Summary

Utilisation d'une cartouche filtrante pour la filtration de l'eau et des échantillons d'extraction de l'ADN de l'environnement

Published: November 25, 2016
doi:

Summary

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Abstract

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Introduction

ADN de l'environnement (EDNA) dans les milieux aquatiques se réfère au matériel génétique trouvé dans la colonne d'eau. Des études récentes ont démontré l'utilité de EDNA pour détecter les poissons de divers milieux aquatiques, y compris les étangs, les rivières 1-3 4-8, cours d' eau 9, et l' eau de mer 10-14. La plupart de ces études se sont concentrées sur la détection d'un seul ou de quelques invasive 1,4-6,8,14 et rares ou menacées espèces 3,9, alors que certaines études récentes ont tenté la détection simultanée de plusieurs espèces dans les communautés de poissons locales 7,9, 12,13,15 et mésocosmes 11,12.

Cette dernière approche est appelée «metabarcoding» et EdNA metabarcoding utilise un ou plusieurs ensembles d'amorces de PCR pour coamplify une région de gène à travers taxonomiquement divers échantillons. Elle est suivie par la préparation bibliothèque d'indexation et l'addition de l'adaptateur et les bibliothèques indexées sont analysées par un séquençage parallèle à haut débitPlate-forme. Récemment Miya et al. 12 ont développé des amorces de PCR universelles pour metabarcoding EDNA de poissons (appelés "MiFish"). Les amorces MiFish ciblent une région hypervariable du gène 12S ARNr mitochondrial (163-185 pb), qui contient des informations suffisantes pour identifier les poissons à la famille taxonomique, genre et espèce, sauf pour certains congénères étroitement liés. Avec l'utilisation de ces amorces dans EDNA metabarcoding, Miya et al. 12 détecté plus de 230 espèces marines subtropicales de réservoirs d'aquarium avec la composition des espèces et des récifs coralliens connus près de l'aquarium.

Tout en optimisant le protocole metabarcoding pour accueillir l'eau de mer naturelle avec des niveaux de concentration de poissons EDNA différents, nous avons remarqué que les amorces MiFish parfois échoué à amplifier la région cible pour la préparation de la bibliothèque ultérieure. Une des raisons les plus probables pour cette amplification PCR échec est le manque de quantités suffisantes de la template ADN contenu dans de petits volumes d'eau filtrée (ie 1-2 L). Bien que la concentration EDNA d'un groupe taxonomique spécifique est inconnaissable avant l'amplification, la filtration de grands volumes d'eau (> 1-2 L) serait un moyen simple et efficace pour recueillir plus EDNA des milieux aquatiques avec l'abondance des poissons rares et la biomasse, tels que ouvert sur la mer et en eaux profondes des écosystèmes.

Par rapport aux filtres en fibre de disques utilisés classiquement dans un certain nombre de recherches poissons EDNA 16, les cartouches filtrantes ont l'avantage d'accueillir de plus grands volumes d'eau avant le colmatage 17. En fait, une étude récente a montré un grand volume (> 20 L) filtration des échantillons d'eau de mer côtières en utilisant des cartouches filtrantes 18. En outre, ils sont emballés individuellement et stérile, ainsi que plusieurs étapes du flux de travaux expérimentaux peuvent être réalisés dans le boîtier de filtre, ce qui réduit la probabilité de contamination du laboratoire 19. Le dernierfonctionnalité est essentielle pour EDNA metabarcoding, où le risque de contamination reste parmi les plus grands défis expérimentaux 20,21. En dépit de ces avantages techniques des cartouches filtrantes, il n'a pas été utilisé dans les études EDNA de poissons à deux exceptions près 8,15.

