Introduction
يشير الحمض النووي البيئي (إدنا) في البيئات المائية على المواد الجينية الموجودة في عمود الماء. أثبتت الدراسات الحديثة فائدة ادنا للكشف عن الأسماك من البيئات المائية المختلفة، بما في ذلك البرك 1-3، 4-8 الأنهار والجداول 9، ومياه البحر 10-14. ركزت معظم هذه الدراسات على الكشف عن الأنواع واحدة أو عدد قليل الغازية 1،4-6،8،14 ونادرة أو مهددة 3،9، في حين حاولت بعض الدراسات التي أجريت مؤخرا كشف في وقت واحد من أنواع متعددة في المجتمعات الأسماك المحلية 7،9، 12،13،15 وmesocosms 11،12.
ويسمى هذا النهج الأخير "metabarcoding" ويستخدم إدنا metabarcoding واحدة أو عدة مجموعات من الاشعال PCR لcoamplify منطقة الجين عبر عينات متنوعة تصنيفيا. ويلي ذلك إعداد مكتبة مع الفهرسة وإضافة محول، ويتم تحليل المكتبات فهرستها من قبل الإنتاجية العالية التسلسل الموازيمنصة. مؤخرا ميا وآخرون. 12 وضعت الاشعال PCR عالمية لmetabarcoding إدنا من الأسماك (وتسمى "MiFish"). الاشعال MiFish تستهدف في منطقة التغير الزائد من الميتوكوندريا 12S الريباسي جين (163-185 بي بي)، الذي يحتوي على معلومات كافية لتحديد الأسماك لعائلة التصنيف، جنس والأنواع باستثناء بعض المتجانسات ترتبط ارتباطا وثيقا. مع استخدام تلك الاشعال في إدنا metabarcoding، ميا وآخرون. 12 الكشف عن أكثر من 230 نوعا البحرية شبه الاستوائية من الدبابات حوض السمك مع المعروفة تكوين الأنواع والشعاب المرجانية بالقرب من الحوض.
مع تحقيق بروتوكول metabarcoding لاستيعاب مياه البحر الطبيعية مع مستويات تركيز إدنا من أسماك مختلفة، لاحظنا أن الاشعال MiFish فشلت في بعض الأحيان إلى تضخيم المنطقة المستهدفة لإعداد مكتبة لاحق. واحد من الأسباب الأكثر احتمالا لهذا التضخيم PCR ناجحة هو عدم وجود كميات كافية من الشركة المصرية للاتصالاتmplate الحمض النووي الواردة في كميات صغيرة من الماء المصفى (أي 1-2 L). وعلى الرغم من تركيز إدنا من مجموعة تصنيفية معينة هو مجهول قبل التضخيم، والترشيح من كميات المياه الكبيرة (> 1-2 لتر) من شأنه أن يكون وسيلة بسيطة وفعالة لجمع أكثر إدنا من البيئات المائية مع وفرة الأسماك النادرة والكتلة الحيوية، مثل المحيطات المفتوحة وأعماق البحار النظم الإيكولوجية.
بالنسبة للمرشحات الألياف القرص المستخدمة تقليديا في عدد من البحوث إدنا الأسماك 16، خراطيش تصفية لديها ميزة على استيعاب كميات المياه الكبيرة قبل انسداد 17. في الواقع، أظهرت دراسة حديثة حجم كبير (> 20 L) الترشيح للعينات مياه البحر الساحلية باستخدام خراطيش تصفية 18. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تعبئتها بشكل فردي ومعقمة، ويمكن إجراء عدة خطوات سير العمل التجريبي في السكن التصفية، وبالتالي تقليل احتمال تعرضها للتلوث من المختبر 19. الأخيرالميزة الهامة لإدنا metabarcoding، والذي من مخاطر التلوث ما زال ضمن أكبر التجريبية تتحدى 20،21. على الرغم من هذه المزايا التقنية خراطيش مرشح، لم يتم استخدامه في الدراسات إدنا من الأسماك مع اثنين من الاستثناءات 8،15.
نحن هنا نقدم بروتوكول لترشيح من عينات المياه مع فلتر خرطوشة واستخراج إدنا من مرشح من دون الحاجة إلى قطع فتح الإسكان. ونحن نقدم أيضا اثنين من أنظمة تنقية المياه البديلة اعتمادا على كميات المياه (≤4 L أو> 4 L). لمقارنة أداء بروتوكول المطورة حديثا وبروتوكول يستخدم سابقا باستخدام فلتر الألياف الزجاجية في مجموعتنا البحثية 12،14،22،23، ونحن أداء إدنا metabarcoding تحليل مياه البحر من خزان ماء ضخم (7500 م 3 ) مع تركيبة الأنواع المعروفة، وعرض عدد من أنواع الكشف المستمدة من البروتوكولين كنتائج التمثيلية. هذا البروتوكول حكما تم وضعها لmetabarcoding إدنا من الأسماك، ولكن ينطبق أيضا على ادنا من الكائنات الحية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: هذا البروتوكول لا يتعامل مع طرق أخذ العينات المياه وmetabarcoding. قد أخذ عينات المياه بطرق مختلفة اعتمادا على أغراض الدراسة 16 وانظر ميا وآخرون. (12) لتفاصيل الطرق metabarcoding باستخدام بادئات MiFish. لاحظ أن الماء عينات يجب أن تبقى باردة جدا وتصفيتها في غضون ساعات قليلة لتجنب تدهور إدنا. لاحظ أيضا أن هذا البروتوكول ينطوي على استخدام شاكر الدوارة وحاضنة، وهذه الأخيرة يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب السابق. وبالإضافة إلى ذلك، جهاز للطرد المركزي التي يمكن أن تستوعب كل من 15 مل و 50 مل أنابيب مخروطية أمر لا غنى عنه لإزالة السائل المتبقي من مرشح ما بعد الترشيح وجمع الحمض النووي المستخرج داخل خرطوشة، على التوالي.
1. معالجة كاب برغي وL كيس من البلاستيك 1
ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم الترشيح هو> 4 L.
- حفر حفرة من خلال مركز المسمار جا ف ب (تعلق على التخلص منها 1 لتر كيس من البلاستيك) مع نفس القطر (4.8 مم) كما أنبوب إسقاط من الذكور موصل LUER قفل. باستخدام كماشة قطري، وتقصير أنبوب من الذكور موصل LUER قفل إلى الطول المناسب (كاليفورنيا 3 ملم) لتجنب انسداد كمية صغيرة من الماء داخل الغطاء بعد الترشيح.
- تطبيق الغراء اللاصق المتخصصة للبولي ايثيلين (PE) والبولي بروبلين (PP) إلى كل من القاع والسطح من الذكور موصل LUER القفل والمسمار كأب، على التوالي. انتظر بضع دقائق لارتباط لاصقة جيدة (راجع إرشادات الشركة المصنعة).
- إدراج موصل ذكر LUER قفل في حفرة من سقف المسمار. انتظر حتى ارتباط لاصقة كاملة من جزأين (عادة> 24 ساعة). تعقيم سقف المسمار مع الذكور موصل LUER قفل مع التبييض 10٪ التجاري (كاليفورنيا. 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم) قبل الاستخدام.
- لكمة اثنين من الثقوب على اثنين من الزوايا السفلية للكيس من البلاستيك 1 L من أجل تعلقها من MESلوحة ح (الخطوة 3). تأكد من أن قطر الثقوب أكبر من ذلك من شوكات على شبكة لوحة.
2. جمعية نظام الترشيح
- إرفاق عالية أنابيب فراغ إلى موصل إدخال مضخة الشافطة ونعلق على الطرف الآخر من الأنبوب إلى مشعب. مما لا شك فيه أن تي الصمامات الثلاثة الحمراء من مشعب هي في "وضع إيقاف التشغيل" (أي، أفقي).
- يرتدي نظيفة مجموعة من القفازات، وإدراج LUER الإناث المناسب وموصل فراغ في نهايات العلوية والسفلية من أنابيب المطاط فراغ لترشيح، على التوالي.
- بعناية إرفاق بالتركيبة الإناث المناسب لمنفذ مخرج خرطوشة الفلتر وإرفاق موصل فراغ سدادة السيليكون.
3. الترشيح من عينات المياه (≤4 L) باستخدام فلتر خرطوشة
ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم الترشيح هو> 4 L. هذا النظام الترشيح يتطلب قائمة بذاتها لوحة وأو معلقة في كيس من البلاستيك مليئة 1 لتر من الماء. ومن شأن شبكة لوحة، شوكات متعددة، وموقف لوحة، كل ما هو متاح من المخازن على الانترنت، أن تكون مفيدة لتجميع هذه الوحدة. الأوتوكلاف مدخل ومخرج قبعات LUER لخرطوشة الفلتر قبل الاستخدام.
- صب الماء عينات 1 لتر في كيس من البلاستيك وأغلق الغطاء المسمار مع الذكور موصل LUER قفل.
- بعناية توصيل مدخل الميناء من خرطوشة فلتر تجميعها مع الذكور موصل LUER قفل من كيس من البلاستيك. لا تبالغ في تشديد موصل LUER القفل. خلاف ذلك سوف تسرب الوحدة بمجرد أن يبدأ الضخ. تأكد من أن كافة الاتصالات آمنة قبل شنقا في كيس من البلاستيك من شبكة لوحة.
- بعناية شنق كيس من البلاستيك مع خرطوشة تصفية اثنين من شوكات على شبكة لوحة وإدراج سدادة سيليكون بمنفذ مدخل مشعب.
- بدوره على الشافطة. فتح تي صمامات الحمراء للترشيح. تشغيل متعددة حتى خرطوشة الفلتر جافة، ردجاجة تتحول الحمراء تي صمام إلى موقف قبالة.
- كرر 3،1-3،4 الخطوات حتى يتم تصفية المبلغ المطلوب من المياه.
ملاحظة: للحصول على 1 لتر من المياه المأخوذة من الشعاب المرجانية المدارية، ويستغرق حوالي ثلاث دقائق عن الترشيح. - بعناية إزالة خرطوشة مرشح من كيس من البلاستيك وموصل فراغ.
- تتويج طرفي خرطوشة مع مدخل ومخرج قبعات LUER.
- تسمية غطاء خرطوشة وLUER مدخل مناسب باستخدام قلم المذيبات دليل لسرعة التجفيف وغير تلطيخ وضع العلامات.
- تخزين خرطوشة مرشح في -20 مئوية قبل استخراج الحمض النووي.
4. ترشيح المياه (> 4 L) عينات باستخدام فلتر خرطوشة
ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم تنقية المياه هو ≤4 L. هذا النظام الترشيح يتطلب زجاجة كتاب 10 لتر مجهزة صمام والمتاح طرف ماصة 10 مل. قطرها الداخلي 10 مل ماصة (15.0 مم) وتفتق من طرفنهاية وينبغي أن تندرج إلى القطر الخارجي للصمام (15.0 مم) ومدخل الميناء من خرطوشة مرشح، على التوالي. يتم الاحتفاظ كلا اتصالات بشكل آمن أثناء الترشيح في نوبة الاحتكاك. تعقيم طرف ماصة مع التبييض التجارية 10٪ (حوالي 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم) قبل الاستخدام.
- إعداد كمية مناسبة من الماء العينة في زجاجة الكتاب. إدراج بإحكام 10 مل ماصة في صمام زجاجة كتاب 10 لتر.
- إدراج بإحكام ميناء منفذ للخرطوشة مرشح في نهاية طرف ماصة وإدراج سدادة السيليكون في مدخل الميناء من مشعب. بدوره على الشافطة. فتح تي صمامات الحمراء للترشيح. تشغيل متعددة حتى خرطوشة الفلتر جافة، ثم اتجه الحمراء تي صمام إلى موقف قبالة.
