Introduction
Экологическая ДНК (Эдна) в водной среде относится к генетическому материалу, найденной в толще воды. Недавние исследования показали полезность Эдна для обнаружения рыбы из различных водных средах, в том числе прудов, рек 1-3 4-8, потоки 9 и морской воды 10-14. Большинство этих исследований сосредоточено на выявлении одного или нескольких инвазивных 1,4-6,8,14 и редких или исчезающих видов 3,9, в то время как некоторые недавние исследования попытались одновременное обнаружение нескольких видов в местных сообществах рыб 7,9, 12,13,15 и мезокосмах 11,12.
Последний подход называется "metabarcoding" и Эдна metabarcoding использует один или несколько наборов праймеров ПЦР для coamplify область гена через таксономически различных образцов. За этим следует библиотекой препарата с индексацией и адаптером Кроме того, и индексированного библиотеки анализируют с помощью высокопроизводительного параллельного секвенированияПлатформа. Недавно Мия и др. 12 разработали универсальные ПЦР - праймеров для metabarcoding Эдна из рыб ( так называемые "MiFish"). В MiFish праймеры целевой гипервариабельной области митохондриального гена 12S рРНК (163-185 п.н.), который содержит информацию, достаточную для идентификации рыб к таксономической семьи, рода и вида для некоторых близких сородичей за исключением. С использованием этих праймеров в Эдна metabarcoding, Мия и др. 12 было обнаружено более 230 видов субтропических морских из аквариумов с известными видовой состав и коралловых рифов вблизи аквариума.
При оптимизации протокола metabarcoding для размещения естественной морской воды с различными уровнями концентрации Эдна от рыб, мы заметили, что MiFish праймеры иногда не в состоянии усилить целевой регион для последующей подготовки библиотеки. Одной из наиболее вероятных причин этого неудачного ПЦР-амплификации является отсутствие достаточного количества ТЕmplate ДНК , содержащаяся в небольших объемах воды фильтруются (т.е. 1-2 л). Хотя концентрация Эдна из определенной таксономической группы непознаваема до усиления, фильтрации больших объемов воды (> 1-2 л) будет простым и эффективным средством, чтобы собрать больше Эдна из водной среды с дефицитного обилием рыбы и биомассы, таких как открытого океана и глубоководных экосистем.
По сравнению с фильтрами дисковых волокна , обычно используемые в количестве рыбы Едне исследований 16, фильтровальные патроны имеют преимущество размещения больших объемов воды до забивания 17. На самом деле, недавнее исследование показало , большой объем (> 20 л) фильтрации проб морской воды с использованием береговых картриджей фильтра 18. Кроме того, они индивидуально упакованы и стерильны, и несколько шагов экспериментального процесса может быть выполнена в корпусе фильтра, таким образом , снижая вероятность загрязнения из лаборатории 19. Последнийфункция имеет решающее значение для Эдна metabarcoding, в которых риск заражения остается одной из крупнейших экспериментальная проблемы 20,21. Несмотря на эти технические преимущества фильтровальных патронов, он не был использован в исследованиях Эдна рыб с двумя исключениями 8,15.
Здесь мы предлагаем протокол для фильтрации проб воды с фильтром и патроном извлечения Эдна из его фильтра без необходимости разрезать корпус. Мы также предлагаем две альтернативные системы фильтрации воды в зависимости от объемов воды (≤4 л или> 4 л). Для сравнения эффективности вновь разработанного протокола и ранее используемый протокол , используя фильтр из стекловолокна в нашей исследовательской группе 12,14,22,23, мы выполняем Эдна metabarcoding анализ морской воды из огромного аквариума бака (7,500 м 3 ) с известной видовой состав, и показывают количество обнаруженных видов, полученных из двух протоколов в качестве представителя результатов. Этот протокол ч, как были разработаны для metabarcoding Эдна от рыб, но также применимо к Эдна из других организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол не касается отбора проб воды и metabarcoding методами. Вода может быть выбраны по - разному в зависимости от целей исследования 16 и увидеть Мия и др. 12 Подробную информацию о методах metabarcoding с использованием MiFish праймеров. Обратите внимание, что пробы воды должна быть очень холодной и фильтруют в течение нескольких часов, чтобы избежать деградации Эдна. Кроме того, обратите внимание, что этот протокол включает в себя использование ротационном шейкере и инкубатор, и последний должен быть достаточно большим, чтобы вместить прежний. Кроме того, центрифуга, который может вместить и 15 мл и 50 мл конические пробирки незаменима для удаления оставшейся жидкости из фильтра после фильтрации и для сбора ДНК, извлеченной в картридже, соответственно.
