Introduction
DNA ambientale (Edna) in ambienti acquatici si riferisce a materiale genetico trovato nella colonna d'acqua. Recenti studi hanno dimostrato l'utilità di Edna per la rilevazione di pesci da vari ambienti acquatici, tra stagni, fiumi 1-3 4-8, torrenti 9, e l'acqua di mare 10-14. La maggior parte di questi studi si sono concentrati sulla individuazione di un unico o pochi invasivo 1,4-6,8,14 e rare o minacciate specie di 3,9, mentre alcuni studi recenti hanno tentato il rilevamento simultaneo di più specie in comunità ittiche locali 7,9, 12,13,15 e mesocosmi 11,12.
Quest'ultimo approccio è chiamato "metabarcoding" e Edna metabarcoding utilizza uno o più set di primer PCR per coamplify una regione del gene attraverso campioni tassonomicamente diversi. Questo è seguito da preparazione biblioteca indicizzazione e aggiunta adattatore, e le librerie indicizzati sono analizzate per un high-throughput sequenziamento parallelopiattaforma. Recentemente Miya et al. 12 hanno sviluppato universali primer PCR per metabarcoding Edna dai pesci (chiamati "MiFish"). I primer MiFish bersaglio una regione ipervariabile della mitocondriale 12S rRNA gene (163-185 bp), che contiene informazioni sufficienti per identificare i pesci alla famiglia tassonomica, genere e specie ad eccezione di alcuni congeneri strettamente correlati. Con l'uso di questi primer a Edna metabarcoding, Miya et al. 12 rilevati più di 230 specie marine subtropicali da acquari con noti composizione delle specie e barriere coralline vicino l'acquario.
Mentre l'ottimizzazione del protocollo metabarcoding per accogliere l'acqua di mare naturale, con livelli di concentrazione Edna dai pesci varia, abbiamo notato che i primer MiFish di tanto in tanto non è riuscito a amplificare la regione di destinazione per la successiva preparazione biblioteca. Uno dei motivi più probabili per questo l'amplificazione PCR infruttuoso è la mancanza di adeguate quantità di Template DNA contenuto in piccoli volumi di acqua filtrata (cioè 1-2 L). Anche se la concentrazione Edna da uno specifico gruppo tassonomico è inconoscibile prima l'amplificazione, la filtrazione di grandi volumi d'acqua (> 1-2 L) sarebbe un mezzo semplice ed efficace per raccogliere più Edna dagli ambienti acquatici con scarsa abbondanza di pesce e la biomassa, come ad esempio open-mare e in acque profonde ecosistemi.
Rispetto al filtri in fibra disco convenzionalmente utilizzato in un certo numero di ricerca pesci Edna 16, cartucce filtranti hanno il vantaggio di ospitare volumi idrici grandi prima intasamento 17. In realtà, un recente studio ha dimostrato grande volume (> 20 L) filtrazione di campioni di acqua di mare costiere che utilizzano cartucce filtranti 18. Inoltre, essi sono confezionati singolarmente e sterile, e diversi passaggi del flusso di lavoro sperimentale possono essere eseguite nell'alloggiamento del filtro, riducendo così la probabilità di contaminazione da laboratorio 19. L'ultimocaratteristica è fondamentale per Edna metabarcoding, in cui il rischio di contaminazione rimane tra le più grandi sfide sperimentale 20,21. Nonostante questi vantaggi tecnici di cartucce filtranti, non è stato utilizzato in studi Edna di pesci con due eccezioni 8,15.
Qui forniamo un protocollo per la filtrazione dei campioni di acqua con la cartuccia del filtro e l'estrazione di Edna dal filtro senza dover tagliare aprire l'alloggiamento. Forniamo anche due sistemi di filtrazione dell'acqua alternativi a seconda dei volumi d'acqua (≤4 L o> 4 L). Per confrontare le prestazioni del protocollo di nuova concezione e un protocollo precedentemente utilizzato utilizzando un filtro in fibra di vetro nel nostro gruppo di ricerca 12,14,22,23, eseguiamo Edna metabarcoding analisi di acqua di mare da un serbatoio acquario enorme (7.500 m 3 ) con nota composizione delle specie, e visualizza il numero di specie rilevate derivati dai due protocolli come risultati rappresentativi. Questo protocollo hcome stato sviluppato per la metabarcoding Edna dai pesci, ma è anche applicabile ad Edna da altri organismi.
