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Environment

El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente

doi: 10.3791/54741 Published: November 25, 2016

Introduction

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ADN Ambiental (Edna) en los ambientes acuáticos se refiere a material genético que se encuentra en la columna de agua. Estudios recientes han demostrado la utilidad de Edna para la detección de peces de diferentes ambientes acuáticos, incluyendo estanques, ríos 1-3 4-8, corrientes 9, 10-14 y agua de mar. La mayoría de estos estudios se centraron en la detección de una sola o unas pocas invasiva 1,4-6,8,14 y especies raras o amenazadas 3,9, mientras que algunos estudios recientes intentaron detección simultánea de múltiples especies en las comunidades locales de pescado 7,9, 12,13,15 y mesocosmos 11,12.

Este último enfoque se denomina "metabarcoding" y Edna metabarcoding utiliza uno o varios conjuntos de cebadores de PCR para coamplify una región génica a través de taxonómicamente diversas muestras. Esto es seguido por la preparación de la biblioteca con la indexación y la adición adaptador, y las bibliotecas de indexado se analizan mediante una secuenciación paralela de alto rendimientoplataforma. Recientemente Miya et al. 12 desarrollaron cebadores universales de PCR para metabarcoding Edna de peces (llamados "MiFish"). Los cebadores MiFish se dirigen a una región hipervariable del gen mitocondrial 12S rRNA (163-185 pb), que contiene información suficiente para identificar peces a la familia taxonómica, género y especie a excepción de algunos congéneres estrechamente relacionadas. Con el uso de estos cebadores en Edna metabarcoding, Miya et al. 12 detectaron más de 230 especies marinas subtropicales de tanques del acuario con conocidos composición de las especies y arrecifes de coral cerca del acuario.

Al tiempo que optimiza el protocolo metabarcoding para dar cabida a agua de mar natural con diferentes niveles de concentración de peces Edna, nos hemos dado cuenta de que los cebadores MiFish vez en cuando no amplificar la región diana para la posterior elaboración de la biblioteca. Una de las razones más probables para esta amplificación por PCR pierda falta de cantidades adecuadas de la teADN mplate contenida en pequeños volúmenes de agua filtrada (es decir, 1-2 L). Aunque la concentración de Edna de un grupo taxonómico específico es desconocido antes de la amplificación, filtración de grandes volúmenes de agua (> 1-2 L) sería un medio sencillo y eficaz para recoger más Edna de los ambientes acuáticos con escasa abundancia de peces y la biomasa, tales como de alta mar y de aguas profundas ecosistemas.

En relación con filtros de fibra de disco utilizado convencionalmente en una serie de investigaciones Edna pescado 16, cartuchos de filtro tienen la ventaja de acomodar volúmenes de agua más grandes antes de obstrucción 17. De hecho, un estudio reciente mostró gran volumen (> 20 l) de filtración de muestras de agua marina costeras que utilizan cartuchos de filtro 18. Además, se empaquetan individualmente y estéril, y varios pasos del flujo de trabajo experimental se pueden realizar en la carcasa del filtro, reduciendo así la probabilidad de contaminación del laboratorio 19. El últimocaracterística es crítica por Edna metabarcoding, en el que el riesgo de contaminación se mantiene entre los más grandes experimental desafía 20,21. A pesar de estas ventajas técnicas de cartuchos de filtro, no se ha utilizado en estudios Edna de peces con dos excepciones 8,15.

Aquí se proporciona un protocolo para la filtración de muestras de agua con el cartucho de filtro y extracción de Edna de su filtro sin tener que cortar y abrir la carcasa. También disponemos de dos sistemas de filtración de agua alternativos dependiendo de los volúmenes de agua (≤4 L o> 4 L). Para comparar el rendimiento del protocolo de nuevo desarrollo y un protocolo utilizado previamente utilizando un filtro de fibra de vidrio en nuestro grupo de investigación 12,14,22,23, realizamos Edna metabarcoding análisis de agua de mar de un gran tanque de acuario (7,500 m 3 ) con la composición de las especies conocidas, y mostrar el número de especies detectadas derivados de los dos protocolos como resultados representativos. Este protocolo hcomo se han desarrollado para metabarcoding Edna de peces, sino que también es aplicable a Edna de otros organismos.

