TENM1 | כַּספּוֹמָט | LRP1 | SCN10A | VPS13C | DNAH7 | SPEN | C5ORF42 | ||
| CDH1 | DNAH3 | PEG3 | DIDO1 | MAP1A | SCN2A | IPTR3 | ERBB3 | SRRM2 | CCDC88A | ||
| CUBN | NOCK11 | RELN | DNAH8 | MED12 | SHROOM2 | CEP350 | FAT4 | SZT2 | CHD4 | ||
| PLK1 | EYS | שקי | KIAA1109 | MED13 | מטופל 2 | KMT2A | VPS13A | UBB | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ללא מיקוד | QSER1 | ARID1A | WDFY3 | מטופל 1 | SDK1 | TEX15 | LAMA1 | ללא מיקוד 2 | |||
| COL14A1 | SHROOM3 | ATRX | EFCAB5 | SF3B1 | CBFB | AHNAK2 | |||||
| CSMD1 | TBX3 | KIAA0947 | FOXA1 | ITPR1 | DDX3X | KIF4A | |||||
| MEFV | UBR4 | MYCBP2 | INPPL1 | FLG | HECTD4 | FAT2 | |||||
| MGAM | Vcan | NBEAL1 | MAP3K1 | AKAP9 | GPR98 | FOXO3 | |||||
| PLK1 | ZNF462 | SETX | NRP1 | HERC1 | מטופל 2 | VHL | UBB | ||||
טבלה 1: פריסה פלייט ו- Human siRNA הספרייה דה-קונבולוציה. הטבלה מכילה את התוכן של כל ברכות siRNA והפריסה עבור הצלחות המצורפות הנמוכות המשמשות במסך.
Discussion
תלת ממד דגמים של הסרטן שמתבצעים מועסקים ויותר להעריך את היעילות של תרכובות ידועות רומן אשר עוצבו להרוג באופן סלקטיבי תאי סרטן. Spheroids תאים סרטניים הם מבנים המציגים תנאים נוספים הדומים לאלה נתקל בגידולים in vivo, ובכך תרכובות גדלו יעילות 3D נוטים יותר להיות השפעה in vivo. עם זאת, שיטות אלו אינן מאפשרות זיהוי של מטרות רומן פוטנציאל שלא היו הנושא תכנון תרופות, שיכולה להיות להם יעילות רבה בטיפול בסרטן.
פיתחנו גישה גנומיקה תפקודית siRNA שאיפשרו להשתקת גנים עמיד למשך עד שבעה ימים spheroids קו תאים סרטניים. ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול הדורשים ייעול לפני מסך siRNA יכול להתבצע. היכולת ליצור spheroids קיימא לשחזור בקנה מידה גדול היא חיונית. יתר על כן,תנאי transfection ppropriate צריכים להיות מותאמים בקפידה. אנו ממליצים trialing מספר ריאגנטים transfection שונים עם זכויות שאינן מקנות מיקוד המתאים והרג שולטת לפני שתנסה המסך. הצלחנו להראות כי שורות תאים סרטניים כמה נפוץ השד, כלומר BT474, MCF10DCIS.com, מד"א- MB-231 ו JIMT1 היו מקובל transfection siRNA. יתר על כן, אנו מספקים הוכחה של עיקרון נתונים ההקרנה 200 ביותר גנים שעברו מוטציה לעתים קרובות סרטן השד spheroids BT474, אישר את תלותם הגברה של HER2 מוטציה בשעור של PIK3CA. מעניין, השתקה של FOXO3 גורם שעתוק הביא לירידה בגודל אליפטית אך ללא השפעה משמעותית על כדאיות. FOXO3 ידוע להסדיר את התגובה היפוקסיה, לשנות את קיבולת המטבולית של תאי סרטן ומאפשר להם להסתגל ביתר קלות לסביבתם 16. תפקיד זה באופן פוטנציאלי יכול מפריעים לקריאת כדאיות התא כפי שהוא מזהה שפע ATP, אחד המוצרים העיקריים של חילוף חומרים בתא.
בתמיכה של התצפית של צמצום גודל אליפטית, הוכיח כי השתקת FOXO3 ב הלה xenografts לקוי צמיחת גידול לאפופטוזיס 17. חשוב לציין כי חלק גנים עשויים להשפיע לרעה על יכולתו של תאים סרטניים שומרת על ארכיטקטורת 3D שלהם, אשר עלול לגרום חיוביות שגויות. לדוגמא, מציאה של E-cadherin הביאה לפירוק המבנה אליפטית BT474. זה בעבר דיווח באמצעות E-cadherin ממוקד נוגדנים 18. כמו עם כל פלטפורמת הקרנה, מטרות פוטנציאליות, יש rescreened להעריך את השחזור של האפקט שנצפה. ישנן מגבלות על הטכניקה, כלומר האופי הזמני של מציאת הגן בתיווך siRNA. מתמשכת השתקה יותר משבעה ימים לא היה בר השגה עם siRNA.
היתרון של גישה זו הוא כי זה יכול להיות בשילוב עם סביבה אקולוגית שונה אחרתצבעי tric ולא רק במקומות להעריך כדאיות אליפטית, למשל, מתן מידע מרחבים של היפוקסיה אליפטית או ניטור תאים העוברים אפופטוזיס. יותר מכך, כיוון הסריקות קוראות צלחת יחסי מהירות ולא פולשנית, ההשפעה של siRNAs על גודל אליפטית ניתן להעריך לאורך זמן ולא רק בנקודת הסיום הניסיונית. ואכן, אנו בוחנים בימים אלה כמה אפיקים אלה נמצאים בצנרת ההקרנה שלנו. גישה חלופית אשר מנצלת תרבויות 3D לזהות תלות רומן היא השימוש בספריות כימיות המעכבות או מגוון רחב של מטרות או משפחות מסוימות של חלבונים. ואכן, Bitler et al. מנוצל גישה ממוקדת זו כדי לזהות את האינטראקציה הקטלנית הסינטתית בין מעמד ARID1A ומעכבי EZH2 ב קרצינומה תאים הברורה השחלות 19. התגלית של עריכת טכנולוגיה גנים CRISPR-Cas9 אפשרה גם לפיתוח מסכי גנטי בתרבויות organoid in vivo. עם זאת, לאגישתו תלויה שיש מתקני חיה מתאימים וניתן לעלות 20 מונע.
לסיכום, אנו מאמינים כי גבשנו פרוטוקול בצורה מדויקת יותר מודלים הדרגתי חמצן וחומרי הזנה, שהן תכונות של microenvironment גידול in vivo, המאפשרות זיהוי של מטרות סרטן רומן או אימות חזקות של יעדים שנקבעו. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם על כל סוג של שורת התאים המהווה spheroids ומכאן ניתן להשתמש באופן שגרתי דעה בקהילת חקר הסרטן למסכי siRNA תפוקה גבוהה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200 μL) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10 μL) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1, 000 μL) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5 mL) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture CO2; Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
References
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
