We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Miljø DNA (Edna) i akvatiske miljøer refererer til genetisk materiale funnet i vannsøylen. Nyere studier har vist nytten av Edna for å oppdage fisk fra ulike akvatiske miljøer, inkludert dammer 1-3, elver 4-8, bekker 9, og sjøvann 10-14. De fleste av disse studiene fokusert på deteksjon av en enkelt eller noen få invasiv 1,4-6,8,14 og sjeldne eller truede arter 3,9, mens noen nyere studier forsøkt samtidig påvisning av flere arter i lokale fiskesamfunn 7,9, 12,13,15 og posene 11,12.
Sistnevnte tilnærming kalles "metabarcoding" og Edna metabarcoding bruker ett eller flere sett med PCR primere til coamplify et gen region tvers taksonomisk ulike prøver. Dette etterfølges av bibliotek-preparat med indeksering og adapter tilsetning, og de indekserte bibliotekene blir analysert ved en high-throughput parallell sekvenseplattform. Nylig Miya et al. 12 utviklet universell PCR primere for metabarcoding Edna fra fisker (kalt "MiFish"). De MiFish primere rettet mot en hypervariabel region av mitokondriell 12S rRNA-gen (163-185 bp) som inneholder tilstrekkelig informasjon til å identifisere fisk til taksonomisk familie, slekt og art med unntak av noen nær beslektede kongenere. Med bruk av disse primere i Edna metabarcoding, Miya et al. 12 oppdaget mer enn 230 subtropiske marine arter fra akvariekummer med kjente artssammensetning og korallrev nær akvariet.
Mens optimalisere metabarcoding protokollen for å imøtekomme naturlig sjøvann med varierende grad av Edna konsentrasjon fra fisker, har vi lagt merke til at MiFish primere tidvis klarte å forsterke målområdet for påfølgende bibliotek forberedelse. En av de mer sannsynlige årsaker til dette mislykket PCR-amplifikasjon er mangel på tilstrekkelige mengder av template DNA som inneholdes i små mengder vann, filtrert (for eksempel 1-2 liter). Selv om Edna konsentrasjon fra en bestemt taksonomisk gruppe er ukjennelig før forsterkning, filtrering av store vannmengder (> 1-2 L) ville være en enkel og effektiv måte å samle mer Edna fra akvatiske miljøer med knappe fisk overflod og biomasse, slik som åpne hav og dypvanns økosystemer.
I forhold til disk fiber filtre konvensjonelt brukes i en rekke av fisk Edna forskning 16, filterpatroner har fordelen av imøtekommende større vannmengder før tilstopping 17. Egentlig en fersk undersøkelse viste stort volum (> 20 L) filtrering av kystsjøvannsprøver ved hjelp av filterpatroner 18. I tillegg er de individuelt pakket og sterile, og flere trinn av den eksperimentelle arbeidsflyten kan utføres i filterhuset, og dermed redusere sannsynligheten for forurensning fra laboratoriet 19. Sistnevntefunksjonen er kritisk for Edna metabarcoding, der risikoen for forurensning er fortsatt blant de største eksperimentelle utfordrer 20,21. Til tross for disse tekniske fordelene ved filterpatroner, det har ikke vært brukt i Edna studier av fisk med to unntak 8,15.
Her gir vi en protokoll for filtrering av vannprøver med filterpatronen og utvinning av Edna fra sitt filter uten å måtte kutte åpne huset. Vi tilbyr også to alternative vann filtrering systemer avhengig av vannmengder (≤4 L eller> 4 L). For å sammenligne resultatene av den nyutviklede protokoll og en tidligere brukt protokollen ved hjelp av et glassfiberfilter i vår forskningsgruppe 12,14,22,23, vi utfører Edna metabarcoding analyse av sjøvann fra et stort akvarium tank (7500 m 3 ) med kjent artssammensetning, og viser antall oppdagede arter som stammer fra de to protokollene som representative resultater. Denne protokollen hsom er utviklet for metabarcoding Edna fra fisker, men er også anvendelig til Edna fra andre organismer.
I mange metabarcoding studier med miljøprøver slik som vann og jord, etter filtrering behandling av filterpatronen er generelt som følger 24,25: 1) skjære åpen eller sprekkdannelse i huset med håndverktøy (slange kutter eller tang); 2) fjerning av filteret fra kassetten; og 3) kutting av filteret i små biter med et barberblad for DNA-ekstraksjon. For å unngå slike tungvint og tidkrevende prosedyrer som er utsatt for forurensning i laboratoriet, har vi forsøkt flere DNA utvinning metoder innenfor hu…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
Manifold | As One | 2-258-01 | |
Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |