Introduction
Miljø DNA (Edna) i akvatiske miljøer refererer til genetisk materiale funnet i vannsøylen. Nyere studier har vist nytten av Edna for å oppdage fisk fra ulike akvatiske miljøer, inkludert dammer 1-3, elver 4-8, bekker 9, og sjøvann 10-14. De fleste av disse studiene fokusert på deteksjon av en enkelt eller noen få invasiv 1,4-6,8,14 og sjeldne eller truede arter 3,9, mens noen nyere studier forsøkt samtidig påvisning av flere arter i lokale fiskesamfunn 7,9, 12,13,15 og posene 11,12.
Sistnevnte tilnærming kalles "metabarcoding" og Edna metabarcoding bruker ett eller flere sett med PCR primere til coamplify et gen region tvers taksonomisk ulike prøver. Dette etterfølges av bibliotek-preparat med indeksering og adapter tilsetning, og de indekserte bibliotekene blir analysert ved en high-throughput parallell sekvenseplattform. Nylig Miya et al. 12 utviklet universell PCR primere for metabarcoding Edna fra fisker (kalt "MiFish"). De MiFish primere rettet mot en hypervariabel region av mitokondriell 12S rRNA-gen (163-185 bp) som inneholder tilstrekkelig informasjon til å identifisere fisk til taksonomisk familie, slekt og art med unntak av noen nær beslektede kongenere. Med bruk av disse primere i Edna metabarcoding, Miya et al. 12 oppdaget mer enn 230 subtropiske marine arter fra akvariekummer med kjente artssammensetning og korallrev nær akvariet.
Mens optimalisere metabarcoding protokollen for å imøtekomme naturlig sjøvann med varierende grad av Edna konsentrasjon fra fisker, har vi lagt merke til at MiFish primere tidvis klarte å forsterke målområdet for påfølgende bibliotek forberedelse. En av de mer sannsynlige årsaker til dette mislykket PCR-amplifikasjon er mangel på tilstrekkelige mengder av template DNA som inneholdes i små mengder vann, filtrert (for eksempel 1-2 liter). Selv om Edna konsentrasjon fra en bestemt taksonomisk gruppe er ukjennelig før forsterkning, filtrering av store vannmengder (> 1-2 L) ville være en enkel og effektiv måte å samle mer Edna fra akvatiske miljøer med knappe fisk overflod og biomasse, slik som åpne hav og dypvanns økosystemer.
I forhold til disk fiber filtre konvensjonelt brukes i en rekke av fisk Edna forskning 16, filterpatroner har fordelen av imøtekommende større vannmengder før tilstopping 17. Egentlig en fersk undersøkelse viste stort volum (> 20 L) filtrering av kystsjøvannsprøver ved hjelp av filterpatroner 18. I tillegg er de individuelt pakket og sterile, og flere trinn av den eksperimentelle arbeidsflyten kan utføres i filterhuset, og dermed redusere sannsynligheten for forurensning fra laboratoriet 19. Sistnevntefunksjonen er kritisk for Edna metabarcoding, der risikoen for forurensning er fortsatt blant de største eksperimentelle utfordrer 20,21. Til tross for disse tekniske fordelene ved filterpatroner, det har ikke vært brukt i Edna studier av fisk med to unntak 8,15.