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Protocol

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NOTA: Este protocolo no aborda los métodos de toma de muestras de agua y metabarcoding. El agua puede tomarse muestras de diferentes maneras dependiendo de los propósitos del estudio 16 y vea Miya et al. 12 para detalles de los métodos que utilizan cebadores metabarcoding MiFish. Tenga en cuenta que el agua en la muestra se debe mantener muy frío y se filtró dentro de unas pocas horas para evitar la degradación de Edna. Tenga en cuenta también que este protocolo implica el uso de un agitador rotatorio y una incubadora, y este último debe ser lo suficientemente grande para dar cabida a la primera. Además, una centrífuga que puede acomodar a ambos 15 ml y 50 ml tubos cónicos es indispensable para eliminar el líquido restante del filtro post-filtración y para recoger ADN extraído dentro del cartucho, respectivamente.

1. El procesamiento de un tapón de rosca y una bolsa de plástico de 1 L

NOTA: Omita este paso si el volumen de filtración es> 4 L.

  1. Perforar un agujero a través del centro de un tornillo cap (unido a una bolsa de plástico 1 L desechable) con el mismo diámetro (4,8 mm) que el tubo que se proyecta desde un conector luer-lock macho. El uso de alicates diagonales, acortar el tubo del conector luer-lock macho a una longitud apropiada (ca. 3 mm) para evitar la obstrucción de una pequeña cantidad de agua dentro de la tapa después de la filtración.
  2. Aplicar un pegamento adhesivo especializado para el polietileno (PE) y polipropileno (PP) tanto al fondo y la superficie del conector de cierre luer macho y tapón de rosca, respectivamente. Espere unos minutos para una buena unión adhesiva (consulte las instrucciones del fabricante).
  3. Insertar el conector Luer macho en el orificio de la tapa roscada. Espere hasta que la unión adhesiva completa de las dos partes (generalmente> 24 h). Esterilizar el tapón de rosca con el conector luer-lock macho con 10% de lejía comercial (ca. 0.6% de hipoclorito de sodio) antes de su uso.
  4. Haga dos agujeros en las dos esquinas inferiores de la bolsa de plástico de 1 litro con el fin de colgarlo de un mesPanel h (paso 3). Asegúrese de que el diámetro de los agujeros es mayor que el de las patas del panel de malla.

2. Montaje del sistema de filtración

  1. Fije el tubo de alto vacío para el conector de entrada de una bomba de aspiración y conecte el otro extremo del tubo a un colector. Asegúrese de que los tres de color rojo camisetas válvulas del colector están en la posición "off" (es decir, horizontal).
  2. El uso de un conjunto de guantes limpios, inserte un adaptador luer hembra y un conector de vacío en los extremos superior e inferior de la tubería de goma de vacío para la filtración, respectivamente.
  3. adjuntar cuidadosamente el accesorio Luer hembra a un puerto de salida del cartucho de filtro y conecte el conector de vacío para un tapón de silicona.

3. La filtración de las muestras de agua (L) ≤4 utilizando el cartucho de filtro

NOTA: Omita este paso si el volumen de filtración es> 4 L. Este sistema de filtración requiere un panel autoportante de fo colgar la bolsa de plástico llena de 1 L de agua. Un panel de malla, múltiples puntas, y un soporte para el panel, todos disponibles en tiendas en línea, serían útiles para el montaje de esta unidad. Autoclave la entrada y salida tapones luer para el cartucho de filtro antes de su uso.

  1. Verter el agua muestreada 1 L en la bolsa de plástico y cerrar el tapón roscado con el conector Luer macho.
  2. conectar con cuidado un orificio de entrada del cartucho de filtro montado con el conector luer-lock macho de la bolsa de plástico. No apriete demasiado el conector de cierre luer; de lo contrario la unidad se escape una vez que el bombeo se inicia. Asegúrese de que todas las conexiones son seguras antes de colgar la bolsa de plástico de un panel de malla.
  3. Con cuidado, colgar la bolsa de plástico con el cartucho del filtro de dos dientes en el panel de malla e insertar un tapón de silicona en un orificio de entrada del colector.
  4. Encienda el aspirador. Abrir las válvulas T rojos para la filtración. Ejecutar el colector hasta que el cartucho de filtro esté seco, tuando su vez la camiseta roja de la válvula a la posición de apagado.
  5. Repita 3.1-3.4 pasos hasta que se filtra la cantidad deseada de agua.
    NOTA: Para 1 litro de agua tomada de los arrecifes coralinos subtropicales, se tarda alrededor de tres minutos para la filtración.
  6. Retirar con cuidado el cartucho de filtro de la bolsa de plástico y la conexión de vacío.
  7. Tape ambos extremos del cartucho con las tapas de entrada y salida luer.
  8. Etiquetar el tapón del cartucho y Luer de entrada apropiada utilizando una pluma de solvente a prueba de secado rápido y etiquetado no se corra.
  9. Guarde el cartucho de filtro a -20 ° C antes de la extracción de ADN.