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Protocol
NOTA: Questo protocollo non si occupa di metodi di campionamento e di acqua metabarcoding. L'acqua può essere campionato in modi diversi a seconda fini di studio 16 e vedere Miya et al. 12 per i dettagli sui metodi metabarcoding utilizzando primer MiFish. Si noti che l'acqua campione deve essere mantenuto molto freddo e filtrato entro poche ore per evitare la degradazione di Edna. Si noti inoltre che questo protocollo prevede l'utilizzo di un agitatore rotativo e un incubatore, e quest'ultimo deve essere sufficientemente grande per accogliere il primo. Inoltre, una centrifuga che può ospitare anche 15 ml e 50 ml provette coniche è indispensabile per rimuovere il liquido residuo dal filtro post-filtrazione e raccogliere DNA estratto all'interno della cartuccia, rispettivamente.
1. Elaborazione di un tappo a vite e di un sacchetto di plastica L 1
NOTA: Saltare questo punto se il volume di filtrazione è> 4 L.
- Praticare un foro attraverso il centro di una vite cap (attaccato ad un sacchetto di plastica 1 L getta) con lo stesso diametro (4,8 mm) come il tubo sporgente da un connettore luer lock maschio. Utilizzando pinze diagonali, accorciare il tubo del connettore luer lock maschio per una lunghezza appropriata (ca. 3 mm) per evitare l'intasamento di una piccola quantità di acqua all'interno del tappo dopo filtrazione.
- Applicare una colla adesiva specializzata per il polietilene (PE) e polipropilene (PP) sia al fondo e la superficie del connettore luer lock maschio e tappo a vite, rispettivamente. Attendere qualche minuto per una buona tecnica di incollaggio (consultare le istruzioni del produttore).
- Inserire il connettore luer lock maschio nel foro del tappo a vite. Attendere fino a completa incollaggio delle due parti (di solito> 24 ore). Sterilizzare il tappo a vite con il connettore luer lock maschio con il 10% di candeggina commerciale (ca. 0,6% di sodio ipoclorito) prima dell'uso.
- Punzone due fori ai due angoli inferiori del sacchetto di plastica 1 L per appendere da un mesPannello h (fase 3). Assicurarsi che il diametro dei fori è maggiore di quella dei rebbi sul pannello mesh.
2. Montaggio del sistema di filtrazione
- Attaccare alta tubo vuoto al connettore di ingresso di una pompa di aspirazione e collegare l'altra estremità del tubo ad un collettore. Assicurarsi che i tre rossi t-valvole del collettore sono in posizione "off" (cioè orizzontale).
- Indossare un set pulito di guanti, inserire un luer raccordo femmina e un connettore vuoto alle estremità superiore e inferiore del tubo di gomma a vuoto per filtrazione, rispettivamente.
- Fissare accuratamente raccordo luer femmina a una luce di uscita della cartuccia del filtro e collegare il connettore vuoto per un tappo di silicone.
3. Filtrazione di campioni d'acqua (≤4 L) utilizza la cartuccia filtro
NOTA: Saltare questo punto se il volume di filtrazione è> 4 L. Questo sistema di filtrazione richiede un pannello autoportante Fo appendere il sacchetto di plastica riempito con 1 L di acqua. Un pannello a maglie, più poli, e uno stand per il pannello, tutti disponibili da negozi online, sarebbe utile per l'assemblaggio di questa unità. Autoclave entrata e uscita tappi luer per la cartuccia del filtro prima dell'uso.
- Versare l'acqua campionata 1 L nel sacchetto di plastica e chiudere il tappo a vite con il connettore luer lock maschio.
- collegare cautela una luce di ingresso della cartuccia filtrante assemblato con il connettore luer lock maschio del sacchetto di plastica. Non stringere eccessivamente il connettore luer-lock; altrimenti l'unità colerà volta il pompaggio inizia. Assicurarsi che tutti i collegamenti siano sicuri prima di appendere il sacchetto di plastica da un pannello a rete.