1. Обработка винтовую крышку и 1 L Полиэтиленовый пакет
Примечание: Пропустите этот шаг, если объем фильтрации> 4 L.
- Просверлите отверстие через центр винтового Cар (прилагается к одноразовому 1 л пластиковый пакет) с таким же диаметром (4,8 мм) в качестве трубы, выступающей из разъема Луера мужского. Используя диагональные плоскогубцы, укоротить трубку разъема Луера мужской до соответствующей длины (ок. 3 мм) во избежание образования комков небольшого количества воды внутри колпачка после фильтрации.
- Нанесите клей клей специализированный для полиэтилена (ПЭ) и полипропилена (PP) и к нижней поверхности и штыревой контакт Луера и винтовой крышкой, соответственно. Подождите несколько минут для хорошего склеивания (обратитесь к инструкциям производителя).
- Вставьте разъем Луера мужской в отверстие крышки винта. Подождите до полного склеивания двух частей (обычно> 24 ч). Стерилизовать винтовую крышку с штыревым разъемом Луер-Лок с 10% коммерческого отбеливателя (ок. 0,6% гипохлорита натрия) перед использованием.
- Удар два отверстия в двух нижних углах 1 л пластиковый пакет, чтобы повесить ее от тезч панели (этап 3). Убедитесь, что диаметр отверстий больше, чем у штырьками панели сетки.
2. Сборка Система фильтрации
- Прикрепите высокий вакуумный шланг к входному разъему аспиратором насоса и прикрепите другой конец трубки к коллектору. Убедитесь , что три красные футболки клапаны коллектора находятся в "выключенном положении" (т.е. по горизонтали).
- Ношение чистый комплект перчаток, вставьте женскую Луер установку и вакуумный разъем на верхней и нижней концах вакуумной резиновой трубки для фильтрации, соответственно.
- Осторожно прикрепить женскую Люэровский соединитель к выходному отверстию картриджа фильтра и прикрепить вакуумный разъем к силиконовой пробкой.
3. Фильтрация проб воды (≤4 L) с использованием фильтровального картриджа
Примечание: Пропустите этот шаг, если объем фильтрации> 4 L. Эта система фильтрации требует самостоятельный Панель Fили висит полиэтиленовый пакет, заполненный 1 л воды. Панель сетки, несколько зубцов, и стенд для панели, все это доступно в интернет-магазинах, было бы полезно для сборки данного устройства. Автоклава впускных и выпускных Luer колпачки для картриджа фильтра перед использованием.
- Залить 1 л воды отобранной в пластиковый пакет и закройте винтовую крышку с разъемом Луер-Лок мужской.
- Осторожно подсоединить впускное отверстие собранного патрона фильтра с мужской Луера разъем пластикового пакета. Не затягивайте разъем Luer-замок; В противном случае устройство будет течь, как только начинается откачка. Убедитесь, что все соединения надежно закреплены, прежде чем повесить пластиковый пакет с панели сетки.
- Аккуратно повесьте пластиковый пакет с картриджем фильтра с двумя зубцами на панели сетки и вставить силиконовую пробку во входное отверстие коллектора.
- Включите аспиратором. Открыть красные футболки с клапанами для фильтрации. Запустите коллектор, пока картридж фильтра не высохнет, ткурица повернуть красный Т-образный клапан в нерабочее положение.
- Повторите шаги 3.1-3.4, пока желаемое количество воды не будет отфильтрован.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения 1 л воды, взятой из субтропических коралловых рифов, она занимает около трех минут для фильтрации. - Осторожно вынуть патрон фильтра из пластикового пакета и вакуумный разъем.
- Закрывают оба конца картриджа с входным и выходным Luer крышками.
- Этикетка картриджа и входное отверстие Люэра колпачок надлежащим образом с помощью пера растворителя доказательство для быстрой сушки и без размазывания маркировки.
- Храните картридж фильтра при -20 ° С до экстракции ДНК.
4. Фильтрация воды (> 4 л) образцов с использованием картриджа фильтра
Примечание: Пропустите этот шаг, если объем фильтрации воды ≤4 L. Эта система фильтрации требует книга бутылки емкостью 10 л, снабженный клапаном и одноразового 10 мл кончика пипетки. Внутренний диаметр 10 мл пипетку (15,0 мм) и конусность наконечникаконец должен соответствовать к внешнему диаметру клапана (15,0 мм) и впускным отверстием фильтрующего патрона, соответственно. Оба соединения удерживаются надежно во время фильтрации в порыве трения. Стерилизовать кончик пипетки с 10% коммерческого отбеливателя (около 0,6% гипохлорита натрия) перед использованием.