Ici, nous fournissons un protocole pour la filtration des échantillons d'eau avec la cartouche filtrante et l'extraction de EDNA de son filtre sans avoir à couper ouvrir le boîtier. Nous fournissons également deux systèmes de filtration d'eau de remplacement en fonction des volumes d'eau (≤4 L ou> 4 L). Pour comparer les performances du protocole nouvellement développé et un protocole précédemment utilisé à l' aide d' un filtre en fibre de verre dans notre groupe de recherche 12,14,22,23, nous effectuons EDNA metabarcoding analyse de l' eau de mer à partir d' un énorme réservoir d'aquarium (7.500 m 3 ) avec la composition des espèces connues, et indiquer le nombre d'espèces détectées provenant des deux protocoles que des résultats représentatifs. Ce protocole hcomme été développé pour metabarcoding EDNA de poissons, mais est également applicable à EDNA d'autres organismes.

Protocol

NOTE: Ce protocole ne traite pas des méthodes d'échantillonnage de l'eau et metabarcoding. L' eau peut être échantillonné de différentes manières en fonction des fins d'étude 16 et voir Miya et al. 12 pour plus de détails sur les méthodes de metabarcoding en utilisant des amorces de MiFish. A noter que l'eau prélevée doit rester très froid et on le filtre en quelques heures pour éviter une dégradation de EdNA. A noter également que ce protocole implique …

Representative Results

Il est techniquement difficile d'isoler et de quantifier seulement EDNA de poissons de la EDNA en vrac extrait, parce que les amorces MiFish coamplify la région cible de certains vertébrés non-poissons, tels que les oiseaux et les mammifères, avec des produits de PCR de la même taille (env. 170 pb ) 12. Au lieu de quantifier les poissons EDNA, nous effectuons MiFish metabarcoding analyse de EDNA à partir d'un réservoir d'aquarium avec la composition…

Discussion

Dans de nombreuses études de metabarcoding en utilisant des échantillons environnementaux tels que l' eau et le sol, le traitement post-filtration de la cartouche filtrante est généralement la suivante 24,25: 1) de coupe ouverte ou gerçures le boîtier avec des outils à main (coupe-tube ou une pince); 2) le retrait du filtre de la cartouche; et 3) la découpe du filtre en petits morceaux avec une lame de rasoir pour l'extraction d'ADN. Pour éviter de telles lourdes et longues procédures qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Materials

Mesh panel Iris Ohyama MPP-3060-BE
Metal prong Iris Ohyama MR12F
Stand for the mesh panel No brand 4184-9507 available from Amazon Japan
1-L plastic bag with screw cap Yanagi DP16-TN1000
Male luer-lock connector ISIS 11620
10-mL pipette tip Eppendorf 0030 000.765
10-L book bottle with valve As One 1-2169-01
Sterivex-HV filter Millipore SVHVL10RC denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting As One 1-7379-04
Female luer fitting As One 5-1043-14  
Inlet luer cap ISIS VRMP6
Outlet luer cap ISIS VRFP6
High vacuum tubing As One 6-590-01
Vacuum connector As One 6-663-02
Silicone stopper As One 1-7650-07
Manifold As One 2-258-01
Aspirator-GAS-1 As One 1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit MO BIO 14600-50-NF denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge Kubota Model 4000 Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor Kubota AT-508C
Adaptor for a 15 mL conical tube Kubota 055-1280
RNAlater Stabilization Solution Thermo Fisher Scientific AM7020
Parafilm PM992 denoted as "self-sealing film"

References

  1. Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
  2. Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
  3. Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
  4. Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
  5. Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
  6. Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
  7. Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
  8. Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
  9. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
  10. Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
  11. Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
  12. Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
  13. Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
  14. Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a ‘snapshot’ of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
  15. Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
  16. Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA – a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
  17. Stewart, F. J., DeLong, E. E. . Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. 10, 187-218 (2013).
  18. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
  19. Smalla, K., Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. . Molecular Microbial Ecology Manual. , 13-22 (1995).
  20. Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
  21. Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
  22. Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
  23. Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
  24. Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
  25. Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
  26. Deiner, K., Walser, J. -. C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
  27. Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
  28. Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A., Micic, M. . Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples’Springer Protocols Handbooks. , 325-339 (2016).
  29. Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
  30. Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
  31. Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
  32. Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).

Play Video

Cite This Article
Miya, M., Minamoto, T., Yamanaka, H., Oka, S., Sato, K., Yamamoto, S., Sado, T., Doi, H. Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA. J. Vis. Exp. (117), e54741, doi:10.3791/54741 (2016).

View Video