- appendere cautela il sacchetto di plastica con la cartuccia filtrante da due rebbi sul pannello di rete e inserire un tappo di silicone in una porta di ingresso del collettore.
- Accendere l'aspiratore. Aprire le t-valvole rosse per la filtrazione. Eseguire il collettore finché la cartuccia del filtro è asciutto, tgallina girare la t-valvola rossa in posizione off.
- Ripetere 3,1-3,4 passi fino a quando è filtrata la quantità desiderata di acqua.
NOTA: per 1 L di acqua prelevata dalle barriere coralline subtropicali, ci vogliono circa tre minuti per la filtrazione. - Rimuovere con cautela la cartuccia del filtro dal sacchetto di plastica e il connettore del vuoto.
- Cap entrambe le estremità della cartuccia con i tappi luer ingresso e di uscita.
- Etichettare il tappo della cartuccia e luer ingresso appropriato utilizzando una penna a prova di solvente per asciugatura rapida ed etichettatura, non grasso.
- Conservare la cartuccia del filtro a -20 C prima estrazione del DNA.
4. filtrazione di acqua (> 4 L) I campioni utilizza la cartuccia filtro
Nota: Ignorare questo passaggio se il volume di filtrazione dell'acqua è ≤4 L. Questo sistema di filtrazione richiede una bottiglia libro 10 L dotato di una valvola e un usa e getta punta da 10 ml pipetta. Un diametro interno di 10 ml pipetta punta (15,0 mm) e conicità della puntaend dovrebbe adattarsi ad un diametro esterno della valvola (15,0 mm) e la porta di ingresso della cartuccia filtrante, rispettivamente. Entrambi i collegamenti vengono mantenuti in modo sicuro durante la filtrazione in un impeto di attrito. Sterilizzare la punta della pipetta con candeggina commerciale del 10% (circa 0,6% di ipoclorito di sodio) prima dell'uso.
- Preparare una quantità adeguata di acqua campionata in bottiglia libro. Inserire saldamente la punta della pipetta 10 ml nella valvola di 10 L bottiglia libro.
- inserire strettamente la luce di uscita della cartuccia filtrante nell'estremità punta della pipetta e inserire il tappo di silicone nella porta di ingresso del collettore. Accendere l'aspiratore. Aprire le t-valvole rosse per la filtrazione. Eseguire il collettore fino a quando la cartuccia del filtro è asciutto, quindi ruotare la t-valvola rossa in posizione off.
NOTA: per 10 L di acqua di mare prelevata dalla subtropicali barriere coralline esterne, ci vogliono circa 30-40 minuti per la filtrazione. - Rimuovere con cautela la cartuccia del filtro dal sacchetto di plastica e il connettore del vuoto. Cap entrambiestremità della cartuccia con i tappi luer ingresso e di uscita. Etichettare il tappo della cartuccia e luer ingresso appropriato utilizzando una penna a prova di solvente per asciugatura rapida ed etichettatura, non grasso. Conservare la cartuccia del filtro a -20 ° C prima dell'estrazione del DNA.
5. Estrazione di Edna dal filtro
NOTA: in punti 4 e 5, si usa un kit commerciale, in gran parte a seguito di un protocollo per "sangue nucleate" fornito dal kit. Per semplicità, si descrive la procedura per l'elaborazione di una cartuccia singola. In pratica, si consiglia di elaborazione 8 (o il numero massimo della centrifuga) o meno filtri alla volta.
- Preriscaldare un incubatore a 56 ° C.
- Preparare una provetta 2,0 ml tagliando il tappo incernierato dal tubo. Eliminare il tappo.
NOTA: Questo tubo viene utilizzato come un tubo di raccolta per il liquido rimasto nel filtro. - Rimuovere l'ingresso (NOT uscita) tappo luer dalla cartuccia del filtro e inserirlo il foro di entratanto il tubo di raccolta. Strettamente sigillare un collegamento tra il tubo della cartuccia e la raccolta utilizzando una pellicola autosigillante.
- Inserire l'unità combinata in un adattatore per centrifugare per un tubo da 15 ml. Centrifugare la cartuccia a 5.000 xg per 1 min per rimuovere il liquido rimanente nel filtro.