Her gir vi en protokoll for filtrering av vannprøver med filterpatronen og utvinning av Edna fra sitt filter uten å måtte kutte åpne huset. Vi tilbyr også to alternative vann filtrering systemer avhengig av vannmengder (≤4 L eller> 4 L). For å sammenligne resultatene av den nyutviklede protokoll og en tidligere brukt protokollen ved hjelp av et glassfiberfilter i vår forskningsgruppe 12,14,22,23, vi utfører Edna metabarcoding analyse av sjøvann fra et stort akvarium tank (7500 m 3 ) med kjent artssammensetning, og viser antall oppdagede arter som stammer fra de to protokollene som representative resultater. Denne protokollen hsom er utviklet for metabarcoding Edna fra fisker, men er også anvendelig til Edna fra andre organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen omhandler ikke vannprøve og metabarcoding metoder. Vann kan prøves på ulike måter, avhengig av studieøyemed 16 og se Miya et al. 12 for detaljer om metabarcoding metoder ved hjelp MiFish primere. Legg merke til at det samplede vann bør holdes meget kaldt og filtrert i løpet av noen få timer for å unngå degradering av Edna. Merk også at denne protokollen involverer anvendelse av en rotasjonsrister og en inkubator, og den sistnevnte må være store nok til å romme den førstnevnte. I tillegg er en sentrifuge som kan romme begge 15 ml og 50 ml koniske rør er uunnværlig for å fjerne den gjenværende væske fra den post-filtreringsfilter, og å samle ekstraherte DNA i kassetten, respektivt.
1. Behandling av et skrulokk og en L Plastic Bag
MERK: Hopp over dette trinnet hvis filtreringsvolumet er> 4 L.
- Bor et hull gjennom midten av en skrue cap (festet til en engangs en L plastpose) med den samme diameter (4,8 mm) som røret rager ut fra en hann-luer lock tilkobling. Ved hjelp av diagonale tang, forkorte rør av hann luer-lock tilkobling til en passende lengde (ca. 3 mm) for å unngå tilstopping av en liten mengde vann på innsiden av hetten etter filtrering.
- Anvende et klebemiddel lim spesialisert for polyetylen (PE) og polypropylen (PP) til både bunnen og overflaten av hann-luer lock tilkobling og skrulokket, henholdsvis. Vent noen minutter for god liming (se produsentens instruksjoner).
- Sett den mannlige luer-lock-kontakten inn i hullet på skrukork. Vent inntil fullstendig liming av de to deler (vanligvis> 24 hr). Sterilisere skrukork med den mannlige luer-lock-kontakt med 10% kommersiell blekemiddel (ca. 0,6% natriumhypokloritt) før bruk.
- Punch to hull på de to nederste hjørnene av en L plastpose for å henge den fra en mesh panel (trinn 3). Sørge for at diameteren av hullene er større enn den til de ledende delene på nettingpanelet.
2. Montering av filtreringssystem
- Fest høyvakuum slangen til inngangskontakten på en aspirator pumpe og feste den andre enden av slangen til en manifold. Vær sikker på at de tre røde t-ventiler av manifolden er i "av-stilling" (dvs. horisontal).
- Iført en ren sett med hansker, setter en rørkoplingsmuffe og et vakuum-kontakten på toppen og bunnen ender av vakuum gummi slangen for filtrering, henholdsvis.
- feste forsiktig rørkoplingsmuffe til et uttak port av filterpatronen og fest vakuum-kontakten til en silikonpropp.
3. Filtrering av vannprøver (≤4 L) ved hjelp av Filter Cartridge
MERK: Hopp over dette trinnet hvis filtreringsvolumet er> 4 L. filtreringssystem krever et frittstående panel feller hengende plastposen fylt med 1 liter vann. En mesh panel, flere utstikkerne, og et stativ for panelet, alle tilgjengelige fra nettbutikker, vil være nyttig for sammenstillingen av denne enheten. Autoklav innløp og utløp luer landskamper for filterpatronen før bruk.
- Hell en L samplet vann i plastposen og lukk skrukork med den mannlige luer-lock-kontakt.
- koble nøye en inngangsport til det sammensatte filterpatronen med den mannlige luer-lock-kontakt av plastposen. Ikke over-stramme luer-lock-kontakt; ellers vil enheten lekke når pumpingen begynner. Vær sikker på at alle tilkoblinger er sikre før du henger den plastpose fra en mesh panel.
