Abstract
Kanserde fonksiyonel sürücü olayların tanımlanması yeni ilaç hedefleri nesil keşif için kanser biyolojisi anlayışımızı sürdürmek için merkez ve vazgeçilmezdir. Bu kanser daha karmaşık modeller in vivo tümörogenez sürücü ve klinik çalışmalar klinik öncesi modellerde geçiş yapmak yeni tedavilerin etkinliğini artırmak katkıda bulunan faktörlerin tam takdir için gerekli olduğunu belirgin hale gelmektedir.
Burada siRNA fonksiyonel olan tarama işlemine tabi tutulabilir tip ve yeniden üretilebilir bir tümör parçacıklarının üretilmesi için bir yöntem sunulmuştur. Bu sferoidler klasik iki boyutlu kültüründe mevcut değildir katı tümörlerde bulunan birçok özellikleri gösterir. Bir çok yaygın olarak kullanılan bir meme kanseri hücre çizgileri bu protokol için uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, proof-of-prensibi meme kanseri hücre hattı BT474 kullanan veri sağlamak, teyit onlarınfosfatidilinositol-4,5-bifosfat 3-kinaz (PIK3CA) epidermal büyüme faktörü reseptörü, HER2 ve mutasyon amplifikasyonu bağımlılık, tümör sferoidler olarak yetiştirilen. Son olarak, biz daha fazla araştırmak ve immünohistokimyasal kullanarak bu bağımlılıkları mekansal etkisini teyit edebiliyoruz.
Introduction
Solid tümörler başarıyla hastaları tedavi edememek önemli bir meydan okuma ile klinisyenlerin sunan önemli histolojik, genetik ve mikro-çevre içi tümör heterojenitesini, görüntüler. roman tanımlamak için kullanılan modellerin çoğunluğu tedavileri bu özelliklerin birçoğu dahil değil hedef. Gerçekten de, klinikte kullanılan mevcut hedeflenen tedavi, iki boyutlu (2D) kültür koşulları altında yetiştirilir kanser hücre hatları kullanan tarama yaklaşımı kullanılarak, son on yıl içinde geliştirilmiştir. Bu tür reseptör tirozin kinaz inhibitörleri gibi çeşitli başarıları, hakkında getirmiş olmasına rağmen, kanser daha karmaşık modeller tam in vivo tümörogenez sürücü ve geçiş yapmak yeni tedaviler sayısını artırmak katkıda bulunan faktörlerin takdir için gerekli olduğunu belirgin hale gelmektedir klinik çalışmalarda, önceden klinik modelleri. Ayrıca, şimdi de 2B kültür sistemlerinde yansıtmak için başarısız olduğunu takdirdavranışı 1,2 vivo. Örneğin, zayıf vaskülarize tümörlerde mikro olan oksijen ve besin elde etmek için talep arz geçebilir olarak, yüksek ve düşük doğum bölgeleri geliştirir. Karbonik anhidraz IX (CAIX) olarak kurulan hipoksik belirteçleri tümör bölümlerinin imünohistokimyasal lekelenmesi ile tespit edilen tümör düşük oksijen (hipoksi) varlığı, meme kanseri daha kötü bir klinik sonuç 3,4 Böylece içeren özellikler gibi korelasyon tarama modellerine hipoksi in vivo daha etkili olacak yeni ilaç hedefleri keşfetmek için kapasitemizi artırmak olabilir. Nitekim, hipoksi ihtiva başarıyla hedefleyen agresif tümörler klinik öncelik 5'tir.
daha doğru bir şekilde tümörün mikro kanser hücreleri tarafından karşılaşılan koşullar elemanlarını özetlemek amacıyla geleneksel 2D siRNA tarama değiştiren, bir kaç genin tanımlanması inci yol açmıştırin vivo tümör büyümesi için önemli olduğu tespit edilmiştir. Bu düşük serum koşullarına 6, hipoksik koşullarda 7 altında ve kombinasyon 8 gerçekleştirilen fonksiyonel genomik ekranlar yer alıyor. Düşük serum yetiştirilen Örneğin, 6-fosfofrukto-2-kinazı / Fruktoz-2,6-bisfosfataz 4 (PFKFB4), karbon giren glikolizi düzenlenmesinden sorumlu bir protein susturulması, metastaza türetilmiş prostat kanser hücre apoptoza neden olmuştur. Aynı koşullar altında, normal prostat hücre hatlarında PFKFB4 susturulması ise PFKFB4 bölgesinin tüketimi, tam olarak, prostat kanseri hücre kuşağının büyümesinin 6 ksenogrefleri ablasyon, hiçbir etkisi yoktu.
