Introduction
Miljømæssige DNA (eDNA) i vandigt miljø refererer til genetisk materiale, der findes i vandsøjlen. Nylige undersøgelser viste nytten af eDNA til påvisning fisk fra forskellige vandmiljøer, herunder damme 1-3, floder 4-8, vandløb 9, og havvand 10-14. De fleste af disse undersøgelser fokuseret på påvisning af en enkelt eller nogle få invasiv 1,4-6,8,14 og sjældne eller truede arter 3,9, mens nogle nylige undersøgelser forsøgt samtidig påvisning af flere arter i lokale fisk samfund 7,9, 12,13,15 og mesocosmos 11,12.
Sidstnævnte fremgangsmåde kaldes "metabarcoding" og eDNA metabarcoding anvender en eller flere sæt af PCR-primere til coamplify en genregion tværs taksonomisk forskellige prøver. Dette efterfølges af biblioteket forberedelse med indeksering og adapter Desuden, og de indekserede biblioteker analyseres ved en high-throughput parallel sekventeringperron. For nylig Miya et al. 12 udviklede universelle PCR primere til metabarcoding eDNA fra fisk (kaldet "MiFish"). De MiFish primere målretter en hypervariabel region af mitokondrie 12S rRNA-genet (163 til 185 bp), der indeholder tilstrækkelige oplysninger til at identificere fisk at taksonomiske familie, slægt og art undtagen nogle nært beslægtede congenere. Med brugen af disse primere i eDNA metabarcoding, Miya et al. 12 fundet mere end 230 subtropiske marine arter fra akvarium tanke med kendte arter sammensætning og koralrev nær akvariet.
Mens optimere metabarcoding protokollen til at rumme naturlig havvand med varierende niveauer af eDNA koncentration fra fisk, har vi bemærket, at MiFish primere lejlighedsvis undladt at forstærke målområdet til efterfølgende bibliotek forberedelse. En af de mere sandsynlige årsager til denne mislykket PCR-amplifikation er manglen på tilstrækkelige mængder af template DNA indeholdt i små mængder vand filtreret (dvs. 1-2 L). Selvom eDNA koncentration fra en bestemt taksonomiske gruppe er ukendte før forstærkning, filtrering af store vandmængder (> 1-2 L) ville være en enkel og effektiv metode til at indsamle mere eDNA fra vandmiljøer med knappe fisk overflod og biomasse, såsom open-havet og dybhavsøkosystemer.
I forhold til disk fiberfiltre konventionelt anvendes i en række fisk eDNA forskning 16, filterpatroner har den fordel at rumme større vandmængder før tilstopning 17. Faktisk viste en nylig undersøgelse stort volumen (> 20 L) filtrering af havvand prøver kystnære bruger filterpatroner 18. Endvidere er de individuelt pakket og sterilt, og kan udføres flere trin af den eksperimentelle arbejdsgang i filterhuset, hvilket således reducerer sandsynligheden for forurening fra laboratoriet 19. Det sidstefunktion er afgørende for eDNA metabarcoding, hvor risikoen for forurening er fortsat blandt de største eksperimentelle udfordringer 20,21. Trods disse tekniske fordele ved filterpatroner, har det ikke været anvendt i eDNA studier af fisk med to undtagelser 8,15.