ملاحظة: للحصول على 10 لتر من مياه البحر التي أخذت من الشعاب المرجانية الخارجي شبه الاستوائية، ويستغرق حوالي 30-40 دقيقة للترشيح. - بعناية إزالة خرطوشة مرشح من كيس من البلاستيك وموصل فراغ. كاب على حد سواءينتهي من خرطوشة مع مدخل ومخرج قبعات LUER. تسمية غطاء خرطوشة وLUER مدخل مناسب باستخدام قلم المذيبات دليل لسرعة التجفيف وغير تلطيخ وضع العلامات. تخزين خرطوشة مرشح في -20 درجة مئوية قبل استخراج الحمض النووي.
5. استخراج إدنا من تصفية
ملاحظة: في الخطوات 4 و 5، ونحن نستخدم مجموعة تجارية، إلى حد كبير بعد بروتوكول ل "الدم الأنوية" التي تقدمها المجموعة. عن البساطة، ووصف الإجراء لمعالجة خرطوشة الفردية. في الممارسة العملية، ونحن نوصي تجهيز 8 (أو الحد الأقصى لعدد أجهزة الطرد المركزي) أو أقل المرشحات في وقت واحد.
- سخن حاضنة إلى 56 درجة مئوية.
- إعداد أنبوب 2.0 مل عن طريق خفض الحد الأقصى يتوقف من الأنبوب. تجاهل الغطاء.
ملاحظة: يستخدم هذا الأنبوب كما أنبوب لجمع السائل المتبقي في التصفية. - إزالة مدخل (لا مخرج) غطاء LUER من خرطوشة الفلتر وإدراج ط مدخل الميناءn لأنبوب جمع. بإحكام اغلاق اتصال بين أنبوب خرطوشة وجمع باستخدام فيلم الختم الذاتي.
- إدراج وحدة دمجها في محول الطرد المركزي لأنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي خرطوشة في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة السائل المتبقي في التصفية.
- إزالة أنبوب جمع من خرطوشة الفلتر والتخلص من الأنبوب. إعادة سقف مدخل الميناء من الخرطوشة.
- تحضير خليط من 20 ميكرولتر حل بروتين-K، 220 ميكرولتر PBS (الفوسفات مخزنة المالحة، لم تقدم من قبل عدة) و 200 العازلة ميكرولتر AL.
ملاحظة: خرطوشة مرشح تستوعب ما يصل إلى أربعة أضعاف حجم الخليط (. كاليفورنيا 1.8 مل). - إزالة الغطاء مدخل وإضافة الخليط (440 ميكرولتر) في خرطوشة تصفية باستخدام طرف ماصة. إدراج ماصة تماما في مدخل الميناء بحيث غيض ماصة مرئيا داخل خرطوشة فقط فوق الغشاء.
- إعادة سقف مدخل الميناء ووضع السيارة فلترtridge على شاكر دوارة.
- ضع شاكر دوارة في الحاضنة محمى على حرارة 56 مئوية، وتشغيل شاكر بسرعة 20 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
- أثناء الحضانة، وإعداد أنبوب 2.0 مل جديد، تسمية أنبوب بشكل مناسب باستخدام قلم المذيبات واقية ووضعه في أنبوب مخروطي 50 مل.
ملاحظة: السابقة (2.0 مل)، وأنابيب الأخيرة (50 مل) وتستخدم لجمع الحمض النووي المستخرج ولعقد أنبوب 2.0 مل، على التوالي. - بعد الحضانة، وإزالة الغطاء مدخل وإدراج مدخل (لا مخرج) ميناء خرطوشة في أنبوب 2.0 مل في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إغلاق أنبوب مخروطي 50 مل مع غطاء المسمار.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 50 مل في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع الحمض النووي المستخرج من الخرطوشة. إزالة خرطوشة الفلتر وأنبوب 2.0 مل باستخدام ملقط معقم وغطاء الأنبوب. تجاهل خرطوشة الفلتر.
6. تنقية المستخلصة الحمض النووي
ملاحظة: نحن أزل إدنا مع 100 العازلة ميكرولتر AE بدلا من 200 ميكرولتر المحددة في دليل من عدة التجارية.
- إضافة 200 ميكرولتر الإيثانول (96-100٪) إلى الحمض النووي المستخرج في أنبوب 2.0 مل من الخطوة أعلاه (حوالي 440 ميكرولتر)، وتخلط جيدا من قبل vortexing.