4. La filtración de agua (> 4 l) Las muestras utilizando el cartucho de filtro

Nota: omitir este paso si el volumen de filtración de agua es ≤4 L. Este sistema de filtración requiere una botella libro de 10 l equipado con una válvula y una punta de pipeta desechable de 10 ml. Un diámetro interior de la punta de la pipeta 10 ml (15,0 mm) y una conicidad de la puntafinal debe ajustarse a un diámetro exterior de la la válvula (15,0 mm) y el puerto de entrada del cartucho de filtro, respectivamente. Ambas conexiones son retenidos de forma segura durante la filtración en un ajuste de fricción. Esterilizar la punta de la pipeta con un 10% de lejía comercial (ca. 0,6% de hipoclorito de sodio) antes de su uso.

  1. Preparar una cantidad apropiada de agua muestreada en la botella libro. inserte firmemente la punta de la pipeta 10 ml en la válvula de la botella de 10 l libro.
  2. Estrechamente insertar el puerto de salida del cartucho de filtro en el extremo de la punta de pipeta e insertar el tapón de silicona en el puerto de entrada del colector. Encienda el aspirador. Abrir las válvulas T rojos para la filtración. Ejecutar el colector hasta que el cartucho de filtro esté seco, luego gire la válvula en T rojo a la posición de apagado.
    NOTA: Para obtener 10 L de agua de mar tomada de los arrecifes de coral exteriores subtropicales, se tarda unos 30-40 minutos para la filtración.
  3. Retirar con cuidado el cartucho de filtro de la bolsa de plástico y la conexión de vacío. Cap tantoextremos del cartucho con la entrada y salida tapones luer. Etiquetar el tapón del cartucho y Luer de entrada apropiada utilizando una pluma de solvente a prueba de secado rápido y etiquetado no se corra. Guarde el cartucho de filtro a -20 ° C antes de la extracción de ADN.

5. Extracción de Edna del filtro

Nota: En los pasos 4 y 5, se utiliza un kit comercial, en gran parte siguiendo un protocolo de "sangre nucleado" proporcionado por el kit. Por simplicidad, se describe el procedimiento para el procesamiento de un cartucho individual. En la práctica, se recomienda procesamiento 8 (o el número máximo de la centrífuga) o menos filtros a la vez.