göğüs kanseri hücre çizgilerinin uzun bir panelinde, mono- karboksilaz taşıyıcı 4 (MCT4) susturulması, tercihen, düşük oksijen koşullarında hücre hattı büyüme azalmasına neden olmuştur. Bu güvenlik, meme kanseri hücre dizisi ortotrop xenogra in vivo olarak doğrulandıFTS. besin stres koşulları altında Belki de en çarpıcı, Asetil-CoA sentetazı 2 (ACSS2), asetil-CoA içine asetat dönüştürmekten sorumlu bir enzim susturma, indirgenmiş kanser hücre numarası (düşük oksijen ve serum), ancak, normal kültür koşulları altında çok az veya hiç etki 8. ACSS2 ablasyonu besin gradyanlar tümör mikroçevresinin içinde ve bu bölgelerde ikamet hücreler tümör ilerlemesi 8 için gerekli olduğu izole yoktur düşündürmektedir meme ve prostat kanseri xenogreftler büyümesini etkiledi. Ayrıca, ACSS2 da tümörlerinde artış ACSS2 aktivitesi olmayan koşullarda büyümesini destekleyen temel mekanizma olabileceğine işaret etmektedir, glioblastoma ve hepatoselüler karsinom 9,10 önemli olduğu bulunmuştur.
Toplu olarak, bu çalışmalar, in vivo olarak karşılaşılan koşullar yansıtan ve siRNA ekranlar performans g saptanmasına olanak kanıtlamakKanser yaşam için gerekli enes. Yanı sıra besin stres koşulları altında 2B ve kanserli hücrelerin büyümesi etki olarak bu çalışmalar, hedef gen tükenmesi tümör ksenograftlarının 6,8 gözlenmiştir ne yansıtma, kanser hücre hattı sfero büyümesini inhibe etti. Böylece, kanser hücre hattı sferoidler ACSS2 susturulması duyarlılık kazandırmak tümör mikroçevresinde karşılaşılan durumların birkaç içerir. Gerçekten de, sferoidler besin gradyanlar (serum ve oksijen), pH değişiklikleri gösterir, üç boyutlu (3D) hücre-hücre teması hem de, hücre siklüs hapsine ve apoptozise hücre proliferatif sürat değişiklikler. Bu nekrotik bölgeler, kanser sferoidler varlığı ile tarif edilmektedir, özelliği geleneksel 2B kültür bulunamadı.
Kanser hücresi sferoidler önce küçük molekül inhibitörleri taranması için daha fazla biyolojik ilgili model olarak kullanılmıştır, ancak bu, sadece bileşik, etkinlik doğrulanması veya kaçakları repurposing sağlar adresunds başlangıçta diğer hastalıklar 11 için tasarım. Mevcut sferoid tarama yöntemleri, yüksek içeriği şekilde bir yüksek verimlilik belirli bir gen tükenmesi analiz için izin yoktur. Burada, ilk kez tarif, kanser hücre hattı sferoidler küçük müdahale edici RNA (siRNA) teknolojisini kullanan spesifik gen bağımlılıkları ortaya çıkarılması için fonksiyonel genomik boru hattı. Biz insan meme kanserlerinde 200 en sık mutasyona uğramış genleri hedefleyen siRNA'lar ile ısmarlama kütüphane tasarlanmış ve BT474 meme kanseri küresellerde sfero büyüklüğü ve metabolik aktivitesi üzerine gen tükenmesi etkisi değerlendirildi. Biz sağlam ve tekrarlanabilir ERBB2 ve PIK3CA 3D kültürlerde susturma etkisini tespit başardık. Ayrıca, biz immünhistokimya kullanarak BT474 sferoidler mekansal mimarisi üzerine gen tükenmesi etkisini değerlendirmek olabilir.
Protocol
96-iyi siRNA Tabaklar 1. Hazırlık
Not: 96 oyuklu bir plakanın dış kenarları, böylece 60 ve 96 oyuklu her plakaya siRNA'lar miktarını sınırlamak, kuyu göre buharlaştırma daha yatkındır. Bu sınırlamak için düz orta veya PBS ile dış kuyularda doldurun. Buna ek olarak, isabet bir doğrulama ekranı plakası yanlılığı hafifletmek için tavsiye edilir.
- Ultra-düşük bağlanma plakasının uygun kuyulara 500 ng / (üreticinin önerilerine göre) azalmış serum ortamında uL ve Aliquotların 10 mcL - 250 siRNA'lar sulandırmak. üç nüsha olarak tüm ekranları gerçekleştirin.
NOT: transfeksiyon verimliliği değerlendirilebilir sağlamak için plaka tasarımı uygun olmayan hedefleme (negatif) ve (örneğin, UBB ve PLK1 olarak, pozitif) öldürme siRNA kontrolleri ekleyin. Hücreler transfeksiyon karışımı eklenir olarak siRNA çalışması için düşük bağlanma plakalarının kullanımı kritiktir. Biz ekarte edemez bazı üreticiler, ultra-düşük ekiPlakalar sfero büyüme üzerinde ince etkileri olabilir. Bu nedenle bu son kullanıcı tarafından test edilmelerini tavsiye ederiz. - -20 ° C'de yapışkan mühürler ve mağaza ile kapak plakaları.
Hücre Hattı 2. Ters Transfeksiyon
- Ekranın gün, oda sıcaklığında plakalar defrost bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 1000 x g'de 5 dakika boyunca dönerler. her bir çok kanallı pipet kullanarak optimize transfeksiyon reaktifi ihtiva eden düşük serum ortamı 10 uL ekleyin. oluşturmak için siRNA ihtiva eden transfeksiyon komplekslerinden 15 dakika boyunca plakaları bırakın.
Not: Bu çalışma, (% 10 fetal bovin serumu (FBS) ve antibiyotikler ile desteklenmiş yüksek glukoz DMEM içinde kültürlenir (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı)) fonksiyonel genomik tarama için göğüs kanseri hücre çizgisi, BT474 kullanılmaktadır. - taranabilir hücreleri (% 0.05 tripsin ve 0.53 mM EDTA) bu şişeden ayrılana kadar, hücre hattı Belir uygun hacmi kullanılarak nötralize tripsinizeBir tezgah üstü santrifüj ic orta ve 1.000 xg'de 5 dakika boyunca sıkma tripsin kaldırmak için. ortamın uygun bir hacmi ile hücrelerin tekrar ve bir hücre sayacı kullanılarak, doğru hücre sayısını belirlemek.
NOT: Tipik haliyle, oyuk başına 5000 hücre Test edilen bir çok hücre çizgileri boyunca küremsi oluşturulması için yeterlidir. Doğru doğru boyutlu karşılaştırmaları için tek bir hücre süspansiyonu olarak hücreleri saymak için önemlidir. - Soğuk ortam (4 ° C), 180 uL başına 5.000 hücre hücreleri seyreltilir.
Not: tekrar oluşturulmuş temel membran matris bileşenlerinin eklenmesi negatif transfeksiyon verimini etkileyecek ve kullanılmadığı önerilir. Hücre hattı optimizasyonu küremsi oluşturulması kapasitesine teyit etmek ve yok etme yararı ekranına önce yapılmalıdır. - bir hazneye hücre süspansiyonu aktarın pipet karıştırın ve siRNA (2.1) önceden hazırlanmış ihtiva eden 96 oyuklu ultra düşük bağlanma plakanın her oyuğuna 180 uL ekleyin.
- CentrifugE 10 dakika boyunca önceden soğutulmuş 4 ° C'de santrifüj 1000 xg'de levha ve daha sonra 37 ° C doku kültürü inkübatöründe geri dönün.
- NOT: Hücreler kuyuların dibinde bir mozaik olarak görünecektir. Gelecek 12 üzerinde - 24 saat hücreleri tek bir küre oluşturmak için bir araya toplar.
- 24 saat sonra, hücreler, kuyunun merkezinde tek sfero formu dikkate alınmalıdır. büyümeyi teşvik etmek için her bir tam ortam, 100 uL ekleyin.
- Üç gün sonra ortam doldurun. Yavaşça her bir ortamdaki, 100 uL çıkarın ve taze ortam 100 uL ilave edin.
- 7. günde, nicel zaman küremsi büyüme izleyebilir, bir plaka okuyucusu üzerinde otomatik küremsi boyutunu ölçmek (bakınız Bölüm 3).
- Daha sonra, bir ışık saçan hücre canlılığı boya (Bakınız Bölüm 4) kullanılarak hücre canlılığı belirler.
3. Otomatik Resim Alma
- sitometresi 7. günde bir tezgah üstü, mikro-plaka görüntüleme plakaları tarayın.
- <, '96 Eh plaka 'uygun plaka türünü seçin ve bir deneme adı girin: li> Aşağıdaki seçin yazılımını açın. NOT: Herhangi bir ek bilgi de yazılım içine eklenebilir.
- 'Tumorsphere' uygulamasını seçin. sfero odakta ve optimal kontrast, böylece odağı değiştirin.
NOT: 'Görüntü tabanlı odak' beklenen sfero boyutlarda olduğu gibi önemli değişiklikler önerilmektedir. - tarama ve 'Start taraması' gerektiren kuyu seçin.
- plaka tarayıcı yazılımı kullanarak, nesne maske doğru sfero boyutunu temsil eder emin olun. Koloni çapı, sınır dilatasyon, minimum kalınlık ve hassas ayarlarını ayarlayarak bunu yapın, her bir hücre hattına özgü 11,12 test etti.
NOT: sfero alan daha sonra yazılım algoritması kullanılarak hesaplanır. Örneğin, doğru 'yüksek' bir karşı hassasiyetini ayarlamak yedi gün için yetiştirilen BT474 sferoidler alanı hesaplamak içind 200 uM minimum koloni çapı ayarlayın. Bu sfero alanın uygun bir steoid maskesi temsilcisine üretmek gerekir.
NOT: Bu veriler daha sonra açıklamalı veri dosyası biçiminde de ihracat işlevini kullanarak, makineden ihraç edilebilir. Tarih plaka medyan normalize, kombine ve sfero alan üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi vardı siRNA'lar tespit edilmesi için analiz ya z-score veya kesinlikle standardize ortalama fark (SSMD) gereğidir.
4. Hücre Canlılık Belirlenmesi
- sferoid alanı hesaplandıktan sonra, parlak bir canlılık hücre boya kullanılarak canlılık belirler. üreticinin talimatlarına göre reaktif hazırlayın.
- Dikkatle her bir ortamdaki 100 uL kaldırmak ve canlılık boya 100 mcL ekleyin. 15 dakika boyunca plakalar daha sonra ışık yayma plaka okuyucusu kullanılarak tarama inkübe edin.
NOT: Bu veriler daha sonra in, ihracat işlevini kullanarak, makineden ihraç edilebiliraçıklamalı veri dosyasının biçimi. Tarih plaka medyan normalize, kombine ve sfero canlılığı üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi vardı siRNA'lar tespit edilmesi için analiz ya z-score veya kesinlikle standardize ortalama fark (SSMD) gereğidir.
Representative Results
Ultra-düşük bağlanma 96 oyuklu plakalar küremsi deneyler hali hazırda daha tümörlerin in vivo bulunan fizyolojik koşulları tekrarlar bir ortamda potansiyel onkojeniklik için yüksek verimli bir fenotipik değerlendirme sağlar. Gerçekten de, kanser hücre çizgileri MCF10DCIS.com ve BT474 bir şekilde sıkı bir sferoid yapılar (Şekil 1A) ve sferoid bölümlerin immünohistolojik araştırması, hücresel ve nükleer morfolojisinde belirgin bir mekansal değişiklikler gösterdi. Zamanla, örneğin BT474 küremsi gibi küremsi nekrotik bölgeler, agresif tümörlerin (Şekil 1B) ortak bir özelliği geliştirmek. Bazı sferoidler gibi MDA-MB-231 hücre hattı olarak nekrotik çekirdeği, geliştirmek, ancak ters yarılan caspsase-3 ifadesi, apoptoz bir belirteç (Şekil 1C) ile ilişkilidir proliferatif işaretleyici Ki67, ekran işaretli varyasyonu yapmıyoruz. birden çok hücre çizgileri gerçekten Recep olan kurmaksiRNA aracılı gen susturma BT474 için tive, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 ve JIMT1 hücreleri ters yedi gün siRNA ile transfekte edilmiştir. Test edilen tüm hücre hatları (Şekil 1D) 'de elzem genin Ubikuitin B (UBB) önemli ölçüde küremsi canlılığının susturma ise transfeksiyon (sahte) bir reaktif veya kontrol siRNA'lar transfeksiyonu varlığı, sferoid ömrü üzerinde hiç bir etkisi olmamıştır.
Biz seçilmemiş en sık mutasyona uğramış genleri, ER +, HER2 + ve üçlü negatif meme kanserleri kapsayan bir insan siRNA kütüphane olarak tasarlanmış. Bu kütüphane gibi myc PIK3CA ve TP53 olan ve katılım karsinoj oluşturulmamıştır gibi bilinen fonksiyon genleri içerir. Ekran aynı zamanda çeşitli sivil hedefleme kontrol siRNA'lar içeren (Kontrol 1. Kontrol # 2) ve siRNA'lar kontrolleri (Tablo 1) öldürme olarak hareket gibi PLK1 ve UBB gibi temel genleri, hedef. Biz meme CAnC kullanmayı tercihbunlar hali hazırda tekrar oluşturulmuş temel membran ilavesi olmaksızın parçacıklarının oluşturulması olarak ER hücre çizgileri, BT474, beygir hücre çizgileri kurulmuş ve bilinen bir genomik mimari sahiptir. Örneğin, BT474 hücrelerinin, östrojen reseptörü (ER +) için pozitif TP53 (E285K) ve PIK3CA (K111N) 13, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2 +) ve liman mutasyonlar aşın.
