Introduction
su ortamlarında çevresel DNA (Edna'yı) su sütunu bulunan genetik malzemeyi ifade eder. Son çalışmalar, göletler 1-3, nehirler 4-8 dahil olmak üzere çeşitli su ortamlarında, gelen balıkları tespit etmek için Edna yararını göstermiştir 9 akarsu ve deniz suyu 10-14. Bazı yeni çalışmalar yerel balık toplulukları 7,9 birden fazla türün aynı anda algılama girişiminde ise bu çalışmaların çoğu, 3,9 tür tek veya birkaç invaziv 1,4-6,8,14 ve nadir ya da tehdit tespiti üzerinde duruldu 12,13,15 ve mesocosms 11,12.
İkinci yaklaşım, "metabarcoding" olarak adlandırılır ve Edna metabarcoding taksonomik çeşitli örnekleri arasında, bir gen bölgesini coamplify PCR primerleri, bir ya da birden fazla setleri kullanır. Bu dizin ve adaptör ek kütüphane hazırlanması tarafından takip edilir ve dizin kütüphaneler, yüksek verimli, paralel dizilemesi ile analiz edilmektedirplatformu. Son zamanlarda Miya ve ark., 12 ( "MiFish" olarak anılacaktır) balıklardan Edna metabarcoding için evrensel PCR primerleri geliştirdi. MiFish primerler taksonomik familya, cins ve bazı yakından ilgili Petkim'de hariç türlere balıklar belirlemek için yeterli bilgi içeren mitokondrial 12S rRNA geninin (163-185 bp), bir hiper-değişken bölgesini hedef. Edna metabarcoding bu primerlerin kullanımı ile Miya ve ark., 12 akvaryum yakın bilinen türlerin kompozisyonu ve mercan resifleri ile akvaryum tankları 230'dan fazla subtropikal deniz türleri tespit edildi.
metabarcoding protokolünü optimize balıklardan edna konsantrasyon düzeyleri değişen doğal deniz suyu karşılamak için, biz MiFish primerleri bazen sonradan kütüphane hazırlanması için hedef bölgeyi yükseltmek için başarısız olduğunu fark etmiş. Bu başarısız PCR amplifikasyonu daha muhtemel nedenlerinden biri TE yeterli miktarda olmamasıfiltre edilmiş su ve küçük miktarlarda ihtiva mplate DNA (örneğin 1-2 L). Belirli bir taksonomik grup edna konsantrasyonu büyük su hacimleri (> 1-2 L), filtrasyon amplifikasyonu önce bilinemez olmasına rağmen olur kıt balık bolluğu ve biyokütle gibi sucul ortamlarda daha Edna toplamak için basit ve etkili bir araç olabilir açık okyanus ve derin deniz ekosistemleri.
Disk fiber filtrelere Bağıl geleneksel balık edna araştırma 16 bir dizi kullanılır, filtre kartuşları 17 tıkanma önce büyük su hacimleri barındıran avantajına sahiptir. Aslında, yeni bir çalışma büyük hacimli (> 20 L) filtre kartuşları 18 kullanılarak kıyı deniz suyu numunelerinin filtrasyon gösterdi. Buna ek olarak, ayrı ayrı paketlenmiş ve steril ve deneysel iş akışının birkaç adım böylece laboratuvar 19 bulaşma olasılığını azaltarak, filtre konut yapılabilir vardır. İkincisiözelliği büyük deneysel 20,21 zorluklar arasında hangi bulaşma riski kalır edna metabarcoding için kritik öneme sahiptir. Filtre kartuşları bu teknik avantajlara rağmen, iki istisna 8,15 ile balıkların Edna çalışmalarında kullanılan olmamıştır.
Burada konut kesip açmak zorunda kalmadan kendi filtreden Edna filtre kartuşu ve çıkarma ile su örneklerinin filtrasyonu için bir protokol sağlar. Biz de su hacimleri (≤4 L veya> 4 L) bağlı olarak iki alternatif su filtrasyon sistemleri sağlamaktadır. Yeni geliştirilen protokol performansı ve Araştırma grubumuzda 12,14,22,23 bir cam elyaf filtre kullanılarak önceden kullanılan protokol karşılaştırmak için, biz Edna büyük bir akvaryum tankı deniz suyunun analizini metabarcoding gerçekleştirmek (7500 m 3 ) bilinen türlerin bileşimi ile ve temsilcisi sonuçları olarak iki protokol türetilen tespit türlerin sayısını gösterir. Bu protokol, Holarak balıklardan Edna metabarcoding için geliştirilmiş, ancak diğer organizmalardan Edna de uygulanabilir olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol, su örnekleme ve metabarcoding yöntemleri ile uğraşmaz. Su çalışma amaçlı 16 bağlı olarak farklı şekillerde örneklenmiş ve görmek Miya ve ark., 12 MiFish primerler kullanılarak metabarcoding yöntemlerinin ayrıntılı bilgi için olabilir. örneklenen su çok soğuk tutulur ve Edna bozulmasını önlemek için birkaç saat içinde süzülür gerektiğini unutmayın. Ayrıca, bu protokol, bir döner karıştırıcı ve bir kuluçka kullanılmasını içerir dikkat ve ikinci önceki alacak kadar büyük olması gerekmektedir. Buna ek olarak, bir santrifüj konik borular sonrası filtrasyon filtreden kalan sıvıyı çıkarmak için, sırasıyla, kartuş içinde edilen DNA toplamak için vazgeçilmezdir hem 15 ml ve 50 ml barındırabilir.
1. Vida Kapağı ve 1 L Plastik Çanta İşleme
NOT: filtrasyon hacmi> 4 L ise bu adımı atlayın
- bir vida, C dairesinin merkezinde bir delik delinbir erkek luer-lock konnektörü çıkan boru ile aynı çapta (4.8 mm) ap (tek kullanımlık 1 litrelik plastik torbaya bağlı). Çapraz pense kullanarak filtrasyon sonrası başlık içinde suyun küçük bir miktarının tıkanmasını önlemek için uygun bir uzunluk (yaklaşık. 3 mm) erkek luer kilit bağlayıcısı tüpünü kısaltır.
- sırasıyla, erkek luer-lock konnektörü alt ve yüzey hem polietilen (PE) ve polipropilen (PP) için özel bir yapıştırıcı tutkal sürün ve kapağını kapatın. İyi yapıştırma için birkaç dakika (üreticinin talimatlarına bakın) bekleyin.
- vidalı kapak deliğine erkek luer kilit bağlantısını takın. iki bölümden (genellikle> 24 saat) tam yapıştırma kadar bekleyin. Kullanmadan önce% 10 ticari ağartıcı (ca.% 0.6 sodyum hipoklorit) ile erkek luer-lock konnektör ile vidalı kapak sterilize edin.
- Bir mes onu asmak için 1 litrelik plastik torba iki alt köşelerindeki iki deliklerh paneli (adım 3). delik çapı örgü panelinden sivri uçların daha büyük olduğundan emin olun.
Filtrasyon Sistemi 2. Montaj
- Bir aspiratör pompasının giriş konnektörüne yüksek vakum tüp takın ve bir manifolda Hortumun diğer ucunu. Manifoldunun üç kırmızı t-vanaları "kapalı konuma" (yani, yatay) içinde olduğundan emin olun.
- eldiven temiz bir dizi giyen, sırasıyla, uydurma bir kadın luer yerleştirin ve filtrasyon için vakum lastik boru üst ve alt uçlarında bir vakum konektörü.
- Dikkatle filtre kartuşunun bir çıkış noktasına uygun dişi luer ekleyin ve bir silikon durdurucu vakum konektörü takın.
Filtre Kartuşu kullanarak Su Örnekleri (≤4 L) 3. Filtrasyon
NOT: filtrasyon hacmi> 4 L Bu filtrasyon sistemi ise bu adımı atlayın kendi başına ayakta durabilen paneli f gerektirirya da 1 L su ile dolu plastik torba asılı. Bir örgü paneli, çoklu çatallar ve panel için bir stand, çevrimiçi mağazalardan temin, bu üniteyi montaj için yararlı olacaktır. giriş Otoklav ve kullanılmadan önce filtre kartuşu için luer kapaklar çıkış.
- plastik torba içine 1 L örneklenmiş su dökün ve erkek luer-lock konnektör ile vidalı kapağını kapatın.
- Dikkatle plastik torba erkek luer-lock konnektör ile birleştirilmiş filtre kartuşunun bir giriş portuna bağlamak. Luer-lock konnektör fazla sıkmayın; pompalama başladığında, aksi takdirde ünite sızdırıyor. Tüm bağlantıları örgü panelinden plastik torba asılı önce güvenli olduğundan emin olun.