Her giver vi en protokol til filtrering af vandprøver med filterpatronen og udvinding af eDNA fra dens filter uden at skulle skære åbne kabinettet. Vi tilbyder også to alternative vand filtrering systemer afhængigt af vandmængder (≤4 L eller> 4 L). For at sammenligne effektiviteten af den nyligt udviklede protokol og en tidligere brugt protokol ved hjælp af et glas-fiber filter i vores forskningsgruppe 12,14,22,23, vi udfører eDNA metabarcoding analyse af havvand fra en enorm akvarium tank (7500 m 3 ) med sammensætning kendt art, og viser antallet af fundne arter stammer fra de to protokoller som repræsentative resultater. Denne protokol hsom er udviklet til metabarcoding eDNA fra fisk, men kan også anvendes til eDNA fra andre organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol beskæftiger sig ikke med vand prøveudtagning og metabarcoding metoder. Vand kan der udtages prøver på forskellige måder afhængig af studieformål 16 og se Miya et al. 12 for detaljer om metabarcoding metoder ved hjælp MiFish primere. Bemærk, at det samplede vand bør holdes meget koldt og filtreret inden for et par timer til at undgå nedbrydning af eDNA. Bemærk også, at denne protokol omfatter anvendelse af et roterende rysteapparat og en inkubator, og sidstnævnte skal være stor nok til at rumme det førstnævnte. Desuden er en centrifuge, der kan rumme både 15 ml og 50 ml koniske rør er nødvendig for at fjerne den resterende væske fra post-filtrering filter og indsamle ekstraherede DNA inden i patronen, henholdsvis.
1. Behandling af et skruelåg og en 1 L Plastic Bag
BEMÆRK: Spring dette trin, hvis filtrering volumen er> 4 L.
- Bor et hul gennem centrum af en skrue cap (knyttet til en engangs 1 L plastpose) med samme diameter (4,8 mm) som røret rager ud fra en han-luer-lock connector. Brug af diagonal tænger afkorte røret af Luer-lock konnektor til en passende længde (ca. 3 mm) for at undgå tilstopning af en lille mængde vand inde i hætten efter filtrering.
- Påfør en selvklæbende lim specialiseret for polyethylen (PE) og polypropylen (PP) til både bunden og overfladen af han-luer-lock konnektor og skruelåg hhv. Vent et par minutter for god limning (se producentens anvisninger).
- Sæt Luer-lock konnektor ind i hullet af skruelåg. Vent, indtil fuldstændig klæbning af de to dele (sædvanligvis> 24 h). Sterilisere skruelåget med Luer-lock konnektor med 10% kommerciel blegemiddel (ca. 0,6% natriumhypochlorit) før anvendelse.
- Punch to huller ved de to nederste hjørner af 1 L plastpose for at hænge det fra en mesh panel (trin 3). Sikre, at diameteren af hullerne er større end af krogene på panel.
2. Montering af Filtration System
- Vedhæft højt vakuum slange til indgangen stikket på en aspirator pumpe og vedhæfte den anden ende af slangen til en manifold. Vær sikker på, at de tre røde t-ventiler af manifold er i "off position" (dvs. vandret).
- Iført en ren sæt handsker, indsætte en hunluerfitting og et vakuum stik i den øverste og nederste ender af vakuum gummislanger til filtrering hhv.
- vedhæfte forsigtigt Luer fitting til en stikkontakt port filterpatronen og vedhæft vakuum stik til en silikone prop.
3. Filtrering af vandprøver (≤4 L) ved hjælp af filterpatron
BEMÆRK: Spring dette trin, hvis filtrering volumen er> 4 L. filtrering system kræver et selvstændigt panel feller hængende plastposen fyldt med 1 l vand. En mesh panel, flere tænder, og et stativ til panelet, alle tilgængelige fra online butikker, ville være nyttigt for at samle denne enhed. Autoklaver indgang og udgang luer hætter for filterpatronen før brug.
- Hæld 1 L samplet vand ind i plastposen, og luk skruelåg med Luer-lock connector.
- Slut forsigtigt en indgangsport af den samlede filterpatronen med den mandlige luer-lock-stikket på plastposen. Må ikke over-stramme luer-lock stik; ellers vil enheden lække, når pumpningen startes. Sørg for, at alle forbindelser er sikre, før hænger plastposen fra et panel.
- hænge forsigtigt plasticposen med filterpatronen fra to stikben på panel og sæt en silicone prop i en indgangsport af manifolden.