- Rimuovere il tubo di raccolta dalla cartuccia del filtro e gettare il tubo. Re-cap porta di ingresso della cartuccia.
- Preparare una miscela di 20 ml soluzione di proteinasi-K, 220 ml di PBS (tampone fosfato salino, non fornito dal kit) e 200 microlitri di buffer AL.
NOTA: La cartuccia del filtro può ospitare fino a quattro volte i volumi della miscela (. Circa 1,8 ml). - Togliere il tappo di ingresso e aggiungere la miscela (440 ml) nella cartuccia filtro con un puntale. Inserire la pipetta completamente nella porta di ingresso in modo che la punta della pipetta è visibile all'interno della cartuccia appena sopra la membrana.
- Re-cap porta di ingresso e posizionare la macchina del filtrocartuccia in un agitatore rotativo.
- Posizionare rotativo nell'incubatrice preriscaldato a 56 ˚C e accendere l'agitatore ad una velocità di 20 rpm per 20 min.
- Durante l'incubazione, preparare un nuovo tubo di 2,0 ml, etichettare il tubo in modo appropriato con una penna resistente ai solventi e metterlo in un tubo conico da 50 ml.
NOTA: I primi (2,0 ml) e quest'ultimo tubi (50 ml) vengono utilizzati per la raccolta del DNA estratto e per trattenere il tubo 2,0 ml, rispettivamente. - Dopo l'incubazione, rimuovere il tappo di ingresso e inserire l'ingresso (NOT uscita) porta della cartuccia nel tubo 2,0 ml nel tubo conico 50 ml. Chiudere il tubo conico da 50 ml con tappo a vite.
- Centrifugare la provetta conica da 50 ml a 5.000 xg per 1 min per raccogliere il DNA estratto dalla cartuccia. Rimuovere la cartuccia del filtro e il tubo di 2,0 ml con pinze sterili e tappare la provetta. Eliminare la cartuccia del filtro.
6. La purificazione del DNA estratto
NOTA: eluire Edna con 100 microlitri di buffer AE invece di 200 microlitri specificati nel manuale del kit commerciale.
- Aggiungere 200 ml di etanolo (96-100%) per il DNA estratto nel tubo da 2,0 ml dal gradino sopra (circa 440 ml), e mescolare bene nel vortex.
- Preparare la miscela in una colonna di spin collocato in un tubo di raccolta da 2 ml. Centrifugare a 5.000 g per 1 min. Gettare il flow-through e il tubo di raccolta.
- Porre la colonna di spin in una nuova 2 ml tubo di raccolta, aggiungere 500 microlitri tampone AW1, e centrifugare per 1 min a 5.000 x g. Gettare il flow-through e il tubo di raccolta.
- Porre la colonna di spin in una nuova 2 ml tubo di raccolta, aggiungere 500 microlitri tampone AW2, e centrifugare per 3 minuti a 20.000 x g. Gettare il flow-through e il tubo di raccolta.
- Preparare una nuova provetta da 1,5 ml (non fornito dal kit) ed etichettare il tubo in modo appropriato con una penna impermeabile per asciugatura rapida ed etichettatura, non grasso. Trasferire la colonna di spin to il tubo di 1,5 ml.
- Eluire il DNA aggiungendo 100 microlitri tampone AE al centro della membrana Spin Column. Incubare per 1 min a temperatura ambiente, quindi si centrifuga a 6000 xg per 1 min.
- Eliminare la colonna di spin e tappare la provetta. Conservare il DNA purificato a -20 ° C.
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Representative Results
È tecnicamente difficile isolare e quantificare solo Edna pesce dal Edna massa estratta, perché i primer MiFish coamplify la regione di destinazione da parte di alcuni vertebrati non-pesce, come uccelli e mammiferi, con prodotti di PCR della stessa dimensione (ca. 170 bp ) 12. Invece di quantificare pesce Edna, eseguiamo MiFish metabarcoding analisi di Edna da un serbatoio acquario con nota la composizione delle specie utilizzando i due diversi metodi di filtraggio e di estrazione del DNA, e confrontare il numero di specie rilevate per libreria da due protocolli. Questo semplice esperimento è stato progettato per mostrare la fattibilità del presente protocollo, come i "risultati rappresentativi" e non per dimostrare con rigore la sua superiorità sugli altri.