- Dikkatle örgü panelinden iki çatal uç filtre kartuşu ile bir plastik torba takılmak ve manifold arasında bir giriş portuna bir silikon tıpa yerleştirin.
- aspiratör açın. filtrasyon için kırmızı t-vanalarını açın. Filtre kartuşu kuruyana kadar t manifoldu çalıştırıntavuk kapalı konuma kırmızı t-vanayı çevirin.
- su istenilen miktarda süzülür kadar 3,1-3,4 adımları tekrarlayın.
NOT: subtropikal mercan resifleri alınan 1 L su için, filtrasyon için yaklaşık üç dakika sürer. - Dikkatle plastik torba ve vakum konnektörü filtre kartuşunu çıkarın.
- giriş ve çıkış luer kapaklarla kartuşun her iki ucunu kap.
- uygun hızlı kuruma ve non-bulaşması etiketlemesi için bir çözücü geçirmez kalem kullanarak kartuş ve giriş luer kapağını etiketleyin.
- DNA ekstraksiyon önce -20 ° C'de filtre kartuşunu saklayın.
Su 4. Filtreleme (> 4 L) Filtre Kartuşu kullanarak Örnekleri
Not: su filtrasyon hacmi L. Bu filtrasyon sistemi bir vana ve tek kullanımlık 10 ml pipet ile donatılmış bir 10 L kitap şişe gerektirir ≤4 ise bu adımı atlayın. 10 ml pipet ucu (15.0 mm) bir iç çapa ve ucu bir konikucu, sırasıyla, filtre kartuşunun bir valf (15.0 mm) dış çapı ile giriş ağzına uygun olmalıdır. Her iki bağlantı bir sürtünme filtrasyon esnasında güvenli korunur. Kullanmadan önce% 10 ticari ağartıcı (yaklaşık% 0.6 sodyum hipoklorit) ile pipet sterilize edin.
- Kitap şişede alınan su numunelerinin uygun bir miktar hazırlayın. Sıkıca 10 L kitap şişe vananın içine 10 ml pipet yerleştirin.
- Sıkıca pipet ucuna filtre kartuşunun çıkış noktası yerleştirin ve manifold giriş portuna silikon tıpa yerleştirin. aspiratör açın. filtrasyon için kırmızı t-vanalarını açın. Filtre kartuşu kuruyana kadar manifoldu çalıştırın, daha sonra kapalı konuma kırmızı t-vanayı çevirin.
NOT: subtropikal dış mercan resifleri alınan deniz suyu 10 L için, filtrasyon için yaklaşık 30-40 dakika sürer. - Dikkatle plastik torba ve vakum konnektörü filtre kartuşunu çıkarın. Cap hemgiriş ve çıkış luer kapaklarla kartuşun sona erer. uygun hızlı kuruma ve non-bulaşması etiketlemesi için bir çözücü geçirmez kalem kullanarak kartuş ve giriş luer kapağını etiketleyin. DNA ekstraksiyonu önce -20 ° C'de filtre kartuşunu saklayın.
Filtre Edna 5. Ekstraksiyon
NOT: adım 4 ve 5, biz büyük ölçüde kit tarafından sağlanan "çekirdekli kan" için protokol sonrasında ticari kiti kullanın. Basitlik için, biz tek bir kartuş işlenmesi için prosedürü açıklar. Uygulamada, bir defada işlemi 8 (veya santrifüj sayısını) veya daha az filtre tavsiye ederiz.
- 56 ° C'ye kadar bir inkübatör önceden ısıtın.
- tüpten menteşeli kapağı keserek 2.0 ml tüp hazırlayın. Kapağı atın.
NOT: Bu tüp filtresi kalan sıvı için bir toplama tüpü olarak kullanılır. - Filtre kartuşunun giriş (NOT çıkışı) diş kapağını çıkarın ve giriş deliği i eklemektoplama tüpü nto. Sıkıca bir kendi kendine kapanan filmi kullanılarak kartuş toplama tüpünün arasında bir bağlantı mühür.
- 15 ml konik tüp santrifüj adaptörüne kombine birimi yerleştirin. Filtrede geri kalan sıvının çıkması için 1 dakika için 5000 x g'de kartuşu santrifüjleyin.
- filtre kartuşu toplama tüpü çıkarın ve tüp atın. Yeniden kapak kartuş giriş portu.