- Nøye henge plastposen med filterpatronen fra to utstikkerne på mesh panel og sette inn en silikonpropp inn en inngangsport av manifolden.
- Slå på aspirator. Åpne den røde t-ventiler for filtrering. Kjør manifolden til filterpatronen er tørr, thøne slå den røde t-ventil til av-stilling.
- Gjenta 3,1-3,4 trinn inntil den ønskede mengde vann, filtreres.
MERK: For en liter vann hentet fra de subtropiske korallrev, det tar ca tre minutter for filtrering. - Fjern forsiktig filterpatronen ut av plastposen og vakuum kontakten.
- Cap begge ender av kassetten med luer-caps innløps- og utløps.
- Merk kassetten og innløpet luer cap hensiktsmessig å bruke en løsemiddelsikre penn for hurtigtørkende og ikke-smøre merking.
- Oppbevar filterpatronen ved -20 ˚C før DNA-ekstraksjon.
4. filtrering av vann (> 4 L) Prøver hjelp av Filter Cartridge
Merk: Hopp over dette trinnet hvis vannet filtreringsvolumet er ≤4 L. filtreringssystem krever et 10 L bok flaske utstyrt med en ventil og en engangs 10 ml pipette. En indre diameter av 10 ml pipettespissen (15,0 mm) og en avsmalning av spissenslutt skal passe til en ytre diameter av ventilen (15,0 mm) og innløpsporten av filterpatronen, respektivt. Begge forbindelser blir beholdt på en sikker måte i løpet av filtreringen i en friksjonspasning. Steril pipettespissen med 10% kommersiell blekemiddel (ca. 0,6% natriumhypokloritt) før bruk.
- Fremstille en passende mengde av prøvevann i boken flasken. Tett sette inn 10 ml pipette tips i ventilen på 10 L bok flaske.
- Tett sette utløpsåpningen av filterpatronen inn i pipetten spissen enden og sette inn silikon stopperen inn i innløpet port av manifolden. Slå på aspirator. Åpne den røde t-ventiler for filtrering. Kjør manifold til filterpatronen er tørr før du slår den røde t-ventil til av-stilling.
MERK: For 10 liter sjøvann tatt fra subtropiske ytre korallrev, det tar ca 30-40 min for filtrering. - Fjern forsiktig filterpatronen ut av plastposen og vakuum kontakten. Cap bådeender av kassetten med luer-caps innløps- og utløps. Merk kassetten og innløpet luer cap hensiktsmessig å bruke en løsemiddelsikre penn for hurtigtørkende og ikke-smøre merking. Oppbevar filterpatronen ved -20 ° C før DNA-ekstraksjon.
5. Utvinning av Edna fra Filter
MERK: I trinn 4 og 5, bruker vi et kommersielt kit, i stor grad følger en protokoll for "kjernedannelse blod" gitt av settet. For enkelhets skyld vil vi beskrive fremgangsmåten for å behandle et individ patron. I praksis anbefales behandling 8 (eller det maksimale antall av sentrifugen) eller færre filtre på en gang.
- Forvarm en inkubator til 56 ° C.
- Utarbeide en 2,0 ml tube ved å kutte den hengslede lokket fra røret. Kast hetten.
MERK: Dette rør blir brukt som et oppsamlingsrør for den gjenværende væsken i filteret. - Fjern innløpet (NOT utløp) luer cap fra filterpatronen og sett innløpsporten infor samlingen tube. Tett forsegle en forbindelse mellom patronen og samling rør ved hjelp av en selvtettende film.
- Sett den kombinerte enhet inn i en sentrifuge-adapter for et 15 ml konisk rør. Sentrifuger patronen ved 5000 xg i 1 min for å fjerne gjenværende væske i filteret.
- Fjerne samlingen røret fra filterpatronen og kast røret. Re-cap innløps av kassetten.
- Lag en blanding av 20 ul proteinase-K løsning, 220 mL PBS (fosfat saltløsning, ikke gitt av settet) og 200 mL buffer AL.