- الماصة الخليط في عمود الدوران وضعت في أنبوب جمع 2 مل. أجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع.
- ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، إضافة 500 ميكرولتر عازلة AW1، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 5000 ز س. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع.
- ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، إضافة AW2 العازلة 500 ميكرولتر، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 20000 ز س. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع.
- إعداد أنبوب 1.5 مل جديد (لم تقدم من قبل عدة) وتسمية أنبوب بشكل مناسب باستخدام قلم ماء لسرعة التجفيف وغير تلطيخ وضع العلامات. نقل ر عمود الدورانس أنبوب 1.5 مل.
- أزل الحمض النووي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر عازلة AE إلى مركز للغشاء عمود الدوران. احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل عمود الدوران وغطاء الأنبوب. تخزين الحمض النووي تنقيته في -20 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فمن الصعب من الناحية الفنية لعزل وتحديد إدنا الأسماك فقط من إدنا الأكبر المستخرج، لأن الاشعال MiFish coamplify المنطقة المستهدفة من بعض الفقاريات غير السمكية، مثل الطيور والثدييات، مع منتجات PCR من نفس الحجم (كاليفورنيا 170 شركة بريتيش بتروليوم ) 12. بدلا من قياس السمك إدنا، ونحن أداء MiFish metabarcoding تحليل إدنا من خزان ماء مع تكوين الأنواع المعروفة باستخدام طريقتين مختلفة من الترشيح واستخراج الحمض النووي، ومقارنة أعداد من أنواع الكشف في مكتبة من البروتوكولين. وقد تم تصميم هذه تجربة بسيطة لإظهار جدوى هذا البروتوكول باسم "نتائج ممثل" وليس لإثبات بدقة تفوقها على الآخرين.
ونحن عينات ما مجموعه 30 لتر من مياه البحر من دبابة في Kuroshio في أوكيناوا Churaumi حوض السمك، أوكيناوا، اليابان (26˚41'39 "N،127˚52'41 "E). تم تصميم دبابة في Kuroshio لاظهار الحيوانات الضخمة البحرية، مع أبعاد (الطول × العرض × العمق) 35 م × 27 م × 10 م وبلغ حجم التداول الإجمالي للمياه من 7500 م 3. ويضم ما يقرب من 60 كبير -sized أنواع الأسماك البحرية المميزة إلى المناطق المحيطة في Kuroshio، واحدة من التيارات الحدودية الغربية تتدفق الشمال الشرقى على طول اليابان. وفي دراسة MiFish metabarcoding السابقة، ميا وآخرون. 12 الكشف عن 61 من الأنواع 63 (97٪) يرد في خزان من خمس عينات مياه البحر 2 لتر.
لتنقية مياه البحر، وكنا خراطيش تصفية (حجم المسام = 0.45 ميكرون)، والألياف الزجاجية مرشحات القرص (حجم المسام = 0.70 ميكرون). نحن تصفيتها في وقت واحد في مياه البحر على نفس متعددة باستخدام بروتوكولات اثنين لمدة أربعة مجلدات المياه (1، 2، 3، و 4 L، مجموعه ثماني مرشحات). بعد تنقية مياه البحر، ونحن تصفيتها أيضا 1 لتر من الماء PCR الصف مع المرشحات اثنين (وخرطوشة إلتر وفلتر الألياف الزجاجية) كما الضوابط السلبية (اثنان مرشح الفراغات). من هذه الأنواع من المرشحات، واستخرجنا إدنا باستخدام البروتوكولات الجديدة والمستعملة سابقا 12، وكلاهما توظيف نفس المجموعة التجارية. وتعرض ما مجموعه 10 عينات ادنا (بما في ذلك اثنين من ضوابط السلبية) إلى MiFish تحليل metabarcoding كما هو موضح في ميا وآخرون. 12
لفترة وجيزة، أجرينا جولة 1ST PCR لتضخيم المنطقة المستهدفة (12S الميتوكوندريا الريباسي الجينات؛ كاليفورنيا 170 بي بي) وإلحاق محولات لتسلسل إقران نهاية. لمدة ثماني عينات ادنا (باستثناء ضوابط السلبية اثنين)، أجرينا 10 PCR يعيد لرؤية الاختلافات في عدد من الأنواع المكتشفة داخل كل عينة (مجموع 80 تقارير إنجاز المشروعات). أضفنا أيضا مرشح والفراغات PCR إلى كل ثماني عينات ادنا (ما مجموعه 16 تقارير إنجاز المشروعات). في المجموع، وحصلنا على 96 المنتجات PCR من 1ST الجولة PCR وكانت تستخدم قوالب ل-2nd جولة PCR للفهرسة المزدوجة وإلحاق محولات إضافية لإعداد مكتبة التالية ميا وآخرون. 12
تسلسل إقران نهاية (2 × 150 بي بي) من مكتبات 96 أسفرت 4127546 يقرأ، بمتوسط 42995 يقرأ في مكتبة (40539 يقرأ في خرطوشة تصفية و43121 يقرأ في فلتر الألياف الزجاجية). بعد demultiplexing ولاحق قبل معالجة البيانات الخام، 1068266 يقرأ تم الاحتفاظ بها لعمليات التفتيش BLAST لتخصيص التصنيفية. هذه قراءة، 830788 تم تحديد يقرأ مثل تلك الأنواع الواردة في خزان في Kuroshio (الجدول 1). اكتشفنا 60 نوعا دبابات من 830788 يقرأ ومتوسط عدد الأنواع الكشف عن 10 PCR نسخ متماثلة من العينات إدنا ثمانية تراوحت بين 29 ل1 L (فلتر الألياف الزجاجية) إلى 55 لمدة 4 L (فلتر خرطوشة) (الجدول 1) . وكانت أرقام قراءة في الفراغات اثنين من العينات إدنا ثمانية طفيفة، تتراوح من 012 لأنواع الدبابات.
وجدنا أن عدد الأنواع الكشف عنها من قبل خرطوشة الفلتر كان أعلى بكثير من تلك التي للمرشحات من الألياف الزجاجية (ANCOVA، F = 381.8، P <0.001، الشكل 1) في كميات مياه البحر 1-4 L. وكان عدد من أنواع الكشف عنها من قبل خرطوشة الفلتر أعلى ما يقرب من 1.5 مرة من تلك التي تستخدم مرشحات الألياف الزجاجية وفي كلتا الطريقتين، وعدد من أنواع الكشف عن زيادة مع حجم المياه التي تمت تصفيتها (ANCOVA، F = 164.2، P <0.001).
قد يؤدي ارتفاع أعداد الأنواع الكشف عنها بواسطة فلتر خرطوشة من واحد أو أكثر من الخطوات التالية في سير العمل التجريبية: ترشيح المياه عينات من خلال (1) مواد مختلفة (PVDF ماء [polyvinylidine difluoride] مقابل ستوكات الزجاج) و / أو (2) مختلفة الأحجام المسام الاسمية (0.4581، مقابل 0.70 ميكرون م) في خراطيش تصفية والمرشحات من الألياف الزجاجية يمكن أن تحتفظ أكثر إدنا من الأسماك على مرشح السابق. (3) استخدام شاكر دوارة في الحاضنة مسخن ينتج المزيد من العائد الحمض النووي من خراطيش تصفية من من مرشحات الألياف الزجاجية مطوية في عمود الدوران وضعت على كتلة الحرارة بلا حراك. (4) جمع الحمض النووي المستخرج بواسطة الطرد المركزي من خرطوشة الفلتر أكثر فعالية من ذلك من مرشح من الألياف الزجاجية بسبب مواد التصفية مختلفة و / أو أساليب الطرد المركزي مختلفة. على ما يبدو، لا بد من دراسة تصميم أكثر صرامة لتحديد العوامل المسؤولة عن ارتفاع عدد باستمرار من أنواع الكشف عنها بواسطة خرطوشة مرشح في هذه الدراسة.
