Introduction
수생 환경에서 환경 DNA (에드나)는 물 칼럼에서 발견 된 유전 물질을 의미한다. 최근의 연구는, 연못 1-3, 강, 4-8 등 다양한 수생 환경에서 물고기를 검출하는 에드나의 유용성을 입증 9 스트림, 해수 10-14. 최근의 연구는 생선 커뮤니티 7,9에서 여러 종의 동시 검출을 시도하면서 이러한 연구의 대부분은, 3,9 종 단일 또는 소수의 침략 1,4-6,8,14 희귀 또는 위협의 탐지에 초점을 맞춘 12,13,15 및 반 폐쇄 생태계 (11, 12).
후자의 방법은 "metabarcoding"라고하며 에드나의 metabarcoding은 분류 학적으로 다양한 샘플에서 유전자 영역을 coamplify하는 PCR 프라이머의 하나 또는 여러 개의 세트를 사용합니다. 이것은 인덱싱 및 어댑터 첨가 라이브러리를 제조 하였다되고 인덱싱 라이브러리는 높은 처리량 병렬 염기 서열 분석플랫폼. 최근 미야 등. (12) ( "MiFish"라고합니다) 물고기에서 에드나를 metabarcoding에 대한 보편적 인 PCR 프라이머를 개발했다. MiFish 프라이머는 분류 학적 가족, 속 일부 밀접하게 관련 동족체를 제외하고 종 물고기를 식별하는 데 충분한 정보가 들어있는 미토콘드리아 12S rRNA 유전자 (163-185 BP)의 가변 영역을 대상으로. 에드나의 metabarcoding에서와 프라이머를 사용하여, 미야 등. (12)는 수족관 근처 알려진 종 조성과 산호초 수족관 탱크에서 230 개 이상의 아열대 해양 종을 발견했습니다.
metabarcoding 프로토콜을 최적화하는 물고기에서 에드나 농도 다양한 수준의 천연 해수를 수용 할 수 있지만, 우리는 MiFish 프라이머 가끔 후속 라이브러리 준비를위한 대상 영역을 증폭하지 못한 것으로 나타났습니다. 이 실패한 PCR 증폭 용 가능성 이유 중 하나는 TE 충분한 양의 부족여과 물 소량에 포함 mplate DNA (즉, 1-2 L). 특정 분류 학적 그룹에서 에드나 농도가 큰 물 볼륨 (> 1-2 L)의 여과가 증폭되기 전에 알 수없는하지만 것 희귀 물고기의 풍부한 바이오 매스, 같은과 수생 환경에서 더 많은 에드나를 수집 할 수있는 간단하고 효과적인 수단이 될 오픈 바다와 심해 생태계.
디스크 섬유 필터에 대하여 종래에 물고기 에드나 연구 (16)의 수에 사용 된 필터 카트리지 (17)를 폐색하기 전에 물 큰 볼륨을 수용하는 장점을 갖는다. 사실, 최근의 연구는 많은 양의 (> 20 L) 필터 카트리지 (18)를 사용하여 연안 해수 시료의 여과를 보였다. 또한, 이들은 개별 포장 및 멸균하여 실험 워크 플로우의 여러 단계가 이에 해당 기관 (19)로부터의 오염 가능성을 감소시키는 필터 하우징에서 수행 될 수있다. 후자의기능은 가장 큰 실험은 20, 21에 도전 중있는 오염의 위험이 남아 에드나의 metabarcoding 중요합니다. 필터 카트리지의 이러한 기술적 장점에도 불구하고, 그것은 두 가지 예외 8,15와 물고기 에드나 연구에 사용되지 않았다.
여기에서 우리는 주택을 열 절단 할 필요없이 필터에서 에드나의 필터 카트리지 및 추출 물 샘플의 여과를위한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 물 볼륨 (≤4의 L 또는> 4 L)에 따라 두 가지 대체 물 여과 시스템을 제공합니다. 새로 개발 된 프로토콜의 성능과 우리의 연구 그룹 12,14,22,23에서 유리 섬유 필터를 사용하여 이전에 사용되는 프로토콜을 비교하기 위해, 우리는 에드나는 거대한 수족관 탱크에서 해수의 분석을 metabarcoding 실시합니다 (7,500m 3 ) 알려진 종 조성물과 대표적인 결과로서 두 프로토콜로부터 유도 검출 종의 수를 나타낸다. 이 프로토콜의 시간으로는 물고기에서 에드나를 metabarcoding 위해 개발하지만, 다른 생물체에서 에드나에도 적용되었다.