  1. Precalentar una incubadora a 56 ° C.
  2. Preparar un tubo de 2,0 ml por el corte de la tapa articulada del tubo. Deseche la tapa.
    NOTA: Este tubo se utiliza como un tubo de recogida para el líquido que queda en el filtro.
  3. Retire la entrada (NO salida) tapón luer del cartucho de filtro e insertar el puerto de entrada into el tubo de recogida. sellar herméticamente una conexión entre el tubo del cartucho y colección usando una película de auto-sellado.
  4. Inserte la unidad combinada en un adaptador de centrífuga para un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el cartucho a 5.000 xg durante 1 min para eliminar el líquido residual en el filtro.
  5. Retire el tubo de extracción del cartucho de filtro y desechar el tubo. Re-cap el puerto de entrada del cartucho.
  6. Preparar una mezcla de 20 l solución de proteinasa-K, 220 l de PBS (solución salina tamponada con fosfato; no proporcionado por el kit) y 200 l de tampón AL.
    NOTA: El cartucho de filtro tiene capacidad para hasta cuatro veces el volumen de la mezcla (. Ca 1,8 ml).
  7. Retire la tapa de entrada y añadir la mezcla (440 l) en el cartucho de filtro usando una punta de pipeta. Insertar la pipeta completamente en el puerto de entrada de modo que la punta de la pipeta es visible en el interior del cartucho de justo por encima de la membrana.
  8. Vuelva a tapar el orificio de entrada y colocar el filtro de cocheTridge en un agitador rotatorio.
  9. Coloque el agitador rotatorio en la incubadora precalentado a 56 ° C y encienda el agitador a una velocidad de 20 rpm durante 20 min.
  10. Durante la incubación, preparar un nuevo tubo de 2,0 ml, etiquetar el tubo de manera apropiada utilizando una pluma de solvente a prueba y colocarlo en un tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: el primero (2,0 ml) y últimos tubos (50 ml) se utilizan para la recogida del ADN extraído y para sujetar el tubo de 2,0 ml, respectivamente.
  11. Después de la incubación, retirar la tapa de entrada e inserte la entrada (NO salida) del puerto del cartucho en el tubo de 2.0 ml dentro del tubo cónico de 50 ml. Cerrar el tubo cónico de 50 ml con un tapón de rosca.
  12. Centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 5.000 xg durante 1 min para recoger el ADN extraído del cartucho. Retire el cartucho de filtro y el tubo de 2,0 ml usando pinzas esterilizadas y tapar el tubo. Desechar el cartucho del filtro.

6. Purificación del ADN extraído

NOTA: Edna eluir con 100 l de tampón AE en lugar de 200 l especificados en el manual del kit comercial.

  1. Añadir 200 l de etanol (96-100%) para el ADN extraído en el tubo de 2,0 ml de la etapa anterior (ca. 440 l), y se mezcla a fondo por agitación.
  2. Pipetear la mezcla en una columna de giro colocado en un tubo de recogida de 2 ml. Se centrifuga a 5.000 g durante 1 min. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
  3. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml, añadir 500 l de tampón AW1, y centrifugar durante 1 min a 5.000 x g. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
  4. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml, añadir 500 l de tampón AW2 y centrifugar durante 3 minutos a 20.000 x g. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
  5. Prepare un nuevo tubo de 1,5 ml (no incluidos en el kit) y la etiqueta del tubo de manera apropiada utilizando una pluma a prueba de agua para el secado rápido y etiquetado no se corra. Transferir la columna de centrifugación to el tubo de 1,5 ml.
  6. Eluir el ADN mediante la adición de 100 l de tampón AE al centro de la membrana de la columna de centrifugación. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente, y luego centrifugar a 6000 xg durante 1 min.
  7. Desechar la columna de centrifugación y tapar el tubo. Almacenar el ADN purificado a -20 ° C.

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Representative Results

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Técnicamente es difícil de aislar y cuantificar solamente Edna peces de la Edna mayor extraído, ya que los cebadores MiFish coamplify la región diana de algunos vertebrados que no son peces, como las aves y los mamíferos, con productos de PCR del mismo tamaño (aprox. 170 pb ) 12. En lugar de cuantificar los peces a Edna, realizamos MiFish metabarcoding análisis de Edna desde un tanque de acuario con la composición de especies conocidas utilizando los dos métodos diferentes de filtración y extracción del ADN, y comparar el número de especies detectadas por biblioteca a partir de los dos protocolos. Este sencillo experimento fue diseñado para demostrar la viabilidad del presente protocolo como los "resultados representativos" y no para demostrar rigurosamente su superioridad sobre los demás.

Se muestrearon un total de 30 L de agua de mar desde un tanque de Kuroshio en el Acuario Churaumi, Okinawa, Japón (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). El tanque de Kuroshio está diseñado para la exposición de megafauna marina, con unas dimensiones (L x W x D) de 35 mx 27 mx 10 my un volumen total de agua de 7.500 m3. Contiene aproximadamente 60 grandes especies de peces marinos -sized característicos a otras zonas del Kuroshio, una de las corrientes limítrofes occidentales que fluyen hacia el noreste a lo largo de toda la longitud del Japón. en un estudio anterior MiFish metabarcoding, Miya et al. 12 detectaron 61 de las 63 especies (97%) contenían en el depósito a partir de cinco muestras de agua de mar 2 L.

