Summary

L'utilizzo di una cartuccia filtrante per filtrazione di acqua campioni ed estrazione di DNA ambientale

Published: November 25, 2016
doi:

Summary

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Abstract

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Introduction

DNA ambientale (Edna) in ambienti acquatici si riferisce a materiale genetico trovato nella colonna d'acqua. Recenti studi hanno dimostrato l'utilità di Edna per la rilevazione di pesci da vari ambienti acquatici, tra stagni, fiumi 1-3 4-8, torrenti 9, e l'acqua di mare 10-14. La maggior parte di questi studi si sono concentrati sulla individuazione di un unico o pochi invasivo 1,4-6,8,14 e rare o minacciate specie di 3,9, mentre alcuni studi recenti hanno tentato il rilevamento simultaneo di più specie in comunità ittiche locali 7,9, 12,13,15 e mesocosmi 11,12.

Quest'ultimo approccio è chiamato "metabarcoding" e Edna metabarcoding utilizza uno o più set di primer PCR per coamplify una regione del gene attraverso campioni tassonomicamente diversi. Questo è seguito da preparazione biblioteca indicizzazione e aggiunta adattatore, e le librerie indicizzati sono analizzate per un high-throughput sequenziamento parallelopiattaforma. Recentemente Miya et al. 12 hanno sviluppato universali primer PCR per metabarcoding Edna dai pesci (chiamati "MiFish"). I primer MiFish bersaglio una regione ipervariabile della mitocondriale 12S rRNA gene (163-185 bp), che contiene informazioni sufficienti per identificare i pesci alla famiglia tassonomica, genere e specie ad eccezione di alcuni congeneri strettamente correlati. Con l'uso di questi primer a Edna metabarcoding, Miya et al. 12 rilevati più di 230 specie marine subtropicali da acquari con noti composizione delle specie e barriere coralline vicino l'acquario.

Mentre l'ottimizzazione del protocollo metabarcoding per accogliere l'acqua di mare naturale, con livelli di concentrazione Edna dai pesci varia, abbiamo notato che i primer MiFish di tanto in tanto non è riuscito a amplificare la regione di destinazione per la successiva preparazione biblioteca. Uno dei motivi più probabili per questo l'amplificazione PCR infruttuoso è la mancanza di adeguate quantità di Template DNA contenuto in piccoli volumi di acqua filtrata (cioè 1-2 L). Anche se la concentrazione Edna da uno specifico gruppo tassonomico è inconoscibile prima l'amplificazione, la filtrazione di grandi volumi d'acqua (> 1-2 L) sarebbe un mezzo semplice ed efficace per raccogliere più Edna dagli ambienti acquatici con scarsa abbondanza di pesce e la biomassa, come ad esempio open-mare e in acque profonde ecosistemi.

Rispetto al filtri in fibra disco convenzionalmente utilizzato in un certo numero di ricerca pesci Edna 16, cartucce filtranti hanno il vantaggio di ospitare volumi idrici grandi prima intasamento 17. In realtà, un recente studio ha dimostrato grande volume (> 20 L) filtrazione di campioni di acqua di mare costiere che utilizzano cartucce filtranti 18. Inoltre, essi sono confezionati singolarmente e sterile, e diversi passaggi del flusso di lavoro sperimentale possono essere eseguite nell'alloggiamento del filtro, riducendo così la probabilità di contaminazione da laboratorio 19. L'ultimocaratteristica è fondamentale per Edna metabarcoding, in cui il rischio di contaminazione rimane tra le più grandi sfide sperimentale 20,21. Nonostante questi vantaggi tecnici di cartucce filtranti, non è stato utilizzato in studi Edna di pesci con due eccezioni 8,15.

Qui forniamo un protocollo per la filtrazione dei campioni di acqua con la cartuccia del filtro e l'estrazione di Edna dal filtro senza dover tagliare aprire l'alloggiamento. Forniamo anche due sistemi di filtrazione dell'acqua alternativi a seconda dei volumi d'acqua (≤4 L o> 4 L). Per confrontare le prestazioni del protocollo di nuova concezione e un protocollo precedentemente utilizzato utilizzando un filtro in fibra di vetro nel nostro gruppo di ricerca 12,14,22,23, eseguiamo Edna metabarcoding analisi di acqua di mare da un serbatoio acquario enorme (7.500 m 3 ) con nota composizione delle specie, e visualizza il numero di specie rilevate derivati ​​dai due protocolli come risultati rappresentativi. Questo protocollo hcome stato sviluppato per la metabarcoding Edna dai pesci, ma è anche applicabile ad Edna da altri organismi.

Protocol

NOTA: Questo protocollo non si occupa di metodi di campionamento e di acqua metabarcoding. L'acqua può essere campionato in modi diversi a seconda fini di studio 16 e vedere Miya et al. 12 per i dettagli sui metodi metabarcoding utilizzando primer MiFish. Si noti che l'acqua campione deve essere mantenuto molto freddo e filtrato entro poche ore per evitare la degradazione di Edna. Si noti inoltre che questo protocollo prevede l'utilizzo di un agitatore rotativo e un incubatore…

Representative Results

È tecnicamente difficile isolare e quantificare solo Edna pesce dal Edna massa estratta, perché i primer MiFish coamplify la regione di destinazione da parte di alcuni vertebrati non-pesce, come uccelli e mammiferi, con prodotti di PCR della stessa dimensione (ca. 170 bp ) 12. Invece di quantificare pesce Edna, eseguiamo MiFish metabarcoding analisi di Edna da un serbatoio acquario con nota la composizione delle specie utilizzando i due diversi metodi di filtraggio …

Discussion

In molti studi metabarcoding utilizzando campioni ambientali come l'acqua e il suolo, il trattamento post-filtrazione della cartuccia filtrante è generalmente come segue 24,25: 1) taglio aperto e screpolature della custodia con utensili manuali (taglio per tubi o pinze); 2) la rimozione del filtro dalla cartuccia; e 3) taglio del filtro in piccoli pezzi con una lametta per l'estrazione del DNA. Per evitare tali diversi metodi di estrazione del DNA ingombrante e richiede tempo procedure che sono sogge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Materials

Mesh panel Iris Ohyama MPP-3060-BE
Metal prong Iris Ohyama MR12F
Stand for the mesh panel No brand 4184-9507 available from Amazon Japan
1-L plastic bag with screw cap Yanagi DP16-TN1000
Male luer-lock connector ISIS 11620
10-mL pipette tip Eppendorf 0030 000.765
10-L book bottle with valve As One 1-2169-01
Sterivex-HV filter Millipore SVHVL10RC denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting As One 1-7379-04
Female luer fitting As One 5-1043-14  
Inlet luer cap ISIS VRMP6
Outlet luer cap ISIS VRFP6
High vacuum tubing As One 6-590-01
Vacuum connector As One 6-663-02
Silicone stopper As One 1-7650-07
Manifold As One 2-258-01
Aspirator-GAS-1 As One 1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit MO BIO 14600-50-NF denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge Kubota Model 4000 Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor Kubota AT-508C
Adaptor for a 15 mL conical tube Kubota 055-1280
RNAlater Stabilization Solution Thermo Fisher Scientific AM7020
Parafilm PM992 denoted as "self-sealing film"

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Cite This Article
Miya, M., Minamoto, T., Yamanaka, H., Oka, S., Sato, K., Yamamoto, S., Sado, T., Doi, H. Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA. J. Vis. Exp. (117), e54741, doi:10.3791/54741 (2016).

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