- Tænd emhætte. Åbn røde t-ventiler til filtrering. Kør manifolden indtil filterpatronen er tør, thøne dreje den røde t-ventil til den slukkede position.
- Gentag 3.1-3.4 trin, indtil den ønskede mængde vand filtreres.
BEMÆRK: For en liter vand taget fra subtropiske koralrev, det tager omkring tre minutter til filtrering. - Fjern forsigtigt filterindsatsen ud af plastikposen og vakuum stik.
- Cap begge ender af patronen med indløbs- og ud- luer hætter.
- Mærk patronen og indløbet luerhætte passende anvendelse af et opløsningsmiddel-bevis pen til hurtig tørring og ikke-udtværing mærkning.
- Opbevar filterpatronen ved -20 ° C før DNA-ekstraktion.
4. Filtrering af vand (> 4 L) Prøver hjælp af filterpatron
Bemærk: Spring dette trin over, hvis vandet filtrering volumen er ≤4 L. filtrering system kræver et 10 L bog flaske forsynet med en ventil og en engangs 10 ml pipettespids. En indre diameter af 10 ml pipettespids (15,0 mm) og en tilspidsning på spidsenende skal passe til en ydre diameter af ventilen (15,0 mm) og indgangsport af filterpatronen hhv. Begge forbindelser bevares forsvarligt under filtrering i en friktion pasform. Sterilisere pipettespidsen med 10% kommerciel blegemiddel (ca. 0,6% natriumhypochlorit) før anvendelse.
- Forbered en passende mængde samplet vand i bogen flasken. Tæt indsætte 10 ml pipettespids ind i ventilen 10 L bog flaske.
- Tæt indsætte udløbsporten af filterpatronen i pipettespidsen ende og sæt silikone stopperen i indgangsporten af manifolden. Tænd emhætte. Åbn røde t-ventiler til filtrering. Kør manifolden indtil filterpatronen er tør, og tænd den røde t-ventil til den slukkede position.
BEMÆRK: For 10 liter havvand taget fra subtropiske ydre koralrev, det tager omkring 30-40 min til filtrering. - Fjern forsigtigt filterindsatsen ud af plastikposen og vakuum stik. Cap bådeender af patronen med indløbs- og ud- luer hætter. Mærk patronen og indløbet luerhætte passende anvendelse af et opløsningsmiddel-bevis pen til hurtig tørring og ikke-udtværing mærkning. Opbevar filterpatronen ved -20 ° C før DNA-ekstraktion.
5. Udvinding af eDNA fra Filter
BEMÆRK: I trin 4 og 5, bruger vi et kommercielt kit, stort set efter en protokol for "kerneho blod", som kittet. For enkelhed, vi beskrive proceduren for behandling af en individuel patron. I praksis anbefales det forarbejdning 8 (eller det maksimale antal af centrifugen) eller færre filtre ad gangen.
- Forvarm en inkubator til 56 ° C.
- Der fremstilles en 2,0 ml rør ved at skære det hængslede låg fra røret. Kassér hætten.
BEMÆRK: Dette rør bruges som en samling rør til den resterende væske i filteret. - Fjern indløb (IKKE udløb) luer cap fra filterpatronen og indsæt indgangsporten into opsamlingsrøret. Tæt tætne en forbindelse mellem patronen og opsamlingsrøret via individuelle forseglingsfilm.
- Sæt den kombinerede enhed i en centrifuge adapter til en 15 ml konisk rør. Centrifugeres patronen ved 5000 x g i 1 min for at fjerne den resterende væske i filteret.
- Fjern opsamlingsrøret fra filterpatronen og kassér røret. Re-cap indløbsporten af patronen.
- Klargør en blanding af 20 pi proteinase-K løsning, 220 pi PBS (phosphatpufret saltvand, ikke tilvejebragt af kittet) og 200 pi buffer AL.