Yukarıda belirtilen protokolünü kullanan biz etki geni tükenmesi siRNA ters transfeksiyon yedi gün (Şekil 1 E) sonra, küremsi boyut ve canlılığı üzerindeki izledi. İlginç bir şekilde, genlerin büyük bir çoğunluğunun sferoid alan veya canlılığı (Şekil 2A) üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi. FOXO3, PIK3CA, erbB2 ve SF3B1 bir susturma sferoid boyutunda en önemli tekrarlanabilir azalma ile sonuçlandı. Bu azalma, aynı zamanda erbB2 ve SF3B1 susturma sonra küremsi canlılığı gözlendi. Umut verici bir biz confPIK3CA, ErbB2 ve SF3B1 parlak alan mikroskopi (Şekil 2B) kullanılarak küremsi boyutuna susturma etkisi irmed. Daha önce bir çok hücre soyu modellerinde önemli bir gen olarak SF3B1 tanımlanabilir ve siSF3B1 UBB 14 ek olarak iyi bir öldürücü kontrol eder. İlginçtir, e-Cadherin tüm 200 genlerin sadece susturulması steoid canlılığı (Şekil 2A) önemli bir artışa yol açmıştır. Sfero morfoloji İncelenmesi E-Cadherin susturma canlı hücreler de düşük ekin altındaki (Şekil 2B) dinlenme ile, sfero mimarisinin tam bir dökümünü yol açtığını gösterdi. sfero hacmi ekran verilerinin Manuel Soruşturma, bu durum set boyutu sınırlamaları üzerinde olmasını nesneye de gözlenmiştir ama alan ölçümü elendiği olduğunu gösterdi. Daha önce belirtildiği gibi, BT474 hücrelerinin reseptör tirosin kinaz, HER2 fazla sentezleyen ve bir onkojenik mutasyonu PIK3CA (K111N). Bu olmayan hedefleme kontroller ile transfeksiyon etkisi (Şekil 2C) vardı erbB2 ve PIK3CA bu susturulması, indirgenmiş küremsi canlılığı ile sonuçlanmıştır doğruladı.
Sonraki biz sfero histoloji üzerinde siRNA tükenmesi etkisini araştırdık. BT474 sferoidler ters olmayan hedefleme kontrol siRNA ve siRNA'lar PIK3CA, erbB2 ve UBB hedefleme ile transfekte edilmiştir. ErbB2 ve UBB bir susturma Ki67 siRNA (Şekil 2D) kontrol grubuna göre pro-proliferatif markörün bir azalma ile sonuçlanmıştır. pro-apoptotik markörün aktivasyon kaspaz-3, sadece apoptoz ile sonuçlanmamıştır HER2 ve PIK3CA tükenmesinin düşündürmektedir UBB susturma sonra gözlenen daha çok sitotoksik daha sitostatik idi ayrıldı. Gerçekten de, HER2 ve PIK3CA susturulması transfekte sferoidler kontrol ile karşılaştırıldığında hücre döngüsü tutuklama proteini p27 protein ifadesinde bir artışa neden etmedi.
ent "fo: keep-together.within sayfa =" 1 "> Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar BT474 hücreleri onkojenik HER2 ve PIK3CA 3D sferoidler olarak büyüdüğü zaman sinyal tarafından tahrik olduğunu göstermektedir Daha da önemlisi, bu sonuçlar, mümkün olduğunu göstermektedir. tasarım ve sağlam ve tekrarlanabilir kanser hücre hattı sferoidler genlerin yüzlerce ısmarlama siRNA tarama kütüphanesi uygulamak.