Abbiamo provato un totale di 30 L di acqua di mare da un serbatoio Kuroshio in acquario churaumi, Okinawa, Giappone (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). Il serbatoio Kuroshio è stato progettato per l'esposizione di megafauna marino, con dimensioni (L x W x D) di 35 mx 27 mx 10 m ed un volume d'acqua totale di 7.500 m 3. Ospita circa il 60 grande -sized specie ittiche marine tipiche di aree intorno alla Kuroshio, una delle correnti occidentali di bordo che scorre verso nord-est lungo l'intera lunghezza del Giappone. in un precedente studio MiFish metabarcoding, Miya et al. 12 rilevati 61 delle 63 specie (97%) contenevano nel serbatoio da cinque campioni di acqua marina 2 L.
Per filtrazione dell'acqua di mare, abbiamo usato cartucce filtranti (dimensione dei pori = 0,45 micron) e filtri a dischi in fibra di vetro (diametro dei pori = 0,70 micron). Abbiamo contemporaneamente filtrato l'acqua marina sullo stesso collettore utilizzando i due protocolli per quattro volumi d'acqua (1, 2, 3, e 4 L; totale, otto filtri). Dopo la filtrazione di acqua di mare, anche filtrato 1 L di acqua PCR-grade con i due filtri (fCartuccia ilter e filtro in fibra di vetro) come controlli negativi (due sbozzati filtro). Da questi tipi di filtri, abbiamo estratto Edna utilizzando i nuovi e precedentemente utilizzati protocolli 12, entrambi i quali utilizzano lo stesso kit commerciale. Un totale di 10 campioni Edna (compresi i due controlli negativi) sono stati sottoposti ad analisi MiFish metabarcoding come descritto in Miya et al. 12
In breve, abbiamo effettuato 1 ° turno di PCR per amplificare la regione di destinazione (12S rRNA mitocondriale gene;. Ca 170 bp) e per aggiungere adattatori per il sequenziamento abbinato-end. Per otto campioni Edna (esclusi i due controlli negativi), abbiamo condotto 10 PCR replica di vedere le variazioni nel numero di specie rilevate all'interno di ogni campione (totale 80 PCR). Abbiamo anche aggiunto il filtro e gli spazi di PCR ad ogni otto campioni Edna (totale 16 PCR). In totale, abbiamo ottenuto 96 prodotti di PCR dal 1 ° tutto l'PCR e sono stati utilizzati come modelli per il 2 ° turno-PCR per la doppia indicizzazione e aggiungendo ulteriori adattatori per la preparazione biblioteca seguenti Miya et al. 12
Il sequenziamento abbinato-end (2 x 150 bp) delle 96 librerie prodotto 4.127.546 legge, con una media di 42.995 letture per ogni biblioteca (40.539 legge nella cartuccia del filtro e 43.121 legge nel filtro in fibra di vetro). Dopo demultiplexing e la successiva pre-elaborazione dei dati grezzi, 1.068.266 letture sono stati conservati per le ricerche BLAST per l'assegnazione tassonomica. Di queste letture, 830.788 letture sono stati identificati come quelle specie contenute nel serbatoio Kuroshio (Tabella 1). Abbiamo rilevato 60 specie cisterna da 830.788 letture e il numero medio di specie rivelata per il 10 PCR replicati dalle otto campioni Edna variavano dal 29 per 1 L (filtro in fibra di vetro) a 55 per 4 L (cartuccia) (Tabella 1) . numeri di lettura delle due protezioni fornite con i campioni di otto Edna erano minori, che vanno da 0a 12 per le specie serbatoio.
Abbiamo trovato che il numero di specie rilevati dai cartuccia filtro era significativamente superiori a quelli delle fibre di vetro (ANCOVA, F = 381,8, P <0,001; Figura 1) attraverso volumi di acqua marina 1-4 L. Numero di specie rivelata nel cartuccia filtrante erano circa 1,5 volte superiori a quelli usando i filtri in fibra di vetro e in entrambi i metodi, il numero di specie rivelata aumentato con il volume di acqua filtrata (ANCOVA, F = 164,2, P <0,001).
I numeri più alti di specie rilevati dalla cartuccia del filtro possono derivare da uno o più dei seguenti passaggi nei flussi di lavoro sperimentale: la filtrazione dell'acqua campionata attraverso (1) materiali diversi (PVDF idrofilo [polyvinylidine difluoruro] vs. microfibra di vetro) e / o (2) diverse dimensioni dei pori nominali (0,4581; m contro 0,70 micron) nelle cartucce filtranti e filtri in fibra di vetro potrebbe mantenere più Edna dai pesci sul primo filtro; (3) l'uso di un agitatore rotante nell'incubatrice preriscaldato produce più resa DNA dalle cartucce filtranti rispetto alle fibre di vetro piegate in una colonna di rotazione disposto su un blocco di calore immobili; (4) raccolta del DNA estratto per centrifugazione dalla cartuccia del filtro è più efficiente di quella dal filtro in fibra di vetro a causa dei diversi materiali filtranti e / o differenti metodi di centrifugazione. Apparentemente, uno studio più rigoroso progettato è necessaria per individuare i fattori responsabili della costantemente alto numero di specie rivelata dalla cartuccia filtrante nel presente studio.
Figura 1: Il numero di Rilevato Specie tramato contro Volumi acqua filtrata in MiFish Metabarcoding Ana lisi di Edna dal Kuroshio Tank, acquario churaumi. Il numero di specie rivelata è limitata alle specie contenuta nel serbatoio. Da 30 L di acqua di mare, abbiamo filtrato 1, 2, 3, e 4 L campioni usando le cartucce filtra e fibre di vetro e estratti Edna da tali filtri utilizzando i presenti e precedentemente descritti protocolli 12, rispettivamente. Abbiamo eseguito analisi metabarcoding MiFish (rilevazione simultanea di specie diverse) per 10 PCR replica dai quattro volumi di acqua che utilizzano due protocolli. La barra orizzontale nella casella rappresenta la mediana; i bordi superiore ed inferiore della scatola corrispondono a inter-quartili, le barre verticali corrispondono a 1,5 x quartili, ei punti rappresentano valori anomali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Tabella 1:.. Composizione tassonomico e leggere i numeri delle 60 specie rilevate nelle analisi MiSeq di Edna Campioni dall'Area Kuroshio serbatoio vengono mostrati solo quelle specie contenute nella vasca con le sequenze di riferimento nel database personalizzato Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande questa tabella.
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Discussion
In molti studi metabarcoding utilizzando campioni ambientali come l'acqua e il suolo, il trattamento post-filtrazione della cartuccia filtrante è generalmente come segue 24,25: 1) taglio aperto e screpolature della custodia con utensili manuali (taglio per tubi o pinze); 2) la rimozione del filtro dalla cartuccia; e 3) taglio del filtro in piccoli pezzi con una lametta per l'estrazione del DNA. Per evitare tali diversi metodi di estrazione del DNA ingombrante e richiede tempo procedure che sono soggette alla contaminazione in laboratorio, abbiamo tentato all'interno dell'alloggiamento della cartuccia filtro utilizzando un ampiamente usato, kit commerciale poco costoso, e sviluppato con successo la presente protocollo con favorevoli risultati di analisi edna metabarcoding (Figura 1).
Una delle fasi più critiche del presente protocollo è l'uso di un agitatore rotativo in un incubatore preriscaldato, che è in grado di fornire buona resa del DNA per la successiva prepar libreriazione nell'analisi metabarcoding Edna. agitazione costante della soluzione proteinasi-K entro l'involucro a temperatura ottimale probabilmente facilita l'estrazione del DNA da particelle intrappolate nel filtro. Si noti, tuttavia, che questo protocollo prevede l'utilizzo sia di un agitatore rotante e un incubatore, e quest'ultimo deve essere in grado di accogliere il primo. Inoltre, una centrifuga che può ospitare sia 15 ml e 50 ml provette coniche è indispensabile per rimuovere il liquido rimanente dal filtro post-filtrazione e raccogliere DNA estratto all'interno della cartuccia, rispettivamente.