- (; Olmayan kiti tarafından sağlanan fosfat tamponlu tuzlu su) ve 200 ul AL tampon 20 ul proteinaz-K çözeltisi karışımı, 220 ul PBS hazırlayın.
NOT: Filtre kartuşu karışımı dört kat hacimleri kapasitelidir (. Ca 1.8 ml). - giriş kapağını çıkarın ve bir pipet kullanarak filtre kartuşunun içine karışımı (440 ul) ekleyin. pipet sadece membranın üzerine kartuşunun içindeki görünür böylece giriş portuna tamamen pipet yerleştirin.
- -Cap Yeniden giriş portu ve filtre araba koyunbir döner çalkalayıcıda kartuşunu.
- 56 ° C'de önceden ısıtılmış bir inkübatör döner sallayıcı yerleştirin ve 20 dakika boyunca 20 rpm bir hızda bir karıştırıcı üzerinde açın.
- İnkübasyon sırasında, yeni bir 2.0 ml'lik tüp hazırlanması uygun bir çözücü dayanıklı kalemle tüp etiket ve 50 ml konik bir tüp içinde yerleştirin.
Not: Eski (2.0 mi) ve ikinci tüp (50 mi) ile ekstre DNA'nın toplanması için, sırasıyla, 2.0 mi tüpünü tutmak için kullanılır. - inkübasyondan sonra, giriş kapağını çıkarın ve 50 ml konik tüp içinde 2.0 ml tüp içine (çıkış DEĞİL) kartuşun limanı girişini takın. bir vidalı başlık ile 50 ml konik tüp kapatın.
- 1 dakika kartuştan ekstre DNA'nın toplanması için 5000 x g'de 50 ml konik tüp santrifüjleyin. Filtre kartuşu ve sterilize forseps kullanarak 2.0 ml tüp çıkarın ve tüp kap. Filtre kartuşunu atın.
Ayıklanan DNA 6. saflaştırılması
NOT: 100 ul tampon AE yerine ticari kitin kılavuzda belirtilen 200 ul Edna Zehir.
- Yukarıdaki aşama (yaklaşık 440 ul) 2.0 ml'lik bir tüp içinde edilen DNA 200 ul etanol (% 96-100) ilave edildi ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır.
- Pipet 2 ml'lik bir toplama tüpü içine yerleştirilen bir sıkma sütuna karışımı ile gerçekleştirilmektedir. 1 dakika için 5000 x g'de santrifüjleyin. Flow-through ve toplama tüpü atın.
- Yeni 2 ml'lik bir toplama tüpü içinde spin kolon yerleştirin 5000 x g, 1 dakika süre ile 500 ul tampon Aw1 ve santrifüj ekleyin. Flow-through ve toplama tüpü atın.
- g, yeni bir 2 ml'lik bir toplama tüpü içinde spin kolon alındı X 20,000 3 dakika boyunca 500 ul tampon Aw2 ve santrifüj ekleyin. Flow-through ve toplama tüpü atın.
- (Değil kit tarafından sağlanan) yeni bir 1.5 ml tüp hazırlayın ve uygun hızlı kuruma ve etiketleme olmayan bulaşması için su geçirmez bir kalem kullanarak tüp etiket. spin kolon t aktar1.5 ml tüp o.
- spin kolon membran merkezine 100 ul tampon AE ekleyerek DNA Zehir. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 1 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüjlenir.
- spin kolon atın ve tüp kap. -20 ° C'de arıtılmış, DNA saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu MiFish primerleri gibi kuşlar ve memeliler gibi bazı balık olmayan omurgalılar, hedef bölge coamplify çünkü aynı boyutta PCR ürünleri ile, izole etmek ve çıkarılan toplu Edna sadece balık Edna ölçmek teknik olarak zordur (ca. 170 bp ) 12. Bunun yerine balık Edna nicel, biz filtrasyon ve DNA ekstraksiyon iki farklı yöntem kullanılarak bilinen türlerin kompozisyonu ile bir akvaryum tankından Edna analizini metabarcoding MiFish gerçekleştirmek ve iki protokol kütüphane başına tespit edilen türlerin sayıları karşılaştırın. Bu basit deney titizlikle diğerleri üzerinde üstünlüğünü göstermek için "temsilcisi sonuçları" olarak değil, mevcut protokol fizibilitesini göstermek için tasarlanmıştır.