Şekil 1: 3 boyutlu Büyüme Hücre Hattı Optimizasyon. C. göğüs kanseri hücre çizgileri, MCF10DCIS.com ve BT474 7 gün, düşük bağlanma plakalarda kültürlenmiştir. Aydınlık Örnek görüntüler, bir ters mikroskop kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubukları 100 mikron =. B. MCF10DCIS.com ve BT474 sferoidler 28 gün boyunca kültürlenmiştir. 4 gün - taze medya 100 uL her 3 doldurulan. Sferoidler% 3.8 formaldehit, e tespit edildimbedded, kesit ve hematoksilin ve eosin (H & E) ile boyandı. Temsilcisi görüntüleri düşük ve yüksek büyütmede gösterilmiştir. Ölçek çubukları sırasıyla 100 mm ve 33 mm temsil etmektedir. C, MDA-MB-231 sferoidler 21 gün boyunca kültürlenmiştir. 4 gün - taze medya 100 uL her 3 doldurulan. Sferoidler,% 3.8 formaldehit sabit gömülü, Ki67 ile kesitli ve lekeli ve kaspaz-3 bölündü. Temsilcisi görüntüler gösterilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 ve JIMT1 hücre çizgileri ters mock (yalnızca transfeksiyon reaktifi) ve kontrol siRNA'lar ve sürenin sonunda alıcı ile transfekte edildi, ultra düşük bağlanma Plakalar daha sonra küreler oluşturma döndürülmüştür. Taze ortam (100 uL) günde 1 ile 4, 7 gün sonra ilave edildi, hücre canlılığı nicelleştirilmiştir. Veriler 1. kontrol normalize üç kopya halinde gerçekleştirilmiş olan iki bağımsız biyolojik çoğaltır ± SD ortalamasını temsil etmektedir. İstatistiksel anlamlılık bir UNPA kullanılarak hesaplandıIRED Öğrenci t-testi (p <0.05). E. işlevsel kanseri hücre dizisi parçacıklarının gen bağımlılık sorgulamak için kullanılabilir ters transfeksiyon protokolü özetleyen bir akış diyagramıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: BT474 küremsi Ortaya Onkogenik bağımlılıklar fonksiyonel genomik İncelenmesi. C. BT474 hücrelerinin ters üç kopya halinde 200 geni insan siGENOME siRNA kütüphanesi ile transfekte edilmiştir. Sferoid boyut ve canlılığı gözlendi. Ham veri değerleri plaka medyan normalize ve z skorları 1.7x daha fazla önemli outliers 15 medyan plaka standart sapma belirlemek için hesaplanmıştır idi. dış genleri Not ERBB2, SF3B1, PLK1 ve UBB böyle birnd e-cad. önemli ölçüde sfero alanı ve canlılığını artırılabilir veya azaltılabilir siRNA'lar kırmızı kontrol siRNA 's tasvir etmektedir, mavi ve kırmızı gölgeli. B. Hücreler ters olmayan hedefleme kontrolü, e-kaderin (E-CAD), PIK3CA, ErbB2 veya UBB siRNA ile transfekte edilmiş ve daha sonra sferoidler oluşturmak üzere bir ultra-düşük bağlanma plakasında döndürülmüştür. 7 gün sonra, Örnek sferoid ve görüntüler, bir ters mikroskop kullanılarak alınmıştır aydınlık. Ölçek çubukları 100 mikron =. Hücreler ters olmayan hedefleme kontrolü, PIK3CA, ErbB2 veya UBB siRNA ile transfekte edilmiş ve daha sonra sferoidler oluşturmak üzere bir ultra-düşük bağlanma plakasında döndürülmüştür. 7 gün sonra hücre canlılığı, nicelleştirilmiştir. Veriler 1. kontrol normalize üç kopya halinde gerçekleştirilmiş olan iki bağımsız biyolojik çoğaltır ± SD ortalamasını temsil etmektedir. İstatistiksel anlamlılık Eşleştirilmemiş Öğrenciler t-testi (p <0.05) kullanılarak hesaplanmıştır. D. 7 gün sonra, sferoidler, sabit gömülmüş, parçalarına ayrılmış ve lekeliH & E, Ki67, Cleaved Kaspaz-3 ve p27 için. Temsilcisi görüntüler gösterilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. siControl küremsi H & E nedeniyle boyanma için seçilen işleme ve bireysel sağlam küremsi bir eserin daha küçük görünür unutmayın. Ancak bu Taranan görüntülerin ve hücre canlılığı sonuçları ile gözlenen değişikliklerden olumsuz etkisi yok. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 1 Sigara hedefleme | TP53 | DST | KMT2C | İşlenmemiş 1 | FCGBP | ARID1B | FBXM7 | TTC40 | 2 Sigara hedefleme | ||