الشكل 1: عدد الكشف عن الأنواع دبر ضد أحجام التداول المصفاة المياه في MiFish Metabarcoding آنا يقتصر تحلل من إدنا من في Kuroshio دبابات، أوكيناوا Churaumi حوض السمك، ويبلغ عدد الأنواع الكشف على الأنواع الواردة في الخزان. من 30 لتر من مياه البحر، ونحن تصفيتها 1، 2، 3، و 4 عينات لتر باستخدام خراطيش تصفية و مرشحات الألياف الزجاجية واستخراج إدنا من هذه الفلاتر باستخدام البروتوكولات الحالية والتي سبق وصفها 12، على التوالي. وأجرى الباحثون تحليلا metabarcoding MiFish (كشف في وقت واحد من أنواع متعددة) لمدة 10 PCR يعيد من كميات المياه أربعة باستخدام اثنين من البروتوكولات. شريط أفقي في مربع يمثل المتوسط. الحواف العلوية والسفلية مربع من تقابل بين الشرائح الربعية، وأشرطة عمودية تتوافق مع 1.5 × الربعية، والنقاط تمثل القيم المتطرفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
/files/ftp_upload/54741/54741tbl1.jpg "/>
الجدول 1:.. التركيب تصنيفية ومقروءة الأرقام من 60 أنواع الكشف في تحليلات MiSeq العينات إدنا من في Kuroshio دبابات وتظهر تلك الأنواع الواردة في الخزان مع تسلسل المرجعية في قاعدة بيانات مخصصة فقط الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذه الطاولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في العديد من الدراسات metabarcoding باستخدام العينات البيئية مثل المياه والتربة، والعلاج في مرحلة ما بعد الترشيح من خرطوشة الفلتر بشكل عام على النحو التالي 24،25: 1) قطع مفتوحة أو تكسير السكن مع الأدوات اليدوية (قطع الأنابيب أو كماشة)؛ 2) إزالة عامل التصفية من خرطوشة. و3) قطع مرشح الى قطع صغيرة بشفرة حلاقة لاستخراج الحمض النووي. لتجنب مثل هذه عدة طرق استخراج الحمض النووي مرهقة والإجراءات التي تكون عرضة للتلوث في المختبر تستغرق وقتا طويلا، حاولنا داخل السكن من خرطوشة الفلتر باستخدام المستخدمة على نطاق واسع، مجموعة تجارية رخيصة، ونجحت في تطوير هذا البروتوكول مع مواتية النتائج من إدنا تحليل metabarcoding (الشكل 1).
واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو استخدام شاكر دوارة في حاضنة مسخن، وهذا هو قادرة على توفير العائد الحمض النووي جيد للprepar مكتبة لاحقأوجه في التحليل metabarcoding إدنا. التحريك المستمر من الحل بروتين-K داخل السكن في درجة الحرارة المثلى ربما يسهل استخراج الحمض النووي من الجسيمات المحاصرين في التصفية. نلاحظ، مع ذلك، أن هذا البروتوكول ينطوي على استخدام كل من شاكر الدوارة وحاضنة، وهذه الأخيرة يجب أن تكون قادرة على استيعاب السابق. وبالإضافة إلى ذلك، جهاز للطرد المركزي التي يمكن أن تستوعب كل من 15 مل و 50 مل أنابيب مخروطية لا غنى عنه لإزالة السائل المتبقي من مرشح ما بعد الترشيح وجمع الحمض النووي المستخرج داخل خرطوشة، على التوالي.