Para la filtración del agua de mar, se utilizó cartuchos de filtro (tamaño de poro = 0,45 m) y filtros de disco de fibra de vidrio (tamaño de poro = 0,70 micras). Nos simultáneamente filtrada del agua de mar en el mismo bloque con los dos protocolos para cuatro volúmenes de agua (1, 2, 3, 4 y L, total, ocho filtros). Después de la filtración del agua de mar, también filtrada 1 l de agua de calidad para PCR con los dos filtros (fcartucho ILTER y el filtro de fibra de vidrio) como los controles negativos (dos espacios en blanco de filtro). A partir de estos tipos de filtros, se extrajeron Edna utilizando los nuevos y usados previamente protocolos 12, ambos de los cuales emplean el mismo kit comercial. Un total de 10 muestras de Edna (incluidos los dos controles negativos) se sometieron a análisis MiFish metabarcoding como se describe en Miya et al. 12

Brevemente, se realizó la primera ronda de PCR para amplificar la región diana (mitocondrial 12S rRNA genes;. Ca 170 pb) y para anexar los adaptadores para la secuenciación de extremo emparejado. Durante ocho muestras Edna (con exclusión de los dos controles negativos), se realizó el 10 de PCR se replica para ver variaciones en el número de especies detectadas dentro de cada muestra (un total de 80 PCR). También añadimos el filtro y los espacios en blanco de PCR para cada ocho muestras Edna (total 16 PCR). En total, se obtuvieron 96 productos de PCR de la PCR 1ª ronda y fueron utilizados como plantillas para la segunda ronda PCR para la doble indexación y añadiendo adaptadores adicionales para la preparación de la biblioteca siguientes Miya et al. 12

La secuenciación de fin de emparejado (2 x 150 bp) de las 96 bibliotecas produjo 4.127.546 lee, con un promedio de 42 995 lee por biblioteca (40.539 lee en el cartucho de filtro y 43.121 lee en el filtro de fibra de vidrio). Después de demultiplexación y posterior pre-procesamiento de los datos en bruto, 1.068.266 lecturas fueron seleccionadas para la explosión búsquedas para la asignación taxonómica. De estas lecturas, 830.788 lecturas fueron identificadas como aquellas especies que figuran en el tanque de Kuroshio (Tabla 1). Se detectaron 60 especies de tanques de 830.788 operaciones de lectura y el número promedio de especies detectadas para el 10 PCR réplicas de las ocho muestras Edna osciló entre 29 por 1 L (filtro de fibra de vidrio) a 55 de 4 L (cartucho de filtro) (Tabla 1) . Leer los números de los dos paneles protectores de las ocho muestras Edna eran de menor importancia, que van desde 0a 12 para la especie de tanque.

Se encontró que el número de especies detectadas por el cartucho de filtro fue significativamente mayor que las de los filtros de fibra de vidrio (ANCOVA, F = 381,8, p <0,001; Figura 1) a través de los volúmenes de agua de mar 1-4 L. Número de especies detectadas por el cartucho de filtro eran aproximadamente 1,5 veces mayor que los que utilizan los filtros de fibra de vidrio y, en ambos métodos, el número de especies detectadas aumentó con el volumen de agua filtrada (ANCOVA, F = 164,2, p <0,001).

Los números más altos de especies detectadas por el cartucho de filtro pueden ser resultado de una o más de las etapas siguientes en los flujos de trabajo experimentales: la filtración del agua a través de la muestra (1) de diferentes materiales (PVDF hidrófilo [difluoruro de polivinilideno] vs. microfibra de vidrio) y / o (2) diferentes tamaños de poro nominales (0,4581; vs. 0,70 m m) en los cartuchos de filtro y los filtros de fibra de vidrio podría retener más Edna de peces en el anterior filtro; (3) el uso de un agitador rotatorio en el incubador precalentado produce más rendimiento de ADN a partir de los cartuchos de filtro que de los filtros de fibra de vidrio plegables en una columna de giro colocado en un bloque de calor inmóvil; (4) recolección del ADN extraído por centrifugación del cartucho de filtro es más eficiente que la del filtro de fibra de vidrio, debido a los diferentes materiales de filtro y / o diferentes métodos de centrifugación. Al parecer, se requiere un estudio más rigurosamente diseñado para identificar los factores responsables de la consistentemente mayor número de especies detectadas por el cartucho de filtro en el presente estudio.