BEMÆRK: filterpatron kan rumme op til fire gange de mængder af blandingen (. Ca 1,8 ml). - Fjern indløbet hætten og tilsæt blandingen (440 pi) ind i filterpatronen anvendelse af en pipettespids. Sæt pipetten helt ind i indløbsåbningen, således at pipettespidsen er synlig inde i patronen lige over membranen.
- Re-cap indgangsporten og placer filteret bilTridge på et roterende rysteapparat.
- Placer roterende rysteapparat i forvarmes inkubator ved 56 C og tænde for rysteapparat ved en hastighed på 20 rpm i 20 min.
- Under inkubationen udarbejde en ny 2,0 ml rør, mærke røret hensigtsmæssigt med et opløsningsmiddel-bevis pen og læg den i en 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: De tidligere (2,0 ml) og sidstnævnte rør (50 ml) anvendes til opsamling af det ekstraherede DNA og til at holde 2,0 ml rør, hhv. - Efter inkubationen fjernes indløb hætte og sæt indløb (IKKE udløb) port patronen i 2,0 ml rør i 50 ml konisk rør. Luk 50 ml konisk rør med skruelåg.
- Centrifugeres 50 ml konisk rør ved 5000 x g i 1 min for at indsamle det ekstraherede DNA fra patronen. Fjern filterpatronen og 2,0 ml rør ved hjælp steriliseret pincet og cap røret. Kassér filterpatronen.
6. Oprensning af ekstraheret DNA
BEMÆRK: Vi elueres eDNA med 100 pi buffer AE i stedet for 200 pi er beskrevet i håndbogen af den kommercielle kit.
- Tilføj 200 pi ethanol (96-100%) til ekstraherede DNA i 2,0 ml rør fra ovenstående trin (ca. 440 pi), og bland grundigt ved hvirvelblanding.
- Pipetter blandingen i en centrifugesøjle anbragt i et 2 ml opsamlingsrør. Centrifuger ved 5.000 x g i 1 min. Kassér gennemløbet og opsamlingsrøret.
- Placer spinkolonne i et nyt 2 ml opsamlingsrør, tilsættes 500 pi buffer AW1, og centrifugeres i 1 min ved 5000 x g. Kassér gennemløbet og opsamlingsrøret.
- Placer spinkolonne i et nyt 2 ml opsamlingsrør, tilsættes 500 pi buffer AW2, og centrifugeres i 3 minutter ved 20.000 x g. Kassér gennemløbet og opsamlingsrøret.
- Forbered en ny 1,5 ml rør (ikke tilvejebragt af kittet) og mærke røret hensigtsmæssigt at bruge en vandtæt pen til hurtig tørring og ikke-udtværing mærkning. Overfør spin kolonne to 1,5 ml rør.
- Eluering af DNA ved tilsætning af 100 pi buffer AE til midten af spin kolonne membran. Der inkuberes i 1 minut ved stuetemperatur, og derefter centrifugeres ved 6.000 x g i 1 min.
- Kassér spinkolonne og hætten røret. Opbevar oprenset DNA ved -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er teknisk vanskeligt at isolere og kvantificere kun fisk eDNA fra den udpakkede hovedparten eDNA, fordi MiFish primere coamplify målområdet fra nogle ikke-fisk hvirveldyr, såsom fugle og pattedyr, med PCR-produkter af samme størrelse (ca. 170 bp ) 12. I stedet for at kvantificere fisk eDNA, vi udfører MiFish metabarcoding analyse af eDNA fra et akvarium tank med kendt sammensætning arter ved hjælp af de to forskellige metoder til filtrering og dna-ekstraktion, og sammenligne antallet af fundne arter pr biblioteket fra de to protokoller. Denne enkle eksperiment var designet til at vise mulighederne for den nuværende protokol som "repræsentative resultater" og ikke til strengt vise sin overlegenhed over andre.