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Protocol
참고 :이 프로토콜은 물 샘플링 및 metabarcoding 방법과 거래를하지 않습니다. 물은 연구 목적 (16)에 따라 다른 방식으로 샘플링 볼 미야 등. (12) MiFish 프라이머를 사용하여 metabarcoding 방법에 대한 자세한 내용은 될 수있다. 샘플링 된 물이 매우 추운 유지와 에드나의 저하를 방지하기 위해 몇 시간 내에 필터링해야합니다. 또한,이 프로토콜은 회전 진탕 배양기와의 사용을 포함 유의, 후자는 전자를 수용 할만큼 충분히 커야한다. 또한, 원심 분리기는 원추형 튜브 후 여과 필터에 남아있는 액체를 제거하고, 각각의 카트리지 내에서 추출 된 DNA를 수집 불가결 모두 15 mL 및 50 mL로 수용 할 수있다.
1. 스크류 캡과 1 L 플라스틱 가방 처리
참고 : 여과 볼륨> 4 L. 경우이 단계를 건너 뛰
- 나사 (C)의 중앙에 구멍을 뚫는다수형 루어 락 커넥터로부터 돌출 관과 동일한 직경 (4.8 mm)와 AP (L 1 회용 비닐 봉투에 부착). 대각선 집게를 사용하여 여과 한 후, 캡의 내부에 소량의 물 막힘을 방지하기 위하여 적절한 길이 (CA. 3mm)에 수형 루어 락 커넥터 튜브를 짧게.
- 각각 수형 루어 락 커넥터의 바닥면 모두에 폴리에틸렌 (PE), 폴리 프로필렌 (PP)에 특화된 접착제 접착제를 적용하고 캡 스크류. 좋은 접착을위한 몇 분 (제조업체의 지침을 참조) 기다립니다.
- 스크류 캡의 구멍에 남성 루어 잠금 커넥터를 삽입합니다. 두 부분 (보통> 24 시간)을 완벽하게 접착 될 때까지 기다립니다. 사용하기 전에 10 % 상업 표백제 (캘리포니아. 0.6 %의 차아 염소산 나트륨)와 남성 루어 잠금 커넥터와 스크류 캡을 소독.
- MES에서 걸어하기 위해 1 L 플라스틱 가방의 두 하단 모서리에 두 개의 구멍 펀치시간 패널 (3 단계). 구멍의 직경은 메쉬 패널 프롱보다 크다는 것을 보장한다.
여과 시스템 2. 총회
- 흡인기 펌프의 입력 커넥터에 높은 진공 튜브를 연결하고 매니 폴드에 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 매니 폴드의 3 개의 빨간색 T- 밸브가 "오프 위치"(즉, 수평)에 있는지 확인하십시오.
- 장갑 클린 세트 착용 각각 피팅 암형 루어를 삽입하고 여과 진공 고무 튜브의 상부 및 하부 단부에서 진공 커넥터.
- 조심스럽게 필터 카트리지의 배출구 피팅 암형 루어 연결 및 실리콘 마개로 진공 커넥터를 연결.
필터 카트리지를 사용하여 물 샘플 (≤4 L)의 3 여과
참고 : 여과 볼륨> 4 L.이 여과 시스템의 경우이 단계를 건너 뛰 자체 서 패널 F가 필요합니다또는 물 1 L로 가득 비닐 봉지에 매달려. 메쉬 패널, 여러 갈래 및 패널 용 스탠드, 온라인 상점에서 사용할 수있는 모든이 장치를 조립하는 데 유용 할 것이다. 입구를 압력솥 사용하기 전에 필터 카트리지 루어 캡을 출구.
- 비닐 봉지에 1 L 샘플링 물을 붓고 남성 루어 잠금 커넥터 나사 뚜껑을 닫습니다.
- 조심스럽게 비닐 봉투의 수형 루어 락 커넥터에 조립 된 필터 카트리지의 입구 포트에 연결한다. 루어 잠금 커넥터를 과도하게 조이지 마십시오; 펌핑이 시작되면 그렇지 않으면 기기가 누출됩니다. 모든 연결이 메쉬 패널에서 비닐 봉투를 끊기 전에 안전한지 확인하십시오.