- Подготовьте соответствующее количество отобранного воды в книжном бутылке. Плотно вставьте наконечник пипетки 10 мл в клапан 10 л книжной бутылки.
- Плотно вставьте выпускное отверстие картриджа фильтра в конце наконечника пипетки и вставить силиконовую пробку во входное отверстие коллектора. Включите аспиратором. Открыть красные футболки с клапанами для фильтрации. Запустите коллектор, пока картридж фильтра не высохнет, затем поверните красный Т-образный клапан в нерабочее положение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения 10 л морской воды, взятой из субтропических внешних коралловых рифов, она занимает около 30-40 мин для фильтрации. - Осторожно вынуть патрон фильтра из пластикового пакета и вакуумный разъем. Cap какконцы картриджа с входным и выходным Luer крышками. Этикетка картриджа и входное отверстие Люэра колпачок надлежащим образом с помощью пера растворителя доказательство для быстрой сушки и без размазывания маркировки. Храните картридж фильтра при температуре от -20 ° C до экстракции ДНК.
5. Извлечение Эдна из фильтра
Примечание: В пунктах 4 и 5, мы используем коммерческий набор, в основном в соответствии с протоколом для "зародышевого крови", представленной в комплекте. Для простоты мы опишем процедуру обработки отдельного картриджа. На практике мы рекомендуем обработку 8 (или максимальное количество центрифуге) или меньшее количество фильтров одновременно.
- Разогреть инкубатор до 56 ° C.
- Приготовьте 2,0 мл трубки, разрезав шарнирный колпачок из трубки. Выбросите колпачок.
Примечание: Эта трубка используется в качестве коллекторной трубки для оставшейся жидкости в фильтре. - Снимите впускной канал (НЕ на выходе) Люэра колпачок с картриджа фильтра и вставьте I входное отверстиеNto пробирку. Плотно запечатать соединение между картриджем и коллекторной трубки, используя самогерметизирующегося пленку.
- Вставьте комбинированное устройство в адаптер центрифуг для 15-мл коническую трубку. Центрифуга картридж при 5000 х г в течение 1 мин для удаления оставшейся жидкости в фильтре.
- Снимите трубку сбора из картриджа фильтра и удалите трубку. Повторно колпачок впускное отверстие картриджа.
- Приготовить смесь из 20 мкл раствора протеиназы-К, 220 мкл PBS (фосфатный солевой буфер, не обеспечиваются комплектом) и 200 мкл буфера AL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрующий вмещает до четырех раз объемов смеси (. Ок 1,8 мл). - Снимите впускной колпачок и добавьте смесь (440 мкл) в картридж фильтра с помощью пипетки. Вставьте пипетку полностью во входное отверстие так, чтобы кончик пипетки виден внутри картриджа непосредственно над мембраной.
- Re-колпачком впускное отверстие и поместить фильтр автомобиляTridge на роторной качалке.
- Поместите ротационного шейкера в предварительно разогретой инкубаторе при 56 ° С и включите шейкере со скоростью 20 оборотов в минуту в течение 20 мин.
- Во время инкубации, подготовить новый 2,0 мл трубки, маркировать трубку надлежащим образом с использованием растворителя доказательства ручку и поместить его в 50-мл коническую трубку.
Примечание: Прежние (2,0 мл) и последние пробирки (50 мл) используются для сбора извлеченной ДНК и для удержания 2,0 мл трубки, соответственно. - После инкубации, снимите впускной колпачок и вставьте входное отверстие (не выпускной) порт картриджа в 2,0 мл трубки в 50 мл коническую трубку. Закройте коническую трубку объемом 50 мл с завинчивающейся крышкой.
- Центрифуга 50-мл коническую трубку при 5000 х г в течение 1 мин, чтобы собрать экстрагированной ДНК из картриджа. Извлеките картридж фильтра и 2,0 мл пробирку с помощью стерилизованных щипцов и колпачок трубки. Откажитесь картридж фильтра.
6. Очистка экстрагированной ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы вымывается Эдна с 100 мкл буфера АЕ вместо 200 мкл, указанных в руководстве по эксплуатации коммерческого набора.