Figura 1
Figura 1: El número de especies detectadas representa frente a los volúmenes de agua filtrada en MiFish Metabarcoding Ana lisis de Edna desde el tanque de Kuroshio, Okinawa Churaumi Aquarium. El número de especies detectadas se limita a las especies contenidas en el depósito. De 30 L de agua de mar, filtrados 1, 2, 3, y 4 L muestras usando los cartuchos de filtro y filtros de fibra de vidrio y se extrajeron Edna de esos filtros usando los protocolos actuales y descritos anteriormente 12, respectivamente. Se realizó el análisis metabarcoding MiFish (detección simultánea de múltiples especies) durante 10 PCR replica de los cuatro volúmenes de agua que utilizan dos protocolos. La barra horizontal en la caja representa la mediana; los bordes superior e inferior del cuadro corresponden a las interrelaciones cuartiles, las barras verticales corresponden a 1,5 x cuartiles, y los puntos representan valores atípicos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Tabla 1:.. Composición taxonómica y Lee Números de las 60 especies detectadas en el análisis MiSeq de muestras Edna desde el tanque de Kuroshio Sólo se muestran las especies contenidas en el tanque con secuencias de referencia en la base de datos personalizada Haga clic aquí para ver una versión más grande de Esta mesa.

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Discussion

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En muchos estudios metabarcoding utilizando muestras ambientales tales como el agua y el suelo, el tratamiento post-filtración del cartucho de filtro es generalmente como sigue 24,25: 1) de corte abierto o formación de grietas de la carcasa con herramientas de mano (cortador de tubos o pinzas); 2) la retirada del filtro del cartucho; y 3) cortar el filtro en pequeños trozos con una cuchilla de afeitar para la extracción de ADN. Para evitar este tipo de varios métodos de extracción de ADN engorroso y consume mucho tiempo procedimientos que son propensos a la contaminación en el laboratorio, hemos tratado de dentro de la carcasa del cartucho de filtro utilizando un kit comercial ampliamente utilizado, de bajo costo, y desarrollado con éxito la presente protocolo con favorable los resultados del análisis metabarcoding Edna (Figura 1).

Uno de los pasos más críticos en el presente protocolo es el uso de un agitador rotatorio en una incubadora precalentada, que es capaz de ofrecer un buen rendimiento de ADN para su posterior prepar bibliotecaación en el análisis metabarcoding a Edna. agitación constante de la solución de proteinasa-K dentro de la carcasa a una temperatura óptima probablemente facilita la extracción de ADN de las partículas atrapadas en el filtro. Nótese, sin embargo, que este protocolo implica el uso de tanto un agitador rotatorio y una incubadora, y este último debe ser capaz de acomodar el primero. Además, una centrífuga que puede alojar tanto a 15 ml y 50 ml tubos cónicos es indispensable para retirar el líquido restante del filtro post-filtración y la recolección de ADN extraído dentro del cartucho, respectivamente.

Hay otra opción para lograr dicha extracción de ADN sin tener que cortar y abrir el cartucho (véase la Tabla de Materiales / Reactivos). El kit no utiliza enzimas para la extracción de ADN; En su lugar, se utiliza un tampón de lisis especial en combinación con la lisis mecánica adicional con golpes de talón. En experimentos preliminares basadas en agua de mar natural del Pacífico templado costero, que attempTed extracciones de ADN utilizando este kit junto con un prototipo del presente protocolo utilizando el kit comercial. Con el uso del protocolo de prototipo último, reconocimos consistentemente productos de amplificación distintos en la electroforesis en gel para la PCR primera ronda. Por el contrario, no hemos podido obtener cualquiera de los productos de PCR mediante el uso de un kit diferente (ver Materiales / Reactivos Tabla) a pesar de seguir dos protocolos alternativos proporcionados por el fabricante. Teniendo en cuenta que la PCR pasos de extracción inhibidor se incluyen en los dos protocolos de la segunda kit (ver Materiales / reactivos Tabla), esta observación sugiere una falta de cantidades adecuadas de ADN en la plantilla. Dichos rendimientos relativamente bajos de ADN a partir de muestras ambientales utilizando el segundo kit son reportados en estudios recientes 26,27.