MERK: Filterpatronen plass til opptil fire ganger volumet av blandingen (. Ca 1,8 ml). - Fjern inntakslokket og legg blandingen (440 mL) i filterpatronen ved hjelp av en pipette. Sett pipetten helt inn i innløpsåpningen, slik at pipettespissen er synlig inne i kassetten like over membranen.
- Re-cap innløpsporten og plasser filter bilsetten på en rotasjonsrister.
- Plasser i rotasjonsristeapparatet i den forvarmede inkubator ved 56 ° C og slå på ristemaskin ved en hastighet på 20 rpm i 20 min.
- Under inkubasjon, utarbeide en ny 2,0 ml tube, merk røret på riktig måte ved hjelp av en løsemiddelsikre penn og legg den i en 50-ml konisk tube.
Merk: De tidligere (2,0 ml) og sistnevnte rør (50 ml) blir brukt til innsamling av det ekstraherte DNA og for å holde 2,0 ml rør, henholdsvis. - Etter inkubasjon, fjerne inntaks lokket og sett innløpet (NOT utløp) port av kassetten inn i 2,0 ml tube i 50 ml konisk tube. Lukker 50 ml koniske rør med skrukork.
- Sentrifuger 50-ml konisk rør på 5000 xg i 1 min for å samle den ekstraherte DNA fra patronen. Fjern filterkassetten og 2,0 ml tube bruker sterilisert pinsett og cap røret. Kast filterpatronen.
6. Rensing av ekstrahert DNA
MERK: Vi eluere Edna med 100 mL buffer AE i stedet for 200 mL spesifisert i håndboken for den kommersielle kit.
- Tilsett 200 ul etanol (96-100%) for det ekstraherte DNA i 2,0 ml rør fra det foregående trinn (ca. 440 ul), og bland ved virvling.
- Pipette blandingen i en spinnkolonne plassert i en 2 ml oppsamlingsrør. Sentrifuger ved 5000 x g i 1 min. Kast gjennomstrømnings og oppsamlingsrøret.
- Plasser spinnkolonne i en ny 2 ml oppsamlingsrøret, tilsett 500 ul buffer AW1, og sentrifuger i 1 min ved 5000 x g. Kast gjennomstrømnings og oppsamlingsrøret.
- Plasser spinnkolonne i en ny 2 ml oppsamlingsrøret, tilsett 500 ul buffer AW2, og sentrifuger i 3 minutter ved 20 000 x g. Kast gjennomstrømnings og oppsamlingsrøret.
- Klargjør en ny 1,5 ml tube (følger ikke med settet) og merk røret på riktig måte ved hjelp av et vanntett penn for hurtigtørkende og ikke-smøre merking. Overfør spin kolonne to 1,5 ml tube.
- Eluer DNA ved tilsetning av 100 pl buffer AE til midten av spinnkolonne membranen. Inkuber i 1 min ved romtemperatur, og deretter sentrifuger ved 6000 xg i 1 min.
- Kast spin kolonnen og cap røret. Oppbevar det rensede DNA ved -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er teknisk vanskelig å isolere og kvantifisere bare fisk Edna fra den ekstraherte masse Edna, fordi MiFish primere coamplify målområdet fra noen ikke-fisk virveldyr, slik som fugler og pattedyr, med PCR-produkter av samme størrelse (ca. 170 bp ) 12. I stedet for å kvantifisere fisk Edna, utfører vi MiFish metabarcoding analyse av Edna fra et akvarium tank med kjente artssammensetningen ved hjelp av to ulike metoder for filtrering og DNA-ekstraksjon, og sammenligne tallene for oppdagede arter per biblioteket fra de to protokollene. Dette enkle eksperimentet ble laget for å vise mulighetene for protokoll som "representative resultater" og ikke strengt demonstrere sin overlegenhet over andre.