- Добавить 200 мкл этанола (96-100%) с экстрагированной ДНК в 2,0-мл пробирку с описанной выше стадии (приблизительно 440 мкл), и тщательно перемешать встряхиванием.
- Пипеткой смесь в ротационную колонку, помещенного в пробирку для сбора 2 мл. Центрифуга при 5000 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от проточных и пробирку для сбора.
- Поместите колонку отжиму в новой коллекции трубки 2 мл, добавляют 500 мкл буфера для AW1 и центрифугу в течение 1 мин при 5000 х г. Откажитесь от проточных и пробирку для сбора.
- Поместите колонку отжиму в новой коллекции трубки 2 мл, добавляют 500 мкл буфера для Aw2 и центрифугу в течение 3 мин при 20000 х г. Откажитесь от проточных и пробирку для сбора.
- Подготовьте новый 1,5 мл трубки (не входит в комплект) и маркировать трубку надлежащим образом с использованием водонепроницаемого ручка для быстрой сушки и без размазывания маркировки. Перенести спин колонки тO в 1,5 мл трубки.
- Элюции ДНК путем добавления 100 мкл буфера AE в центре мембраны ротационную колонку. Инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре, а затем центрифуге при 6000 х г в течение 1 мин.
- Выбросите колонку спиновый и колпачок трубки. Хранить очищенной ДНК при -20 ° С.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это технически трудно выделить и количественно только рыбу Эдна из извлеченной объемной Эдна, поскольку MiFish праймеры coamplify целевой регион от некоторых нерыбных позвоночных животных, таких как птицы и млекопитающие, с PCR продуктами одного и того же размера (ок. 170 б.п. ) 12. Вместо того, чтобы количественной оценки рыбы Эдна, мы выполняем MiFish metabarcoding анализ Эдна из аквариума бака с известным составом пород с использованием двух различных методов фильтрации и экстракции ДНК, и сравнить количество обнаруженных видов в библиотеке из двух протоколов. Этот простой эксперимент был разработан, чтобы показать возможности настоящего протокола в качестве «репрезентативные результаты», а не строго доказать свое превосходство над другими.
Мы пробовали в общей сложности 30 л морской воды из бака Куросио в Тюрауми, Окинава, Япония (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). Резервуар Куросио предназначен для экспонирования морских мегафауны, с размерами (Д х Ш х Г) 35 м х 27 м х 10 м и общим объемом воды 7500 м 3. Он находится примерно в 60 крупных -sized морские виды рыб , характерные для зоны вокруг Куросио, одной из западных пограничных течений , протекающих на северо - восток по всей длине Японии. в предыдущем исследовании MiFish metabarcoding, Мия и др. 12 обнаружены 61 из 63 видов (97%) , содержащегося в резервуаре из пяти 2 л проб морской воды.
Для фильтрации морской воды, мы использовали фильтрующие картриджи (размер пор = 0,45 мкм) и фильтры диска из стекловолокна (размер пор = 0,70 мкм). Мы одновременно фильтруют морскую воду на том же самом коллекторе с использованием двух протоколов для четырех объемов воды (1, 2, 3 и 4 л, общее число, восемь фильтров). После фильтрации морской воды, мы также фильтруется 1 л ПЦР-класса воды с двумя фильтрами (FМСДЭНИ картридж и стекловолокна фильтр) в качестве отрицательного контроля (два фильтра пробелов). Из этих типов фильтров, мы извлеченный Едне с использованием новых и ранее используемых протоколов 12, оба из которых используют те же коммерческого набора. В общей сложности 10 образцов Эдна ( в том числе двух отрицательных контролей) были подвергнуты MiFish metabarcoding анализ , как описано в мия и др. 12
Коротко говоря, мы провели 1 - й круговой ПЦР для амплификации целевой области (митохондриальные 12S гена рРНК;. Ча 170 п.н.) и добавлять адаптеры для парного секвенирования. Для восьми образцов Эдна (за исключением двух отрицательных контролей), мы провели 10 PCR размножается, чтобы увидеть изменения количества обнаруженных видов в пределах каждой выборки (всего 80) PCRs. Мы также добавили фильтр и ПЦР заготовок в каждые восемь образцов Эдна (всего 16) регистров PCR. В общей сложности мы получили 96 продуктов ПЦР с 1-го тура ПЦР, и они были использованы в качестве шаблонов для 2-го раунда PCR для двойной индексации и добавления дополнительных адаптеров для подготовки библиотеки следующие Мия и др. 12
Парноконцевое секвенирование (2 х 150 пар оснований) из 96 библиотек дали 4127546 читает, со средним числом 42,995 читает в библиотеке (40539 читает в картридже фильтра и 43121 считывает в фильтре из стекловолокна). После демультиплексирования и последующей предварительной обработки исходных данных, 1068266 чтений были сохранены на поиски BLAST для таксономического назначения. Из них гласит, 830788 чтений были идентифицированы как те виды , содержащихся в резервуаре Куросио (таблица 1). Мы обнаружили 60 видов танков из 830788 читает и средние числа обнаруженных видов для 10 PCR размножается из восьми образцов Эдна варьировались от 29 за 1 л (стеклопластиковый фильтр) до 55 на 4 л (патрона фильтра) (таблица 1) , Чтение номера двух заготовок из восьми образцов Эдна были незначительными, в пределах от 012 для видов танков.
Мы обнаружили , что число обнаруженных видов по картриджа фильтра была значительно выше , чем у стекловолоконных фильтрах (ANCOVA, F = 381,8, р <0,001; рис 1) через объемов морской воды 1-4 л. Количество обнаруженных видов по картриджа фильтра были примерно в 1,5 раза выше , чем те , которые используют фильтры по стекловолокнистых и в обоих методах, число обнаруженных видов увеличилось с объемом воды отфильтрованной (ANCOVA, F = 164,2, р <0,001).
Более высокие числа обнаруженных видов картриджем фильтра может быть результатом одного или нескольких из следующих шагов в экспериментальных рабочих процессов: фильтрации семплированного воды через (1) различных материалов (гидрофильные ПВДФ [поливинилидин дифторида] против стеклянного микроволокна) и / или (2) различные номинальные размеры пор (0,4581; м против 0,70 мкм) в фильтре картриджей и фильтров из стекловолокна может сохранить больше Эдна из рыбы на бывшего фильтра; (3) использование роторной качалке в предварительно нагретый инкубатор производит больше выход ДНК из картриджа фильтра, чем из сложенных стекловолокнистых фильтров в ротационную колонку, размещенной на неподвижном блоке тепла; (4) сбор экстрагированной ДНК центрифугированием из картриджа фильтра является более эффективным, чем из стекловолоконного фильтра вследствие различных фильтрующих материалов и / или различных методов центрифугирование. По-видимому, более строго спланированное исследование требуется, чтобы определить факторы, ответственные за последовательно большего числа обнаруженных видов картриджем фильтра в данном исследовании.
Рисунок 1: Количество обнаруженных видов нанесенными против Тома фильтрованной воды в MiFish Metabarcoding Ana лизис Едне из Куросио танке, Тюрауми. число обнаруженных видов ограничено видов , содержащихся в резервуаре. Из 30 л морской воды, мы фильтруется 1, 2, 3 и 4 л проб с использованием картриджей фильтра и фильтры из стекловолокна и экстрагируют Эдна из этих фильтров с использованием существующих и ранее описанных протоколов 12, соответственно. Мы провели анализ MiFish metabarcoding (одновременное обнаружение нескольких видов) для 10 PCR размножается из четырех объемов воды с использованием двух протоколов. Горизонтальная полоса в поле представляет собой медиану; верхние и нижние края коробки соответствуют интер-квартилях, вертикальные полосы соответствуют 1,5 х квартили, а точки представляют собой выбросы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
/files/ftp_upload/54741/54741tbl1.jpg "/>
Таблица 1:.. Таксономический состав и прочитать Числа 60 видов , обнаруженных в MiSeq Анализы Эдна Образцы из Куросио чана только те виды , содержащиеся в резервуаре с эталонными последовательностями в пользовательской базе данных показаны Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этот стол.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во многих исследованиях metabarcoding с использованием проб окружающей среды , такие как вода и почва, лечение после фильтрации картриджа фильтра , как правило , следующим образом 24,25: 1) разрезав или растрескиванию корпус с ручным инструментом (резцом насосно - компрессорных труб или плоскогубцами); 2) удаление фильтра из картриджа; и 3) разрезание фильтра на мелкие кусочки с лезвием бритвы для экстракции ДНК. Чтобы избежать таких громоздкой и отнимает много времени процедуры, которые склонны к загрязнению в лаборатории, мы попытались несколько методов выделения ДНК внутри корпуса картриджа фильтра с использованием широко используемый, недорогой коммерческий набор, и успешно разработали настоящий протокол с благоприятным результаты Эдна metabarcoding анализа (рисунок 1).
Одним из наиболее важных этапов в настоящем протоколе является использование роторной качалке в разогретую инкубаторе, который способен обеспечить хороший выход ДНК для последующего библиотеки ДГОвания в metabarcoding анализа Эдна. Постоянное перемешивание раствора протеиназы-К в корпусе при оптимальной температуре, вероятно, облегчает выделение ДНК из частиц, захваченных на фильтре. Однако следует отметить, что этот протокол включает в себя использование обоих ротационном шейкере и инкубатор, а последний должен быть способен вместить прежний. Кроме того, центрифуга, который может вместить и 15 мл и 50 мл конические пробирки незаменима для удаления оставшейся жидкости из фильтра после фильтрации и сбора экстрагированной ДНК внутри картриджа, соответственно.
Существует еще один вариант для достижения такой экстракции ДНК без необходимости разрезать картридж (см Таблицу материалов / реагентов). Комплект не использует ферменты для экстракции ДНК; вместо этого он использует специальный буфер для лизиса в сочетании с дополнительными механическими лизиса с бисерной избиением. В предварительных экспериментах, основанных на естественной морской воде от умеренного прибрежной части Тихого океана, мы attempизвлечений Ted ДНК, используя этот набор вместе с прототипом настоящего протокола с использованием коммерческого набора. При использовании последнего протокола прототипа, мы последовательно признавала различные продукты амплификации в гель-электрофореза на 1-й круглый ПЦР. В отличие от этого , мы не смогли получить каких - либо продуктов ПЦР путем использования другого набора (см Материалы / Реагенты таблицу) , несмотря на следующие два альтернативных протоколов , предоставляемых производителем. Принимая во внимание , что стадии удаления ингибитора ПЦР включены в двух протоколов второго комплекта (см Материалы / Реагенты таблицу), это наблюдение предполагает отсутствие достаточного количества ДНК в шаблоне. Такие относительно низкие выходы ДНК из проб окружающей среды с использованием второго набора представлены в недавних исследованиях 26,27.
В настоящем протоколе, мы выбрали картридж фильтра с большим номинальным размером пор (0,45 мкм), в то время как водная микробные исследования conventionaLLY использовать меньший (0,22 мкм) после префильтрацией через большие фильтры размером пор ( от 1 до 3 мкм) 28. Причины нашего выбора просты и просты, и не основаны на теоретических аргументов: 1) размер пор гораздо ближе к тому , что из стекловолоконных фильтрах (0,70 мкм) мы обычно используемые в предыдущих Эдна исследования 12,14, 22,23; 2), как ожидается, позволит больших объемов воды, подлежащей фильтрованию, чем меньший. Последняя особенность является особенно важным для наших текущих исследовательских проектов, проходящих в открытом океане и глубоководных экосистем с дефицитного обилием рыбы и биомассы. На самом деле, мы подтвердили успешную фильтрационной независимо друг от друга отобранного 10 л морской воды от Куросио резервуара без заметного засорению (результаты не показаны). Однако в последнее время , Тернер и др. 29 показали , что 0,2 мкм фильтрация захвата максимально карп Эдна (85% ± 6%) при минимизации общего объема (т.е. нецелевых) Эдназахват (48% ± 3%), но к забиванию фильтра ограничен этот размер пор в объеме пробы менее 250 мл. Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить оптимальный фильтр объема пор размер и фильтрация воды картриджа фильтра для Эдна metabarcoding в различных типах водных сред с различными уровнями численности рыб и биомассы.
Одним из недостатков этого протокола является то, что фильтрация воды должна быть выполнена в лаборатории, где источник питания доступен. Из - за ограниченной химической стабильности ДНК, Эдна начинает снижаться , как только он пролил из организма и обнаруживается только в течение короткого периода времени в водной среде (часов до нескольких дней) 30. Поэтому он идеально подходит, чтобы немедленно отфильтровать пробу воды после сбора, чтобы избежать значительного ухудшения Эдна. В связи с этим, разработки методов фильтрации на месте с использованием фильтрующего картриджа будет многообещающим следующий шаг. Переносимость и sterilitу картриджа фильтра позволяют разработку методов фильтрации на месте, что обеспечит более нетронутыми Эдна, которые могут отражать видовой состав сообщества рыб более точно в Эдна metabarcoding. Собранный Эдна на фильтровальных патронов могут быть стабилизированы путем инъекции коммерческого реагента 31 (см Материалы / Реагенты таблицу) или Longmire буфер 32 в картридж до приведения его обратно в лабораторию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