Vi prøver i alt 30 liter havvand fra en Kuroshio tank i Okinawa Churaumi Aquarium, Okinawa, Japan (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). Den Kuroshio tanken er beregnet til at udstille marine megafauna, med dimensioner (L x B x D) på 35 mx 27 mx 10 m og en samlet volumen på 7.500 m3 vand. Det huser cirka 60 store Let læseligt marine fiskearter karakteristiske for områder omkring Kuroshio, en af den vestlige grænse strømme, der løber nordøst, langs hele længden af Japan. i en tidligere MiFish metabarcoding undersøgelse, Miya et al. 12. opdaget 61 af de 63 arter (97%) indeholdt i tanken fra fem 2 L havvand prøver.
Til filtrering af havvandet, vi brugte filterpatroner (porestørrelse = 0,45 um) og glasfiber diskfiltre (porestørrelse = 0,70 um). Vi samtidigt filtreret havvand på samme manifold ved hjælp af de to protokoller i fire vandindhold (1, 2, 3, og 4 l; alt, otte filtre). Efter filtrering af havvand, vi også filtreret 1 I PCR-grade vand med de to filtre (filter patron og glasfiber filter) som de negative kontroller (to filter blanks). Fra disse typer af filtre, vi udvundet eDNA ved hjælp af de nye og tidligere anvendte protokoller 12, som begge benytter den samme kommercielle kit. I alt 10 EDNA prøver (herunder de to negative kontroller) blev underkastet MiFish metabarcoding analyse som beskrevet i Miya et al. 12
Kort fortalt, udførte vi 1st-runde PCR for at amplificere målområdet (mitokondrielle 12S rRNA-genet;. Ca 170 bp), og tilføje adaptorer for parrede ende sekventering. For otte Edna prøver (med undtagelse af to negative kontroller), gennemførte vi 10 PCR replikerer at se variationer i antallet af fundne arter inden for hver prøve (i alt 80 PCR'er). Vi tilføjede også filteret og PCR blanks til hver otte Edna prøver (i alt 16 PCR'er). I alt opnåede vi 96 PCR-produkter fra den 1.-runde PCR og de blev brugt som skabeloner til 2. runde PCR for dual indeksering og tilføje ekstra adaptere til biblioteket forberedelse følgende Miya et al. 12
Den parrede ende sekventering (2 x 150 bp) af de 96 biblioteker gav 4.127.546 læser, med et gennemsnit på 42.995 læser pr biblioteket (40.539 læser i filterpatronen og 43.121 læser i glasfiberfiltrerpapir). Efter demultiplexing og efterfølgende forbehandling af de rå data, lyder 1.068.266 blev godkendt til de BLAST søger efter taksonomiske opgave. Af disse læser, 830.788 læsninger blev identificeret som de arter, der er indeholdt i Kuroshio tanken (tabel 1). Vi har registreret 60 tank-arter fra 830.788 læser og det gennemsnitlige antal af fundne arter til 10 PCR replikater fra de otte Edna prøverne lå fra 29 til 1 L (glasfiber filter) til 55 for 4 L (filter patron) (tabel 1) . Læs numrene på de to emner fra de otte Edna prøverne var mindre, lige fra 0til 12 til tankens arter.
Vi fandt, at antallet af fundne arter af filterpatronen var betydeligt højere end de af glasfiberfiltre (ANCOVA, F = 381,8, P <0,001, figur 1) på tværs af 1-4 L havvand mængder. Antal fundne arter af filterpatronen var ca. 1,5 gange højere end dem, der bruger filtrene for glasfiber og i begge metoder, at antallet af fundne arter steg med den mængde vand, filtreret (ANCOVA, F = 164,2, P <0,001).