C'è un'altra opzione per raggiungere tale estrazione del DNA, senza dover tagliare aprire la cartuccia (vedi Tabella dei materiali / reagenti). Il kit non utilizza enzimi per l'estrazione del DNA; invece, utilizza uno speciale buffer di lisi in combinazione con ulteriori lisi meccanica con tallone battitura. In esperimenti preliminari sulla base di acqua di mare naturale dalla temperata del Pacifico costiera, ci attempestrazioni Ted DNA utilizzando questo kit con un prototipo del presente protocollo utilizzando il kit commerciale. Con l'uso del protocollo prototipo di quest'ultimo, abbiamo costantemente riconosciuto prodotti di amplificazione distinti in elettroforesi su gel per la 1a-tutto PCR. Al contrario, siamo riusciti a ottenere qualunque prodotti PCR mediante l'uso di un kit diverso (vedi Materiali / reagenti Table) pur seguendo due protocolli alternativi fornite dal produttore. Considerando che PCR operazioni di smontaggio inibitore sono inclusi nei due protocolli del secondo kit (vedi Materiali / reagenti Table), questa osservazione suggerisce una mancanza di adeguate quantità di DNA nel modello. Tali rendimenti relativamente bassi di DNA da campioni ambientali utilizzando il secondo kit sono riportati in studi recenti 26,27.
Nel presente protocollo, abbiamo scelto la cartuccia del filtro con la grande dimensione dei pori nominale (0,45 micron), mentre gli studi microbica acquatica conventionally usare la più piccola (0,22 micron), dopo prefiltrazione attraverso filtri pori di dimensioni più grandi (da 1 a 3 micron) 28. Le ragioni della nostra scelta sono semplici e semplice, e non si basano su argomenti teorici: 1) la dimensione dei pori è molto più vicino a quello delle fibre di vetro (0,70 micron) abbiamo convenzionalmente usati nelle precedenti Edna studi 12,14, 22,23; 2) è previsto per consentire volumi d'acqua da filtrare quello più piccolo. Quest'ultima caratteristica è particolarmente significativo per i nostri progetti di ricerca in corso sottoposti in open-mare e d'altura ecosistemi con scarsa abbondanza di pesce e le biomasse. Infatti, abbiamo confermato filtrazione successo di un campione indipendente 10-L di acqua marina dal serbatoio Kuroshio senza intasamento evidente (risultati non mostrati). Recentemente, tuttavia, Turner et al. 29 hanno dimostrato che 0,2 micron filtrazione massimizzato carpa Edna cattura (85% ± 6%), riducendo al minimo complessivo (cioè non-target) Ednaacquisizione (48% ± 3%), ma intasamento del filtro limitati questa dimensione dei pori per un volume di campione di meno di 250 ml. Ulteriori studi sono necessari per determinare il volume di dimensioni e di filtrazione dell'acqua dei pori del filtro ottimale della cartuccia filtrante per Edna metabarcoding in vari tipi di ambienti acquatici con diversi livelli di abbondanza di pesce e le biomasse.
Uno dei limiti di questo protocollo è che la filtrazione dell'acqua deve essere effettuata in laboratorio in cui un alimentatore è disponibile. A causa della limitata stabilità chimica del DNA, Edna comincia a degradare appena viene versato da un organismo ed è rilevabile solo per un breve periodo di tempo in ambienti acquatici (ore o giorni) 30. Pertanto è ideale per filtrare immediatamente il campione di acqua dopo la raccolta per evitare degrado significativo di Edna. A questo proposito, sviluppi dei metodi di filtrazione in loco utilizzando la cartuccia del filtro sarebbe un passo successivo promettente. La portabilità e Sterility della cartuccia filtrante consentire lo sviluppo dei metodi di filtrazione in loco, che fornirà Edna più integro che può riflettere la composizione delle specie della comunità ittica più precisamente a Edna metabarcoding. Edna raccolti sulle cartucce filtranti può essere stabilizzata mediante l'iniezione di un reagente commerciale 31 (vedi Materiali / reagenti Table) o Longmire tampone 32 nella cartuccia prima di riportarlo al laboratorio.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
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