Biz, Okinawa Churaumi akvaryum, Okinawa, Japonya (26˚41'39 "N bir Kuroshio tanktan deniz suyu 30 L bir toplam örneklenmiş127˚52'41 "E). Kuroshio tankı 35 mx 27 mx 10 m ve 7500 m 3 olmak üzere toplam su hacminin) U x G x D (boyutlar, deniz megafauna sergileyen için tasarlanmıştır. Yaklaşık büyük 60 evler Kuroshio, Japonya tüm uzunluğu boyunca kuzeydoğuya akan batı sınır akımlarının biri etrafında alanlarına karakteristik ölçülü deniz balık türleri., önceki bir MiFish metabarcoding çalışmada Miya ve ark., 12 63 türün 61 (% 97) tespit edilmiştir ihtiva beş 2 L tuzlu su örneklerinden tankında.
Deniz suyunun filtrasyonu için, (gözenek boyutu = 0.45 mikron) ve cam elyaf diski filtreler (gözenek boyutu = 0.70 mm) filtre kartuşları kullanılır. Biz aynı anda dört su hacimleri (; toplam sekiz filtreler 1, 2, 3, ve 4 L) için iki protokollerini kullanarak aynı manifolduna deniz suyu süzülür. Deniz suyunun filtre edildikten sonra, aynı zamanda, iki filtre PCR dereceli su 1 L süzüldü (filter kartuşu ve negatif kontroller (iki filtre boşluklar) cam-elyafı filtre). Filtrelerin bu tür, biz aynı ticari kit istihdam ikisi de yeni ve daha önce kullanılan protokoller 12 kullanılarak Edna ekstre edildi. Miya vd de tarif edildiği gibi (iki negatif kontroller de dahil olmak üzere), 10 Edna'yı örneklerin toplam metabarcoding analizi MiFish tabi tutuldu. 12
Ve paired-end dizileme için adaptörleri eklemek, kısaca biz hedef bölge (. Ca 170 bp mitokondriyal 12S rRNA gen) yükseltmek için 1 yuvarlak PCR uygulandı. Sekiz Edna örneklerinde (iki negatif kontroller hariç) için, 10 PCR Her bir örnek (toplam 80 PCR) içinde tespit edilen türlerin sayısındaki değişimleri görmek için çoğaltır gerçekleştirdi. Biz de her sekiz Edna örneklerinde (toplam 16 PCR) filtreyi ve PCR boşluklar ekledi. Toplamda, biz 1-yuvarlak PCR 96 PCR ürünleri elde ve 2-yuvarlak P için şablon olarak kullanıldıÇift indeksleme için CR ve Miya ark aşağıdaki kütüphane hazırlanması için ek bağdaştırıcısı ekleme. 12
96 kütüphanelerin paired-end dizileme (2 x 150 bp) 42,995 ortalama (40539 filtre kartuşu okur ve 43121 cam elyaf filtre okur) kütüphanesinde başına okur ile 4.127.546 okur vermiştir. demultiplekslenmesi ve ham veri müteakip ön işleme sonra, 1.068.266 taksonomik atama için BLAST aramalar için tutuldu okur. Bu okur, 830.788 Kuroshio deposu (Tablo 1) içinde yer alan bu tür olarak tanımlanmıştır okunur. 830.788 okur ve 10 PCR için tespit edilen türlerin ortalama sayısı 4 L (filtre kartuşu) (Tablo 1) 55: 1 L (cam elyaf filtresi) 29 arasında değişen, sekiz Edna'yı örneklerinden çoğaltır itibaren 60 tankı tür tespit . Sekiz Edna örneklerinden iki boşlukları Oku sayılar 0'dan değişen küçük olduğunuTank türleri için 12.
1-4 L deniz suyu hacimleri arasında; Biz filtre kartuşu tespit türlerin sayısı cam elyafı filtreler (Şekil 1 ANCOVA, F = 381,8, p <0.001) anlamlı olarak daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Filtre kartuşu tespit türlerin sayısı cam elyafı filtreler daha ve her iki yöntemde de yaklaşık 1.5 kat daha fazla idi (ANCOVA, K = 164.2, p <0.001), süzüldü su hacmi artmış tespit türlerin sayısı.