Højere antal fundne arter af filterpatronen kan skyldes en eller flere af de følgende trin i de eksperimentelle arbejdsgange: filtrering af samplede vand gennem (1) forskellige materialer (hydrofilt PVDF [polyvinylidine difluorid] vs. glas mikrofiber) og / eller (2) forskellige nominelle porestørrelser (0,4581 m vs. 0,70 um) i filterpatroner og glasfiberfiltre kunne beholde mere eDNA fra fisk på den tidligere filter; (3) anvendelse af en rotationsryster i forvarmes inkubator producerer mere DNA udbytte fra filterpatronerne end fra de foldede glasfiberfiltre i en centrifugesøjle anbragt på en ubevægelig varmeblok; (4) opsamling af den ekstraherede DNA ved centrifugering fra filterpatronen er mere effektiv end den fra glasfiberfilter grund af de forskellige filtermaterialer og / eller forskellige centrifugeringstrin metoder. Tilsyneladende er en mere stringent designet undersøgelse kræves for at lokalisere de faktorer, der er ansvarlige for det konsekvent højere antallet af registrerede arter ved filterpatronen i nærværende undersøgelse.
Figur 1: Antal Detected Arter afbildes mod Filtreret vandmængder i MiFish Metabarcoding Ana lyse af eDNA fra Kuroshio Tank, Okinawa Churaumi Aquarium. Antallet af fundne arter er begrænset til de arter, der er indeholdt i tanken. Fra 30 liter havvand, vi filtreret 1, 2, 3, og 4 L prøver ved hjælp af filterpatroner og glasfiberfiltre og ekstraheret eDNA fra disse filtre under anvendelse af de nuværende og tidligere beskrevne protokoller 12 hhv. Vi udførte MiFish metabarcoding analyse (samtidig påvisning af flere arter) i 10 PCR replikater fra de fire vandmængder med to protokoller. Den vandrette bjælke i boksen repræsenterer medianen; de øvre og nedre kanter af kassen svarer til indbyrdes kvartiler, de lodrette stænger svarer til 1,5 x kvartiler, og prikkerne repræsenterer outliers. Klik her for at se en større version af dette tal.
/files/ftp_upload/54741/54741tbl1.jpg "/>
Tabel 1:.. Taksonomiske sammensætning og læse tal for de 60 Arter påvist i MiSeq Analyser af Edna Prøver fra Kuroshio Tank kun de arter, der er indeholdt i tanken med reference- sekvenser i den brugerdefinerede database vises Klik her for at se en større udgave af denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I mange metabarcoding undersøgelser med anvendelse af miljøprøver såsom vand og jord, post-filtrering behandling af filterpatronen er generelt som følger 24,25: 1) at skære åben eller revnet huset med håndværktøj (slange cutter eller tang); 2) fjernelse af filteret fra patronen; og 3) skæring af filteret i små stykker med et barberblad til DNA-ekstraktion. For at undgå sådanne besværlige og tidskrævende procedurer, der er tilbøjelige til forurening i laboratoriet, har vi forsøgt flere DNA ekstraktionsmetoder i hus filterpatronen ved hjælp af en udbredt, billig kommercielt kit, og med succes udviklet den nuværende protokol med gunstige resultater fra eDNA metabarcoding analyse (Figur 1).
Et af de mere kritiske trin i den foreliggende protokol er anvendelsen af en rotationsryster i en forvarmet inkubator, der er i stand til at tilvejebringe god DNA udbytte til efterfølgende bibliotek preparation i eDNA metabarcoding analyse. Konstant omrøring af proteinase-K-opløsning i huset ved optimal temperatur sandsynligvis letter DNA-ekstraktion fra partikler fanget på filteret. Bemærk dog, at denne protokol indebærer anvendelse af både et roterende rysteapparat og en inkubator, og sidstnævnte skal kunne rumme førstnævnte. Desuden er en centrifuge, der kan rumme både 15 ml og 50 ml koniske rør er uundværlig for at fjerne den resterende væske fra post-filtrering filter og opsamling ekstraherede DNA inden i patronen, henholdsvis.