- 조심스럽게 메쉬 패널 개의 프롱으로부터 필터 카트리지와 비닐 백을 중단하고, 매니 폴드의 유입구로 실리콘 마개를 삽입한다.
- 흡입기를 켭니다. 여과를 위해 빨간색 - 밸브를 엽니 다. 필터 카트리지가 건조 될 때까지 t, 매니 폴드를 실행암탉은 오프 위치로 빨간색 - 밸브를 켭니다.
- 물을 원하는 금액을 여과 될 때까지 3.1-3.4 단계를 반복합니다.
참고 : 아열대 산호초에서 가져온 물 1 L를 들어,이 여과 약 3 분 소요됩니다. - 조심스럽게 비닐 봉지와 진공 커넥터에서 필터 카트리지를 제거합니다.
- 입구 및 출구 루어 캡 카트리지의 양쪽 끝을 모자.
- 적절하게 빠른 건조 및 비 도포 라벨에 대한 용매 증거 펜을 사용하여 카트리지 입구 루어 캡 레이블.
- DNA 추출하기 전에 -20 ℃에서 필터 카트리지를 저장합니다.
물 4. 여과 (> 4 L) 필터 카트리지를 사용하여 샘플
참고 : 물 여과 볼륨 L.이 여과 시스템은 밸브와 일회용 10 ml를 피펫 팁이 장착 된 10 L 책 병을 필요로 ≤4 경우이 단계를 건너 뜁니다. 10 ml의 피펫 팁 (15.0 mm)의 내경과 선단의 테이퍼끝은 각각 필터 카트리지의 상기 밸브 (15.0 mm)의 외경과 입구 포트에 적합해야한다. 두 연결은 마찰에 맞는에서 여과하는 동안 안전하게 유지됩니다. 사용 전에 10 %의 상업용 표백제 (약 0.6 %의 차아 염소산 나트륨)가있는 피펫 팁을 소독.
- 북 병에 샘플링을 적당량의 물을 준비한다. 단단히 10 L 책 병의 밸브에 10 ml를 피펫 팁을 삽입합니다.
- 단단히 피펫 팁 단부에 필터 카트리지의 출구를 삽입하고, 매니 폴드의 유입구로 실리콘 마개를 삽입한다. 흡입기를 켭니다. 여과를 위해 빨간색 - 밸브를 엽니 다. 필터 카트리지가 건조 될 때까지 매니 폴드를 실행 한 후 오프 위치로 빨간색 - 밸브를 켭니다.
참고 : 아열대 외부 산호초에서 가져온 해수의 10 L를 들어,이 여과 약 30 ~ 40 분 소요됩니다. - 조심스럽게 비닐 봉지와 진공 커넥터에서 필터 카트리지를 제거합니다. 모자 모두입구와 출구 루어 모자와 카트리지의 끝납니다. 적절하게 빠른 건조 및 비 도포 라벨에 대한 용매 증거 펜을 사용하여 카트리지 입구 루어 캡 레이블. DNA 추출하기 전에 -20 ℃에서 필터 카트리지를 저장한다.
필터에서 에드나 5. 추출
참고 : 4 단계와 5 단계에서 우리는 크게 키트에서 제공하는 "핵 피"에 대한 프로토콜 다음, 상용 키트를 사용합니다. 단순성을 위해, 우리는 개별 카트리지를 처리하기위한 절차를 설명한다. 실제로, 우리는 한 번에 8 공정 (또는 원심 분리기의 최대 수) 이하의 필터를 추천한다.
- 56 ° C에서 인큐베이터를 예열.
- 튜브에서 힌지 캡을 절단하여 2.0 ML 튜브를 준비합니다. 뚜껑을 폐기하십시오.
참고 :이 튜브는 필터에 남아있는 액체 수집 관으로 사용됩니다. - 필터 카트리지의 입구 (NOT 출구) 루어 캡을 제거하고, 입구 포트 나 삽입포집 관 NTO. 밀접 자기 접착 필름을 이용하여 카트리지와 수집 튜브 사이의 연결을 밀봉.
- 15 ML 원뿔 튜브 원심 분리기 어댑터에 결합 된 장치를 삽입합니다. 필터에 남아있는 액체를 제거하기 위해 1 분 동안 5,000 XG에서 카트리지를 원심 분리기.
- 필터 카트리지로부터 포집 관을 제거하고 관 버린다. 다시 캡 카트리지의 입구.
- (그렇지 키트에서 제공하는 인산염 완충 생리 식염수) 및 200 μl의 AL 버퍼 20 ㎕의 단백질 분해 효소-K 용액의 혼합물 220 μl의 PBS를 준비합니다.
참고 : 필터 카트리지 혼합물을 4 배 볼륨을 수용 (. CA 1.8 ㎖). - 입구 캡을 제거하고 피펫 팁을 사용하여 필터 카트리지에 혼합물 (440 μL)를 추가합니다. 피펫 팁 그냥 막 위의 카트리지 내부 볼 수 있도록 입구 포트에 완전히 피펫을 삽입합니다.
- 캡 재 유입 포트와 필터 차 배치회전 진탕에 카트리지.
- 56 ℃에서 예열 된 인큐베이터에서 회전 진탕를 놓고 20 분 동안 20 rpm의 속도로 통 켭니다.
- 배양하는 동안, 새로운 2.0 ML 튜브를 준비 적절한 용매 방지 펜을 사용하여 튜브 라벨과 50 ML 원뿔 튜브에 넣습니다.
주 : 전 (2.0 mL) 및 후자의 튜브 (50 ㎖) 추출 DNA의 컬렉션에 대해 각각 2.0 ㎖의 튜브를 유지하기 위해 사용된다. - 배양 후, 입구 캡을 제거하고 50 ML 원뿔 튜브 내에서 2.0 ML 튜브로 (출구 NOT) 카트리지의 포트 입구를 삽입합니다. 스크류 캡으로 50 ml의 원뿔 관을 닫습니다.
- 1 분 카트리지에서 추출 된 DNA를 수집하기 위해 5,000 XG에 50 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. 필터 카트리지 멸균 집게를 사용하여 2.0 ㎖의 튜브를 제거하고 튜브 캡. 필터 카트리지를 폐기하십시오.
추출 된 DNA의 6 정화
참고 : 우리는 100 μL 버퍼 AE 대신 상업 키트의 설명서에 지정된 200 μL와 에드나을 용출.
- 상기 단계 (약 440 μL)에서 2.0 ML 튜브에서 추출 된 DNA에 200 ㎕의 에탄올 (96~100%)를 추가하고 텍싱에 의해 철저하게 섞는다.
- 피펫 2 ml의 수집 튜브에 넣고 스핀 열에 혼합물. 1 분 동안 5,000 XG에 원심 분리기. 유동 통해 수집 튜브를 폐기하십시오.
- 새로운 2 ㎖의 포집 관에서 스핀 컬럼을 놓고 5,000 x g에서 1 분 동안 500 ㎕의 버퍼 AW1, 원심 분리기를 추가합니다. 유동 통해 수집 튜브를 폐기하십시오.
- g, 새로운 2 ㎖의 포집 관에서 스핀 컬럼을 놓고 X 2 만에서 3 분 동안 500 ㎕의 버퍼 AW2, 원심 분리기를 추가합니다. 유동 통해 수집 튜브를 폐기하십시오.
- (안 키트에서 제공) 새로운 1.5 ML 튜브를 준비하고 적절하게 빠른 건조 및 라벨을 비 도포를위한 방수 펜을 사용하여 튜브 라벨. 스핀 열 t 이동1.5 ML 튜브 오.
- 스핀 컬럼 막 중심에 100 ㎕의 완충액 AE를 첨가하여 DNA를 용출시킨다. 실온에서 1 분 동안 배양 한 후 1 분 동안 6000 × g으로 원심 분리기.
- 스핀 열을 취소하고 튜브를 모자. -20 ° C에서 정제 된 DNA를 저장합니다.
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Representative Results
그것은 MiFish 프라이머는 조류와 포유류와 같은 일부 비 물고기 척추 동물에서 대상 지역을 coamplify 때문에 같은 크기의 PCR 제품, 분리 및 추출 된 대량 에드나 만 물고기 에드나를 정량화하는 것은 기술적으로 어렵다 (캘리포니아. 170 bp의 ) 12. 대신 물고기 에드나를 정량화, 우리는 여과 및 DNA 추출의 두 가지 방법을 사용하여 알려진 종 구성 수족관 탱크에서 에드나의 분석을 metabarcoding MiFish을 수행하고,이 프로토콜에서 라이브러리 당 검출 된 종의 수를 비교합니다. 이 간단한 실험은 엄격하게 다른 사람을 통해 그 우수성을 보여주기 위해 "대표적인 결과"가 아니라 같은 본 프로토콜의 가능성을 보여주기 위해 설계되었습니다.
우리는 오키나와 츄라 우미 수족관, 오키나와, 일본 (26˚41'39 "N에서 구로시오 탱크에서 해수의 30 L의 총 샘플링127˚52'41 "E). 쿠로시오 탱크는 35 MX 27 MX 10m와 7,500m 3의 총 물의 양의) L x 폭 x D (치수, 해양 거대 동물을 전시를 위해 설계되었습니다. 그것은 약 큰 60 주택 쿠로시오, 일본의 전체 길이를 따라 북동쪽으로 흐르는 서쪽 경계 전류 중 하나 근처에 특성 2N 크기 바다 물고기 종. 이전 MiFish의 metabarcoding 연구에서, 미야 등. (12)는 63 종의 61 (97 %)을 감지 포함 다섯이 L 해수 시료의 조이다.
해수의 여과를 위해, 우리는 (기공 크기 = 0.45 μm의) 유리 섬유 디스크 필터 (기공 크기 = 0.70 μm의) 필터 카트리지를 사용 하였다. 우리는 동시에 4 물 볼륨 (; 총 여덟 필터 1, 2, 3, 4 L)에 대한 두 가지 프로토콜을 사용하여 동일한 매니 폴드에 해수를 여과 하였다. 해수의 여과 후, 우리는 또한 두 필터 PCR 등급의 물 1 L를 필터 (Filter 카트리지와 음성 대조군 (두 개의 필터 공백)와 같은 유리 섬유 필터). 필터 이러한 유형에서, 우리는 같은 상용 키트를 사용 둘 다 새로운 및 이전에 사용되는 프로토콜 12을 사용하여 에드나를 추출 하였다. 미야 등의 설명에 따라 (두 음성 대조군 포함) 10 에드나 샘플의 총 metabarcoding MiFish 분석을 행 하였다. (12)
페어링 된 엔드 시퀀싱을위한 어댑터를 추가, 간단히, 우리는 대상 지역 (. 캘리포니아 170 bp의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자)를 증폭 1 라운드 PCR을 시행 하였다. 팔 에드나 샘플 (두 음의 컨트롤을 제외)의 경우, 우리는 10 PCR은 각 샘플 (총 80 PCR들) 내에서 검출 된 종의 수의 변화를 볼 복제 실시했다. 우리는 또한 각 팔 에드나 샘플 (총 16 PCR들)에 필터 및 PCR 보호 물을 추가했다. 전체적으로, 우리는 1 라운드 PCR에서 96 PCR 제품을 얻은 그들은 2 라운드 P 템플릿으로 사용되었다이중 인덱싱 CR과 미야 등을 다음 라이브러리 준비를위한 추가 어댑터를 추가. (12)
96 라이브러리 쌍의 엔드 시퀀싱 (2 × 150 염기쌍)은 42,995의 평균 (40,539 필터 카트리지 판독 43121 유리 섬유 필터를 판독) 라이브러리 당 판독과 4,127,546은 판독 얻었다. 역 다중화 및 원시 데이터의 후속 전처리 한 후, 1068266은 분류 학적 과제에 대한 BLAST 검색을 위해 유지했다 읽습니다. 이러한 읽기 중, 830,788는 쿠로시오 탱크 (표 1)에 포함 된 종으로 확인되었다 읽습니다. 830,788 읽고 10 PCR 용 검출 된 종의 평균 수치가 4 L (필터 카트리지) (표 1)에 대해 55-1 L (유리 섬유 필터) 29 원거리에서 여덟 에드나 샘플들로부터 복제에서 우리는 60 탱크 종을 검출 . 여덟 에드나 샘플에서 두 공백의 읽기 숫자는 0에 이르기까지, 사소한했다탱크 종 12.
1-4 L 해수 볼륨에, 우리는 필터 카트리지에 의해 검출 된 종의 수는 유리 섬유 필터 (도 1 ANCOVA, F = 381.8, P <0.001)보다 유의하게 높은 것을 알았다. 필터 카트리지에 의해 검출 된 화학 종의 수는 유리 섬유 필터를 사용하는 것보다 두 방법에서 약 1.5 배 높았다 (ANCOVA, F = 164.2, P <0.001), 여과 물의 부피 증가를 검출 종의 수.
(1) 다른 재료를 통해 샘플링 된 물 여과 (유리 마이크로 화이버 대 친수성 PVDF [폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드]) 및 / 또는 : 필터 카트리지에 의해 감지 된 종의 높은 번호는 하나 또는 그 이상의 실험 워크 플로우의 다음 단계에서 발생할 수 있습니다 (2) 다른 공칭 공경 (0.45(81) 상기 필터 카트리지 및 유리 섬유 필터에서의 m 대 0.70 μm의)의 전 필터에 물고기에서 더 에드나 유지 수; (3) 예열 인큐베이터 로터리 셰이커를 사용 움직 열 블록에 배치 된 스핀 컬럼 절첩 유리 섬유 필터에서보다 필터 카트리지에서보다 DNA 수율을 생산하고; (4) 필터 카트리지에서 원심 분리하여 추출 된 DNA의 회수는 다른 필터 재료 및 / 또는 다른 원심 분리 방법에 의해, 유리 섬유 필터에서보다 더 효율적이다. 분명히, 더 엄격한 설계 연구는 본 연구에서 필터 카트리지에 의해 검출 된 종의 꾸준히 높은 번호에 대한 책임이있는 요인을 파악해야한다.
그림 1 : MiFish Metabarcoding 아나 필터링 된 물 볼륨에 대한 탐지 종 플롯의 수 쿠로시오 탱크 오키나와 우미 수족관. 검출 된 종의 수와 에드나의 용해가 탱크 내에 포함 된 화학 종에 한정된다. 해수 30 L에서, 우리는 필터 카트리지를 사용하여 1, 2, 3, 4 L 샘플을 여과하고, 유리 섬유 필터는 각각 현재 및 이전에 기술 프로토콜 (12)를 사용하는 필터의 에드나 추출 하였다. 우리는 PCR는이 프로토콜을 사용하여 네 개의 물 볼륨에서 복제 10 MiFish metabarcoding 분석 (여러 종의 동시 검출)을 수행 하였다. 상자의 가로 막대는 중간이고; 상자의 상단 및 하단 가장자리가 간 분위에 해당하는 수직 막대가 1.5 × 분위에 해당하고, 점 이상 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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표 1 :.. 분류 학적 구성과 구로시오 탱크에서 에드나 샘플의 MiSeq의 분석에서 검출 된 60 종의 읽기 번호 만 지정 데이터베이스에 참조 시퀀스 탱크에 포함 된 종은 도시 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 테이블.
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Discussion
물, 토양 등의 환경 시료를 사용하여 많은 metabarcoding 연구를 다음과 같이, 필터 카트리지의 후 여과 처리는 일반적으로 24, 25 : 1)로 개방 절단 또는 손 도구 (튜브 커터 치)와 하우징 분해; 2) 필터 카트리지에서 제거; 3) DNA 추출을위한 면도날 작은 조각으로 절단 필터. 널리 사용되는 저가의 상용 키트를 사용하여 필터 카트리지의 하우징 내에 이러한 귀찮고 시간 소모적 인 실험실 오염되기 쉽다 절차 우리 시도 여러 DNA 추출 방법을 피하고 성공적 양호하여 본 프로토콜 개발하려면 에드나 metabarcoding 분석 결과 (그림 1).
본 프로토콜에서 더욱 중요한 단계 중 하나는 예열 된 인큐베이터에서 회전 진탕의 사용이다, 그 이후의 라이브러리 위해 준비 할 좋은 DNA 수율을 제공 할 수있다에드나 metabarcoding 분석 ATION. 최적의 온도에서 주택 내의 단백질 분해 효소-K 솔루션의 정수 교반 아마 필터에 포집 입자에서 DNA 추출을 용이하게한다. 이 프로토콜은 회전 진탕 배양기 및 양자의 사용을 포함한다는 점에 유의하고, 후자는 전자를 수용 할 수 있어야한다. 또한, 원심 분리는 15 mL 및 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 각각 후 여과 필터에 남아있는 액체를 제거하고, 카트리지 내에 추출 된 DNA를 수집 불가결를 모두 수용 할 수있다.