| GATA3 | TTN | MUC12 | MUC4 | AHNAK | HUWEI1 | DNAH11 | ITPR2 | ABCA13 | CREBBP | ||
| MAP2K4 | PIK3CA | F5 | APOB | ANKRD30A | MUC17 | DNAH17 | LAMA2 | ACE | CSMD2 | ||
| STARD9 | USH2A | FAT3 | LPR2 | CSMD3 | MYO18B | DNAH5 | MDN1 | ARHGAP5 | DNAH9 | ||
| CXCR3 | MUC16 | RB1 | PKHD1L1 | DNAH2 | SYNE2 | DYNC1H1 | PCLO | CACNA1B | ERBB2 | ||
| PLK1 | SYNE1 | Lyst | PTEN | SPTA1 | İşlenmemiş 2 | VHL | RYR1 | Col6A3 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 1 Sigara hedefleme | Enam | RYR2 | BRCA2 | İşlenmemiş 1 | FMN2 | HECW1 | LAMB4 | Sİ | 2 Sigara hedefleme | ||
| FHOD3 | MACF1 | RYR3 | C2ORF16 | DMD | FRG1 | HERC2 | MYH11 | STAB1 | ZDBF2 | ||
| GOLGA6L2 | NEB | SMG1 | CACNA1E | DNA14 | GCC2 | HIVEP2 | NIPBL | TANC1 | ZNF536 | ||
| HMCN1 | NF1 | UBR5 | CACNA1F | DYNC2H1 | GON4L | HYDIN | PKD1L1 | TF | ANK3 | ||
| HRNR | OBSCN | USP34 | CYMA5 | FAM208B | GPR112 | ITSN2 | RNF213 | TPR | ASPM | ||
| PLK1 | PCDH15 | XIRP2 | COL7A1 | FLG2 | İşlenmemiş 2 | VHL | SAGE1 | UNC80 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 1 Sigara hedefleme | DCHS2 | MUC5B | ZFHX4 | İşlenmemiş 1 | MYO9A | SPHKAP | CXORF22 | NCOR1 | VPS13D | ||
| DMXL2 | MXRA5 | ANK2 | KIAA1210 | PRUNE2 | TCHH | DANH6 | NOTCH2 | ANKRD12 | |||
| BIRC6 | DNAH10 | TENM1 | ATM | lrp1 | SCN10A | VPS13C | DNAH7 | spen | C5ORF42 | ||
| CDH1 | DNAH3 | PEG3 | DIDO1 | MAP1A | SCN2A | IPTR3 | ERBB3 | SRRM2 | CCDC88A | ||
| CUBN | NOCK11 | RELN | DNAH8 | MED12 | SHROOM2 | CEP350 | FAT4 | SZT2 | CHD4 | ||
| PLK1 | EYS | SACS | KIAA1109 | MED13 | İşlenmemiş 2 | KMT2A | VPS13A | UBB | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Sigara hedefleme | QSER1 | ARID1A | WDFY3 | İşlenmemiş 1 | SDK1 | TEX15 | LAMA1 | 2 Sigara hedefleme | |||
| COL14A1 | SHROOM3 | Ldşftkrd | EFCAB5 | SF3B1 | CBFB | AHNAK2 | |||||
| CSMD1 | TBX3 | KIAA0947 | FOXA1 | ITPR1 | DDX3X | KIF4A | |||||
| MEFV | UBR4 | MYCBP2 | INPPL1 | FLG | HECTD4 | FAT2 | |||||
| MGAM | Vcan | NBEAL1 | MAP3K1 | AKAP9 | GPR98 | FOXO3 | |||||
| PLK1 | ZNF462 | SETX | NRP1 | HERC1 | İşlenmemiş 2 | VHL | UBB | ||||
Tablo 1: Plaka Düzen ve İnsan siRNA Kütüphane De kıvrımlı. tablo ekranında kullanılan düşük bağlanma plakaları için siRNA havuzları ve düzeni her içeriğe sahip.
Discussion
Kanser üç boyutlu modeller, giderek daha seçici bir şekilde kanser hücrelerini öldürmek için tasarlanmıştır bilinen ve yeni bileşiklerin etkisini değerlendirmek için kullanılmaktadırlar. Kanser hücresi sferoidler bu şekilde, 3D etkinliğe sahip bileşikler, in vivo koşullarında bir etkiye sahip olasılığı daha yüksek olan, in vivo olarak tümör karşılaşılanlardan daha benzer koşullar görüntüler yapılardır. Ancak, bu yöntemler kanser tedavisinde önemli etkiye sahip olabilir ilaç tasarımı konusu olmamıştır potansiyel yeni hedeflerin belirlenmesi için izin vermez.