Vi samplet totalt 30 liter sjøvann fra en Kuroshio tank i Okinawa Churaumi Aquarium, Okinawa, Japan (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). Den Kuroshio tanken er konstruert for utstilling marine megafauna, med dimensjoner (L x B x D) på 35 mx 27 mx 10 m og et totalt vannvolum på 7500 m 3. Det huser ca 60 store dimensjonerte marine fiskearter karakteristiske for områdene rundt Kuroshio, en av de vestlige grense strømmene northeastward langs hele lengden av Japan. i en tidligere MiFish metabarcoding studien, Miya et al. 12 oppdaget 61 av de 63 artene (97%) inneholdt i tanken fra fem 2 L sjøvannsprøver.
For filtrering av sjøvann, brukte vi filterpatroner (porestørrelse = 0,45) og glassfiber disk filtre (porestørrelse = 0,70 mikrometer). Vi samtidig filtrert sjøvann på samme manifolden ved hjelp av de to protokollene for fire vannvolumer (1, 2, 3, og 4 L, samlet, åtte filtre). Etter filtrering av sjøvann, vi også filtrert en L av PCR-grade vannet med to filtre (fIlter patron og glassfiberfilter) som negative kontroller (to filter blanks). Fra disse typer filtre, hentet vi Edna ved hjelp av de nye og tidligere brukte protokollene 12, som begge benytter den samme kommersielle kit. Totalt 10 Edna prøver (inkludert de to negative kontroller) ble utsatt for MiFish metabarcoding analyse som beskrevet i Miya et al. 12
Kort, utførte vi første runde PCR å forsterke målområdet (mitokondrie 12S rRNA-genet;. Ca 170 bp) og å legge adaptere for parvise end sekvensering. For åtte Edna prøver (unntatt de to negative kontroller), gjennomførte vi 10 PCR gjentak å se variasjoner i antall oppdagede arter innen hver prøve (totalt 80 PCR). Vi har også lagt filteret og PCR blanks til hver åtte Edna prøver (totalt 16 PCR). Totalt fikk vi 96 PCR-produkter fra første-runde PCR og de ble brukt som maler for andre året PCR for dual indeksering og tilføye ekstra adaptere for bibliotek forberedelse følgende Miya et al. 12
Den parvise end sekvensering (2 x 150 bp) av de 96 bibliotekene ga 4.127.546 leser, med et gjennomsnitt på 42 995 leser per bibliotek (40539 leser i filterpatronen og 43121 leser i glassfiberfilter). Etter demultiplexing og påfølgende pre-prosessering av rådata, leser 1068266 ble beholdt for eksplosjonen søker etter taksonomisk oppdrag. Av disse lyder, leser 830788 ble identifisert som de arter inneholdt i Kuroshio tanken (tabell 1). Vi oppdaget 60 tank arter fra 830 788 leser og gjennomsnittlig antall oppdagede arter for 10 PCR gjentak fra de åtte Edna prøvene varierte fra 29 til 1 L (glassfiberfilter) til 55 for 4 L (filterpatron) (tabell 1) . Les numrene på de to feltene fra de åtte Edna prøvene var mindre, alt fra 0til 12 for tanken arter.
Vi fant at antall oppdagede arter av filterpatronen var betydelig høyere enn for de glassfiberfiltre (ANCOVA, F = 381,8, p <0,001; figur 1) over 1-4 L sjøvanns volumer. Antall påviste arter av filterpatronen var omtrent 1,5 ganger høyere enn de ved hjelp av glass-fiberfiltre, og i begge metoder, antall detekterte arter økte med volumet av vann filtrert (ANCOVA, F = 164,2, P <0,001).
Høyere tall for oppdagede arter av filterpatronen kan resultere fra en eller flere av de følgende trinn i den eksperimentelle arbeidsflyt: filtrering av samplet vann gjennom (1) forskjellige materialer (hydrofil PVDF [polyvinylidin difluoride] vs. glass microfiber) og / eller (2) forskjellige nominelle porestørrelser (0,4581; m kontra 0,70 mikrometer) i filterpatronene og glassfiberfiltre kan beholde mer Edna fra fisker på den tidligere filter; (3) bruk av en rotasjonsrister i den forvarmede inkubator produserer mer DNA-utbytte fra filterpatronene enn fra de brettede glassfiberfiltre i en spinnkolonne plassert på en ubevegelig varmeblokk; (4) samling av det ekstraherte DNA ved sentrifugering fra filterpatronen er mer effektiv enn det fra glass-fiberfilter på grunn av forskjellige filtermaterialer og / eller forskjellige sentrifugeringsmetoder. Angivelig, er en mer omhyggelig utformet studie er nødvendig for å fastslå hvilke faktorer som er ansvarlige for den gjennomgående høyere antall oppdaget arter av filterpatronen i denne studien.
Figur 1: Antall oppdaget Arter plottet mot filtrert vann Volumene i MiFish Metabarcoding Ana lyse av Edna fra Kuroshio Tank, Okinawa Churaumi Aquarium. Antallet påviste artene er begrenset til de artene som finnes i tanken. Fra 30 liter sjøvann, vi filtrert 1, 2, 3 og 4 L prøver ved hjelp av filterpatronene og glassfiberfiltre og ekstrahert Edna fra disse filtrene ved hjelp av nåværende og tidligere beskrevne protokoller 12, henholdsvis. Vi utførte MiFish metabarcoding analyse (samtidig påvisning av flere arter) for 10 PCR gjentak fra de fire vannmengder ved hjelp av to protokoller. Den horisontale linjen i boksen representerer median; øvre og nedre kant av boksen tilsvarer inter-kvartiler, de vertikale stolpene tilsvarer 1,5 x kvartiler, og prikkene representerer uteliggere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/files/ftp_upload/54741/54741tbl1.jpg "/>
Tabell 1:.. Taksonomiske sammensetningen og lese tall av de 60 arter påvist i MiSeq Analyser av Edna Prøver fra Kuroshio Tank Bare de artene som finnes i tanken med referansesekvenser i tilpasset database vises Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I mange metabarcoding studier med miljøprøver slik som vann og jord, etter filtrering behandling av filterpatronen er generelt som følger 24,25: 1) skjære åpen eller sprekkdannelse i huset med håndverktøy (slange kutter eller tang); 2) fjerning av filteret fra kassetten; og 3) kutting av filteret i små biter med et barberblad for DNA-ekstraksjon. For å unngå slike tungvint og tidkrevende prosedyrer som er utsatt for forurensning i laboratoriet, har vi forsøkt flere DNA utvinning metoder innenfor huset av filterpatronen ved hjelp av en mye brukt, billig kommersielt sett, og hell utviklet den nåværende protokoll med gunstig resultatene fra Edna metabarcoding analyse (figur 1).
En av de mer kritiske trinn i den foreliggende protokoll er anvendelse av en rotasjonsrister i en på forhånd oppvarmet inkubator, som er i stand til å tilveiebringe godt utbytte DNA for etterfølgende bibliotek preparasjon i Edna metabarcoding analyse. Konstant omrøring av proteinase-K-løsning inne i huset ved en optimal temperatur letter sannsynligvis DNA-ekstraksjon fra partiklene som er fanget på filteret. Merk imidlertid at denne protokollen omfatter bruken av både en rotasjonsrister og en inkubator, og den sistnevnte må være i stand til å betjene den førstnevnte. I tillegg er en sentrifuge som kan romme begge 15 ml og 50 ml koniske rør er uunnværlig for å fjerne gjenværende væske fra etterfiltreringen filter og oppsamling av ekstrahert DNA i kassetten, respektivt.