هناك خيار آخر لتحقيق هذا استخراج الحمض النووي من دون الحاجة إلى قطع فتح خرطوشة (انظر جدول المواد / الكواشف). عدة لا يستخدم أي الانزيمات لاستخراج الحمض النووي. بدلا من ذلك، فإنه يستخدم العازلة تحلل خاص في تركيبة مع تحلل ميكانيكية إضافية مع الضرب حبة. في التجارب الأولية على أساس مياه البحر الطبيعي من المحيط الهادئ الساحلي المعتدل، نحن المحاولهقلع تيد الحمض النووي باستخدام هذه المجموعة جنبا إلى جنب مع نموذج من هذا البروتوكول استخدام عدة التجارية. مع استخدام بروتوكول النموذج الأخير، أدركنا باستمرار منتجات التضخيم متميزة في الكهربائي للهلام ل1ST الجولة PCR. في المقابل، لم نتمكن من الحصول على أي من المنتجات PCR من خلال استخدام مجموعة مختلفة (انظر المواد / الكواشف الجدول) على الرغم التالية بروتوكولين البديلة المقدمة من قبل الشركة المصنعة. وبالنظر إلى أن تدرج PCR خطوات إزالة المانع في البروتوكولين من مجموعة الثانية (انظر المواد / الكواشف الجدول)، وتشير هذه الملاحظة عدم وجود كميات كافية من الحمض النووي في القالب. وذكرت هذه العوائد الحمض النووي منخفضة نسبيا من العينات البيئية باستخدام مجموعة الثانية في الدراسات الحديثة 26،27.
في هذا البروتوكول، الذي اخترناه خرطوشة الفلتر مع كبير حجم المسام الاسمي (0.45 ميكرون)، في حين أن الدراسات الميكروبية المائية conventionaLLY استخدام واحد أصغر (0.22 ميكرون) بعد prefiltration من خلال أكبر المرشحات حجم المسام (1-3 ميكرون) 28. أسباب اختياره لدينا هي بسيطة ومباشرة، ولا تستند على الحجج النظرية: 1) حجم المسام هو أقرب بكثير إلى أن من المرشحات من الألياف الزجاجية (0.70 ميكرون) ونحن قد استخدمت تقليديا في إدنا سابقة يدرس 12،14، 22،23. 2) أنه من المتوقع أن تسمح كميات أكبر من الماء لتتم تصفيته من أصغر واحد. الميزة الأخيرة هي ذات أهمية خاصة للمشاريع البحثية الحالية لدينا تمر في النظم الإيكولوجية في المحيطات المفتوحة وأعماق البحار مع وفرة الأسماك النادرة والكتلة الحيوية. في الواقع، أكدنا الترشيح الناجح لأخذ عينات بشكل مستقل 10-L من مياه البحر من خزان في Kuroshio مع عدم وجود انسداد ملحوظ (النتائج غير معروضة). في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، أظهرت تيرنر وآخرون. 29 أن 0.2 ميكرون الترشيح القبض على تعظيم الكارب ادنا (85٪ ± 6٪)، في حين التقليل الكلي (أي غير المستهدفة) إدناالقبض على (48٪ ± 3٪)، ولكن مرشح انسداد يقتصر هذا حجم المسام لحجم العينة أقل من 250 مل. هناك حاجة لدراسات إضافية لتحديد مرشح المسام حجم حجم والمياه الترشيح الأمثل للخرطوشة فلتر لإدنا metabarcoding في مختلف أنواع البيئات المائية مع مستويات مختلفة من وفرة الأسماك والكتلة الحيوية.
واحد من أوجه القصور في هذا البروتوكول هو أن ترشيح المياه يجب أن يتم تنفيذ في المختبر حيث يتوفر التيار الكهربائي. بسبب الاستقرار الكيميائي محدود من الحمض النووي، إدنا يبدأ في التدهور بمجرد إلقاء أنه من كائن حي ويمكن كشفها إلا لفترة قصيرة من الزمن في البيئات المائية (ساعات إلى أيام) 30. لذلك فهي مثالية لتصفية عينة الماء مباشرة بعد جمع لتجنب تدهور كبير في إدنا. وفي هذا الصدد، فإن التطورات في أساليب الترشيح على الموقع باستخدام خرطوشة مرشح أن يكون الخطوة التالية واعدة. قابلية وsterilitذ من خرطوشة الفلتر يمكن تطوير أساليب الترشيح في الموقع، والذي سيوفر إدنا أكثر سليمة التي يمكن أن تعكس تركيبة الأنواع من المجتمع الأسماك أكثر دقة في إدنا metabarcoding. وادنا التي تم جمعها على خراطيش تصفية قد استقرت قبل حقن كاشف التجاري 31 (انظر المواد / الكواشف الجدول) أو Longmire العازلة 32 في خرطوشة قبل إعادته مرة أخرى إلى المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