Biz kanser hücre hattı küresellerde yedi güne kadar dayanıklı gen susturma için izin verilen bir siRNA işlevsel genomik yaklaşım geliştirdi. siRNA ekranı uygulanmadan önce optimizasyon gerektirebilir protokole birçok kritik adım vardır. büyük ölçekte yeniden üretilebilir uygulanabilir küreler oluşturma yeteneğini gereklidir. Ayrıca,ppropriate transfeksiyon koşulları dikkatli bir optimize edilmelidir. Biz uygun olmayan hedefleme ile birkaç farklı transfeksiyon reaktifleri trialing ve ekran denemeden önce kontrol öldürme öneririz. Biz MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 ve JIMT1 siRNA transfeksiyon için uygun olan, yani, BT474 olan çeşitli sık kullanılan göğüs kanseri hücre çizgileri, gösterebilmişlerdir. Ayrıca, proof-of-prensibi BT474 sferoidler meme kanseri 200 en sık mutasyona uğramış genleri tarama verileri sağlamak, HER2 yükseltilmesi ve PIK3CA onkojenik mutasyonun olan bağımlılıklarını doğruladı. İlginç bir şekilde, transkripsiyon faktör FOXO3 susturulması sferoid boyutunda bir azalmaya ancak canlılığı üzerinde önemli bir etki ile sonuçlanmıştır. FOXO3 onların çevre 16 daha kolaylıkla uyum sağlayan kanser hücrelerinin metabolik kapasitesini değiştirmek, hipoksiyaya tepki düzenlediği bilinmektedir. ATP bolluğu algıladığı gibi bu rol potansiyel hücre canlılığı okuma olumsuz etkileyebilir, Hücre metabolizmasının ana ürünlerinden biri.
Küremsi boyutunda bir azalma gözlenmesi destek olarak, HeLa FOXO3 bu susturulması tümör büyümesini engellediğini ve apoptosis 17 kaynaklı ksenograftlarının gösterilmiştir. Bazı genler yanlış pozitif sonuç verebilir kendi 3D mimarisi, korumak için kanser hücrelerinin kapasitesini etkileyebilir dikkat etmek önemlidir. Örneğin, E-kaderin demonte BT474 küremsi yapısının çözündü. Bu, daha önce e-Cadherin antikorlar 18 hedef kullanılarak rapor edilmişti. Herhangi bir tarama platformu olduğu gibi, potansiyel hedefler gözlenen etkinin tekrarlanabilirliği değerlendirmek için tekrar elenebilir edilmelidir. tekniği, siRNA aracılı gen demonte yani geçici doğası sınırlamalar vardır. susturma Sürekli daha uzun yedi gün siRNA ile elde değildi.
Bu yaklaşımın avantajı, çeşitli başka biyomunun ile birleştirilebilir olmasıdırtric boyalar sadece sfero hipoksi mekansal bilgi veren ya da apoptoz geçiren hücrelerin izlenmesi, örneğin, sfero canlılığını değerlendirmek olanlar. plaka okuyucu taramaları nispeten hızlı ve non-invaziv çünkü Ayrıca, sfero boyutuna siRNA'lar etkisi zamanla yerine sadece deneysel uç noktasında değerlendirilebilir. Nitekim, şu anda bizim tarama boru hattı olan bu caddeleri birkaç keşfediyoruz. yeni bağımlılıkları tespit etmek 3D kültürleri kullanan alternatif bir yaklaşım hedefleri veya proteinlerin, özellikle ailelerinin geniş bir yelpazesi, ya önleyen kimyasal kütüphanelerin kullanılmasıdır. Gerçekten de, Bitler ve diğ. yumurtalık berrak hücreli karsinom 19 ARID1A durumu ve EZH2 inhibitörleri arasında sentetik öldürücü etkileşimi tanımlamak için bu hedef yaklaşımı kullanılmıştır. CRISPR-Cas9 gen düzenleme teknolojisinin keşfinden da organoid kültürlerinde ve in vivo genetik ekranlar geliştirilmesi için izin vermektedir. Bununla birlikte, TOnun yaklaşımı uygun hayvan tesislerine sahip bağlıdır ve 20 fahiş mal olabilir.
Sonuç olarak, biz bir protokol belirttiğimiz inanıyorum daha doğru modelleri yeni kanser hedefleri ya da kurulmuş hedeflerin sağlam doğrulama belirlenmesi için izin vivo tümör mikro özellikleri, oksijen ve besin gradyanlar. Ayrıca, protokol sferoidler oluşturur ve bu nedenle düzenli olarak yüksek verimli siRNA ekranlar için kanser araştırma eden kullanılabilen hücre çizgisinin her türlü uygulanabilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200 μL) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10 μL) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1, 000 μL) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5 mL) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture CO2; Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
References
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