En el presente protocolo, se ha elegido el cartucho de filtro con un gran tamaño de poro nominal (0,45 m), mientras que los estudios de microbios acuáticos conventionautilizar LLY la más pequeña (0,22 micras), después de prefiltración a través de filtros de mayor tamaño de poro de tamaño (de 1 a 3 micras) 28. Las razones de nuestra elección son simples y directas, y no se basan en argumentos teóricos: 1) el tamaño de poro es mucho más cercana a la de los filtros de fibra de vidrio (0,70 m) que hemos utilizado convencionalmente en Edna Estudios previos 12,14, 22,23; 2) se espera para permitir que grandes volúmenes de agua a filtrar que el más pequeño. Esta última característica es particularmente significativo para nuestros proyectos de investigación actuales se someten en los ecosistemas de alta mar y de aguas profundas con escasa abundancia de peces y la biomasa. De hecho, se confirmó filtración con éxito de un muestreada de forma independiente 10-L de agua de mar desde el tanque de Kuroshio sin obstrucción notable (resultados no mostrados). Recientemente, sin embargo, Turner et al. 29 demostró que 0,2 micras filtración captura maximizado carpa Edna (85% ± 6%) y reducir al mínimo total (es decir no objetivo) Ednacaptura (48% ± 3%), pero obstrucción del filtro limitan este tamaño de poro a un volumen de muestra de menos de 250 ml. Se necesitan estudios adicionales para determinar el volumen de poro del filtro óptimo tamaño y el agua de filtración del cartucho de filtro por Edna metabarcoding en diversos tipos de ambientes acuáticos con diferentes niveles de abundancia y biomasa de peces.

Una de las limitaciones de este protocolo es que la filtración de agua se debe realizar en el laboratorio donde una fuente de alimentación está disponible. Debido a la estabilidad química limitada de ADN, Edna comienza a degradarse tan pronto como se desprende de un organismo y es detectable sólo por un corto período de tiempo en ambientes acuáticos (horas a días) 30. Por lo tanto, es ideal para filtrar la muestra de agua inmediatamente después de la recolección para evitar una degradación significativa de Edna. En este sentido, la evolución de los métodos de filtración en el lugar utilizando el cartucho de filtro sería un siguiente paso prometedor. La portabilidad y sterilitY del cartucho de filtro de permitir que el desarrollo de los métodos de filtración en el lugar, que proporcionarán Edna más intacta que puede reflejar la composición de especies de la comunidad de peces con mayor precisión en Edna metabarcoding. Edna recogida en los cartuchos de filtro puede ser estabilizado por la inyección de un reactivo comercial 31 (ver Materiales / reactivos Tabla) o Longmire tampón 32 en el cartucho antes de llevarlo de nuevo al laboratorio.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mesh panel Iris Ohyama MPP-3060-BE
Metal prong Iris Ohyama MR12F
Stand for the mesh panel No brand 4184-9507 available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap Yanagi DP16-TN1000
Male luer-lock connector ISIS 11620
10 ml pipette tip Eppendorf 0030 000.765
10 L book bottle with valve As One 1-2169-01
Sterivex-HV filter Millipore SVHVL10RC denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting As One 1-7379-04
Female luer fitting As One 5-1043-14  
Inlet luer cap ISIS VRMP6
Outlet luer cap ISIS VRFP6
High vacuum tubing As One 6-590-01
Vacuum connector As One 6-663-02
Silicone stopper As One 1-7650-07
Manifold As One 2-258-01
Aspirator-GAS-1 As One 1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit MO BIO 14600-50-NF denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge Kubota Model 4000 Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor Kubota AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube Kubota 055-1280
RNAlater Stabilization Solution Thermo Fisher Scientific AM7020
Parafilm PM992 denoted as "self-sealing film"

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References

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El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente
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Miya, M., Minamoto, T., Yamanaka, H., Oka, S. i., Sato, K., Yamamoto, S., Sado, T., Doi, H. Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA. J. Vis. Exp. (117), e54741, doi:10.3791/54741 (2016).More

Miya, M., Minamoto, T., Yamanaka, H., Oka, S. i., Sato, K., Yamamoto, S., Sado, T., Doi, H. Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA. J. Vis. Exp. (117), e54741, doi:10.3791/54741 (2016).

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