Det er et annet alternativ for å oppnå en slik DNA-ekstraksjon uten å måtte kutte åpne patron (se tabell for material / reagenser). Settet bruker ikke noen enzymer for DNA-ekstraksjon; Den bruker i stedet en spesiell lysebuffer i kombinasjon med ekstra mekanisk lysis med perle juling. I innledende eksperimenter basert på naturlig sjøvann fra tempererte kyst Pacific, attemp vited DNA ekstraksjon ved hjelp av dette settet sammen med en prototype av den foreliggende protokollen med kommersielt sett. Med bruk av den sistnevnte prototypen protokollen, vi konsekvent anerkjent distinkte amplifiseringsprodukter på gelelektroforese for den første runde PCR. I motsetning til dette har vi ikke klarte å skaffe adgang til PCR-produkter ved anvendelse av en annen kit (se Materialer / reagenser tabell) til tross for følgende to alternative protokoller levert av produsenten. Tatt i betraktning at PCR-inhibitor fjerningstrinn inngår i de to protokollene i det annet sett (se Materialer / Reagenser tabell), tyder dette på observasjonen av mangel på tilstrekkelige mengder av DNA i malen. Slike relativt lave DNA gir fra miljøprøver ved hjelp av andre settet er rapportert i nyere studier 26,27.
I den foreliggende protokoll, har vi valgt filterpatronen med stor nominell porestørrelse (0,45), mens vann mikrobielle studier konvensjonelly bruke den mindre (0,22 um) etter forfiltrering gjennom større pore-størrelse filtre (1 til 3 mikrometer) 28. Årsakene av våre valg er enkel og grei, og er ikke basert på teoretiske argumenter: 1) porestørrelsen er mye nærmere det av glassfiberfiltre (0,70 mikrometer) vi har konvensjonelt brukt i forrige Edna studerer 12,14, 22,23; 2) den er forventet å tillate større volumer av vann som skal filtreres enn den mindre. Sistnevnte funksjon er spesielt viktig for våre nåværende forskningsprosjekter gjennomgår i åpen hav og dypvanns økosystemer med knappe fisk overflod og biomasse. Faktisk, bekreftet vi vellykket filtrering av en uavhengig samplet 10-L av sjøvann fra Kuroshio tank uten noen merkbar tilstopping (resultater ikke vist). Nylig har imidlertid Turner et al. 29 viste at 0,2 mikrometer filtrering maksimert karpe Edna fangst (85% ± 6%), mens total (dvs. ikke-target) minimerer Ednacapture (48% ± 3%), men filtertilstopping begrenset denne porestørrelse i et prøvevolum på mindre enn 250 ml. Ytterligere studier er nødvendig for å fastslå den optimale filter pore størrelse og vann filtrering volum av filterpatronen for Edna metabarcoding i ulike typer akvatiske miljøer med varierende grad av fisk overflod og biomasse.
En av begrensningene i denne protokollen er at vannet filtrering bør utføres i laboratoriet der strømforsyningen er tilgjengelig. På grunn av begrenset kjemisk stabilitet av DNA, begynner Edna å degradere så snart den støtes ut fra en organisme og er synlig bare for en kort periode i akvatiske miljøer (timer til dager) 30. Derfor er det ideelt å filtrere vannprøven umiddelbart etter innsamling for å unngå betydelig nedbrytning av Edna. I denne forbindelse vil utviklinger av de på stedet for filtreringsmetoder ved hjelp av filterpatronen være en lovende neste trinn. Portabilitet og sterility av filterpatronen muliggjøre utvikling av stedets filtrering metoder, som vil gi mer intakt Edna som kan reflektere artssammensetningen av fisken samfunnet mer nøyaktig i Edna metabarcoding. De innsamlede Edna på filterpatronene kan stabiliseres ved injeksjon av en kommersiell reagens 31 (se Materialer / reagenser Table) eller Longmire buffer 32 i patronen før bringe den tilbake til laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