Der er en anden mulighed for at opnå en sådan DNA-ekstraktion uden at skulle skære åbne patronen (se tabel Materialer / reagenser). Sættet bruger ikke nogen enzymer til DNA-ekstraktion; i stedet, det bruger en speciel lysisbuffer i kombination med yderligere mekanisk lysis med perle slå. I indledende eksperimenter baseret på naturlig havvand fra tempererede kystnære Stillehavet, vi attempTed DNA ekstraktioner bruger dette kit sammen med en prototype af den nuværende protokol ved hjælp af kommercielle kit. Med brugen af sidstnævnte prototype-protokollen, vi konsekvent anerkendt distinkte amplifikationsprodukter i gelelektroforese for 1.-runde PCR. I modsætning hertil vi kunne skaffe PCR-produkter ved anvendelse af en anden kit (se Materialer / reagenser tabel) trods følgende to alternative protokoller leveret af fabrikanten. I betragtning af at PCR-inhibitor fjernelse trin er inkluderet i de to protokoller i det andet sæt (se Materialer / reagenser tabel), denne observation antyder en mangel på tilstrækkelige mængder af DNA i skabelonen. Sådanne relativt lave DNA-udbytter fra miljøprøver ved hjælp af anden kit er rapporteret i de seneste undersøgelser 26,27.
I nærværende protokol, har vi valgt filterpatronen med stor nominel porestørrelse (0,45 um), mens vandmiljøet mikrobielle undersøgelser tradilly bruge den mindste (0,22 um) efter forfiltrering gennem større porestørrelse filtre (1 til 3 um) 28. Årsagerne til vores valg er enkle og ligetil, og er ikke baseret på teoretiske argumenter: 1) porestørrelsen er meget tættere på at af glasfiberfiltre (0,70 pm) vi har traditionelt anvendes i tidligere eDNA studerer 12,14, 22,23; 2) det forventes at tillade større mængder vand, der skal filtreres end et mindre. Sidstnævnte funktion er særlig vigtig for vores aktuelle forskningsprojekter gennemgår i de åbne hav og dybhavsøkosystemer med knappe fisk overflod og biomasse. Faktisk bekræftede vi vellykket filtrering af en uafhængigt samplet 10-L i havvand fra Kuroshio tanken uden nogen bemærkelsesværdig tilstopning (resultater ikke vist). For nylig, men Turner et al. 29 viste, at 0,2 um filtrering maksimeret karper eDNA capture (85% ± 6%) og samtidig minimere alt (dvs. ikke-mål) eDNAcapture (48% ± 3%), men filter tilstopning begrænset denne porestørrelse til en prøve på under 250 ml. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme den optimale filter porestørrelse og vand filtrering volumen filterpatronen for eDNA metabarcoding i forskellige typer af vandmiljøer med varierende niveauer af fisk overflod og biomasse.
En af begrænsningerne ved denne protokol er, at vandet filtrering skal udføres i laboratoriet, hvor en strømforsyning er tilgængelig. På grund af begrænset kemisk stabilitet af DNA, eDNA begynder så hurtigt at nedbrydes som det udskilles fra en organisme og er detekterbar kun for en kort periode i akvatiske miljøer (timer til dage) 30. Derfor er det ideelt til at filtrere vandprøven umiddelbart efter indsamlingen for at undgå betydelig nedbrydning af eDNA. I denne henseende vil udviklingen af on-site filtreringsmetoder hjælp af filterpatronen være en lovende næste trin. Den bærbarhed og sterility af filterpatronen muliggøre udvikling af on-site filtrering metoder, som vil give mere intakt eDNA, der kan afspejle artssammensætningen af fisk samfund mere præcist i eDNA metabarcoding. De indsamlede eDNA på filterpatroner kan stabiliseres ved injektion af en kommerciel reagens 31 (se Materialer / reagenser Table) eller Longmire buffer 32 i patronen, før at bringe det tilbage til laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