(1), farklı malzemeler ile örneklenen su süzme (cam mikrofiber genel hidrofilik PVDF [poliviniliden diflorür]) ve / veya: filtre kartuşu tespit türlerin yüksek sayılar bir veya daha fazla deney iş akışı, aşağıdaki adımlardan kaynaklanabilecek (2) farklı nominal gözenek boyutları (0.4581; filtre kartuşları ve cam elyaf filtreler m vs 0.70 mikron) eski filtre üzerindeki balıklardan daha fazla Edna korumak olabilir; (3) önceden ısıtılmış bir inkübatörde, döner bir karıştırıcı kullanılması hareketsiz bir sıcaklıkta bir blok üzerinde yerleştirilmiş bir spin kolon katlanmış cam elyaf filtrelerinden daha filtre kartuşları daha fazla DNA verimi üretir; (4) filtre kartuşu santrifüjleme ile ekstre DNA'nın toplanması, farklı filtre malzemeleri ve / veya farklı santrifüj yöntemlerine bağlı olarak cam elyafı filtresinden göre daha etkilidir. Görünüşe göre, bir daha titizlikle tasarlanmış bir çalışma bu çalışmada filtre kartuşu ile tespit edilen türlerin sürekli daha fazla sayıda sorumlu faktörleri saptamak için gereklidir.
Şekil 1: MiFish Metabarcoding Ana içinde Filtreli Su Ciltler karşı Tespit Edilen Türler çizilmiştir Sayısı Kuroshio Tank, Okinawa Churaumi akvaryum. görülen bakteriler sayısından Edna'yı lizizi deposundaki türler ile sınırlandırılmıştır. deniz suyu 30 L, biz filtre kartuşları kullanılarak, 1, 2, 3 ve 4 L örnekleri, süzüldü ve cam elyafı filtre ve sırasıyla, mevcut ve daha önce tarif edilmiş protokoller uygulandığında 12 kullanan filtreleri Edna'yı ekstre edilmiştir. Biz PCR iki protokollerini kullanarak dört su miktarlar çoğaltır 10 MiFish metabarcoding analizi (çoklu türlerin aynı anda algılama) uygulandı. kutusunda yatay çubuk medyan temsil eder; Kutunun üst ve alt kenarları arası çeyrekleri karşılık, dikey çubuklar 1.5 x çeyrekleri karşılık, ve noktalar outliers temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/files/ftp_upload/54741/54741tbl1.jpg "/>
Tablo 1:.. Taksonomik Kompozisyon ve Kuroshio Tank Edna Örnekleri MiSeq Analizlerinde Tespit Edilen 60 Türlerin Oku Numaraları Sadece özel veritabanında referans dizileri ile tank içinde bulunan bu türler gösterilmiştir büyük halini görmek için tıklayınız Bu tablo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Su ve toprak gibi çevresel numuneler kullanılarak birçok metabarcoding çalışmalarında aşağıdaki gibi filtre kartuşunun sonrası filtrasyon tedavi genellikle 24,25: 1) açık kesilmesi veya el aletleri (boru kesici veya pense) ile konut çatlama; 2) kartuştan filtrenin kaldırılması; ve 3) DNA ekstraksiyonu için bir jilet ile küçük parçalar halinde filtre kesilmesi. yaygın olarak kullanılan, ucuz ticari kiti kullanılarak filtre kartuşunun mahfaza içinde böyle hantal ve zaman alıcı laboratuvarda kirlenme eğilimli prosedürleri, biz çalıştık birkaç DNA ekstraksiyon yöntemleri önlemek ve başarıyla olumlu ile mevcut protokol geliştirmiştir için Edna'yı metabarcoding analiz sonuçları (Şekil 1).
Bu protokol daha kritik adımlardan biri önceden ısıtılmış bir inkübatör bir döner sallayıcı kullanılmasıdır, bu daha sonra bir kütüphane HAZIRLIK için iyi DNA verimi sağlayabilenEdna'yı metabarcoding analizde tirme. uygun bir sıcaklıkta mahfaza içinde proteinaz-K çözeltisi sabit karıştırma muhtemelen filtre üzerinde tutulan parçacıkları DNA ekstraksiyonu kolaylaştırır. Bu protokol, döner bir karıştırıcı ve bir kuluçka hem kullanımını kapsamaktadır Bununla birlikte, dikkat ve ikinci önceki karşılamak mümkün olmalıdır. Buna ek olarak, bir santrifüj bu 15 ml ve 50 ml konik tüp, sırasıyla sonrası filtrasyon filtresinden kalan sıvı ayrılması ve kartuş içinde ekstre DNA'nın toplanması için vazgeçilmezdir barındırabilir.