카트리지를 열 절단 할 필요없이 이러한 DNA 추출을 달성하기 위해 다른 방법이있다 (자재 / 시약의 도표 참조). 이 키트는 DNA 추출을위한 어떤 효소를 사용하지 않습니다; 대신 비드 고해 부가적인 기계적 분해와 함께 특수 용해 완충액을 사용한다. 온대 해안 태평양 천연 해수에 따라 예비 실험에서, 우리는이 시도상업 키트를 사용하여 본 프로토콜의 프로토 타입과 함께이 키트를 사용하여 테드 DNA의 추출. 후자의 프로토 타입 프로토콜의 사용과 함께, 우리는 일관 첫번째 라운드 PCR에 대한 겔 전기 영동에서 독특한 증폭 산물을 인식 하였다. 반면에, 우리는 제조자에 의해 제공된 두 개의 다른 프로토콜을 다음 불구 (/ 시약 표 재료 참조) 다른 장비를 사용하여 모든 PCR 생성물을 수득하지 못했다. (/ 시약 표 재료 참조) PCR 저해제의 제거 단계는 제 2 세트의 두 개의 프로토콜들에 포함되는 것을 고려하면, 이러한 관찰 템플릿 DNA 충분한 양의 부족을 의미한다. 두 번째 키트를 사용하여 환경 시료에서 이러한 상대적으로 낮은 DNA 금리는 최근의 연구 (26, 27)에보고됩니다.
본 프로토콜에서, 우리는 큰 공칭 기공 크기 (0.45 μm의)와 필터 카트리지를 선택한 수생 미생물 연구의 통상도하면서에서야 더 큰 기공 크기의 필터 (1 ㎛ 3) (28)을 통해 예비 분리 후 작은 하나 (0.22 μm의)를 사용합니다. 기공 크기는 유리 섬유 필터 (0.70 μm의) 우리가 종래 12,14 연구 이전 에드나에서 사용한의 훨씬 더 가까운 1) 우리 선택한 이유는 단순하고 간단하며, 이론적 인 인자를 기반으로하지 않는 22, 23; 2) 물 큰 부피가 1보다 작아 여과되도록 기대된다. 후자의 기능은 부족 물고기의 풍부한 바이오 매스와 오픈 바다와 심해 생태계에 받고있는 우리의 현재 연구 프로젝트에 특히 중요하다. 사실, 우리는 눈에 띄는 막힘과 쿠로시오 탱크에서 해수의 독립적으로 샘플링 된 10-L의 성공 여과를 확인 (결과는 도시하지 않음). 그러나 최근, 터너 등. (29)는 증명이 0.2 μm의 여과 극대화 잉어 에드나 캡처 (85 % ± 6 %) 총 (즉, 비 대상)을 최소화하면서 에드나캡처 (48 % ± 3 %)이지만 필터 미만 250ml의 샘플 용적이 세공 직경을 한정 막힘. 추가의 연구가 에드나 생선 풍부 매스 다양한 수준으로 수계의 다양한 형태 metabarcoding 대한 필터 카트리지의 최적 필터의 기공 크기 및 물을 여과 용적을 결정할 필요가있다.
이 프로토콜의 제한 중 하나는 물 여과는 전원 공급이 가능 실험실에서 수행되어야한다는 것이다. 이 유기체에서 창고 단지 (일 시간) 수생 환경에서 짧은 시간 (30)에 대한 검출입니다으로 인해 DNA의 제한 화학적 안정성, 에드나는 곧 떨어지기 시작. 그러므로 에드나 상당한 저하를 방지하기 위해 수집 한 직후 물 샘플을 필터링하기에 이상적이다. 이와 관련하여, 필터 카트리지를 사용하여 현장 여과 방법의 개발이 유망한 다음 단계 일 것이다. 휴대 및 sterilit필터 카트리지의 y를보다 정확하게 에드나의 metabarcoding에서 물고기 커뮤니티의 종 구성을 반영 할 수있는 더 많은 손상 에드나를 제공합니다 현장 여과 방법의 개발을 가능하게한다. 필터 카트리지에 수집 된 에드나는 상용 시약 (31)의 주입에 의해 안정화 될 수있다 (/ 시약 표 자료를 참조) 롱 마이어는 실험실로 다시 데려 전에 카트리지로 (32)를 버퍼.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
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