kartuşunu açtıktan kesmek zorunda kalmadan bu tür DNA ekstraksiyon elde etmek için başka bir seçenek yoktur (Malzemeleri / Reaktifler Tablo bakınız). kit DNA ekstraksiyonu için herhangi bir enzim kullanmaz; bunun yerine, kordon dayak ile ilave mekanik lizisi ile kombinasyon halinde özel bir liziz tamponu kullanılır. ılıman kıyı Pasifik'ten doğal deniz suyu dayalı ön deneylerde, biz denemeyinizticari kit kullanılarak mevcut protokolün bir prototip ile birlikte bu kiti kullanılarak ted DNA ekstraksiyon. ikinci prototip protokolü kullanılması ile, sürekli 1-tur PCR için jel elektroforezi belirgin amplifikasyon ürünlerini tanıdı. Buna karşılık, biz üretici tarafından sağlanan iki alternatif protokolleri takip rağmen (/ Reaktifler Tablo Malzemeler bakınız) farklı bir kit kullanımı yoluyla herhangi bir PCR ürünlerini alamadı. (/ Reaktifler Tablo Malzemeler bakınız) PCR inhibitörü kaldırma adımları ikinci seti iki protokollerde yer göz önüne alındığında, bu gözlem şablonda DNA yeterli miktarda eksikliği göstermektedir. İkinci kiti kullanılarak çevresel örneklerden tür nispeten düşük DNA ürünleri son çalışmalarda 26,27 bildirilmiştir.
Mevcut protokolde, biz, büyük nominal gözenek büyüklüğü (0,45 mikron) ile filtre kartuşu seçmiş su mikrobiyal çalışmaları Bayağı süreLly büyük gözenek boyutu filtreleri (1 mikron ila 3) 28 ile süzme öncesi sonra küçük bir (0,22 mikron) kullanın. , Gözenek boyutu cam elyafı filtreler (0.70 mikron) biz geleneksel 12,14 çalışmaları daha önceki Edna kullanmış bu çok daha yakın olduğunu 1): bizim seçim nedenleri basit ve anlaşılır, ve teorik argümanlara dayalı olmayan 22,23; 2) suyun büyük hacimleri küçük olandan süzülmüş izin bekleniyor. İkinci özellik kıt balık bolluğu ve biyokütle ile açık okyanus ve derin deniz ekosistemlerinde geçiren mevcut araştırma projeleri için özellikle önemlidir. Aslında, herhangi bir fark tıkanma Kuroshio tankından deniz suyu, birbirinden bağımsız olarak örneklenmiş 10 L başarılı filtrasyon teyit (sonuçlar gösterilmemiştir). Ancak son zamanlarda, Turner ve ark., 29 göstermiştir ki 0.2 mikron filtrasyon maksimize sazan edna yakalama (% 85 ±% 6) toplam (yani olmayan hedef) en aza indirerek EdnaYakalama (% 48 ±% 3), ancak filtre az 250 ml bir örnek hacmi, bu gözenek boyutuna sınırlı tıkanması. Ek çalışmalar edna balık bolluk ve biyokütle çeşitli düzeylerde ile sucul ortamlarda çeşitli türde metabarcoding için filtre kartuşunun optimum filtre gözenek boyutu ve su filtrasyon hacmini belirlemek için gereklidir.
Bu protokolün sınırlamalardan biri su filtreleme güç kaynağı mevcuttur laboratuarda yapılmalıdır olmasıdır. Bir organizmadan döken ve sadece (gün saat) su ortamlarında kısa bir süre için 30 tespit edilebilir olduğu gibi nedeniyle DNA sınırlı kimyasal stabilite, Edna'yı kısa düşmeye başlar. Nedenle Edna önemli bozulmasını önlemek için toplandıktan sonra hemen su numunesi filtre idealdir. Bu bağlamda, filtre kartuşu kullanarak on-site filtreleme yöntemleri gelişmeler umut verici bir sonraki adım olacaktır. taşınabilirlik ve sterilitFiltre kartuşunun y daha doğru edna metabarcoding balık topluluğunun tür kompozisyonu yansıtabilir daha sağlam Edna sağlayacaktır bünyesinde filtrasyon yöntemlerinin geliştirilmesini sağlamak. Filtre kartuşları üzerinde toplanan Edna ticari bir reaktif 31 enjeksiyonu ile stabilize edilebilir (/ Reaktifler Tablo Malzemeler bakınız) ya da Longmire laboratuvara geri getirmeden önce kartuşun içine 32 tampon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
