Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
correlazione spettroscopia di fluorescenza (FCS) è una tecnica potente per studiare la diffusione delle molecole all'interno delle membrane biologiche con elevata risoluzione spaziale e temporale. FCS può quantificare la concentrazione e diffusione molecolare coefficiente di molecole marcate fluorescenza nella membrana cellulare. Questa tecnica ha la capacità di esplorare le caratteristiche di diffusione molecolare delle molecole nella membrana plasmatica di cellule immunitarie in stato stazionario (cioè, senza processi che influenzano il risultato durante il tempo di misurazione effettiva). FCS è adatto per studiare la diffusione di proteine che vengono espresse a livelli tipici per proteine più endogene. Qui, un metodo semplice e robusto per determinare la velocità di diffusione delle proteine di membrana cellulare sui linfociti primari è dimostrata. Un modo efficace per eseguire misure su cellule vive colorate con anticorpo e osservazioni comuni che si verificano dopo l'acquisizione sono descritti. I progressi recentinello sviluppo di coloranti fluorescenti fotostabili può essere utilizzato coniugando anticorpi di interesse appropriarsi coloranti che non candeggiare ampiamente durante le misurazioni. Inoltre, questo permette la rilevazione di entità diffondenti lentamente, che è una caratteristica comune di proteine espresse nelle membrane cellulari. La procedura di analisi per estrarre i parametri di concentrazione e di diffusione molecolare dalle curve di autocorrelazione generate viene evidenziato. In sintesi, viene fornito un protocollo di base per misurazioni FCS; può essere seguito da immunologi con una comprensione della microscopia confocale ma nessun'altra esperienza precedente di tecniche per la misurazione di parametri dinamici, come i tassi di diffusione molecolare.
Introduction
Molte funzioni cellule immunitarie si affidano a diffusione molecolare e interazioni all'interno delle membrane. Membrane biologiche sono complesse, e molti fattori che possono essere importanti per la funzione delle cellule immunitarie possono influenzare la velocità di diffusione traslazionale delle proteine all'interno delle membrane cellulari 1. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule natural killer (NK), i linfociti appartenenti al sistema immunitario innato, mostrano la diffusione differenziale delle due proteine studiate a livello della membrana cellulare a seconda dello stato di attivazione delle cellule NK 2.
correlazione spettroscopia di fluorescenza (FCS) è una tecnica che è in grado di quantificare le velocità di diffusione molecolare all'interno delle membrane biologiche. Riporta la velocità di diffusione media di fluorescente molecole in un volume fisso, in genere al centro di un microscopio confocale. Si basa sulla misura delle fluttuazioni della fluorescenza che si verificano al movimento molecolareun sistema in stato stazionario. FCS è stato ampiamente utilizzato per studiare la diffusione di coloranti fluorescenti e proteine, sia in soluzione che all'interno delle membrane lipidiche. Altri parametri di output che influenzano la velocità di diffusione può anche essere studiati indirettamente in questo modo (ad esempio, i cambiamenti conformazionali di proteine o interazioni delle molecole sulle membrane delle cellule) 3, 4. FCS distingue rispetto ad altre tecniche grazie alla sua elevata sensibilità, consentendo la possibilità per il rilevamento singola molecola. Funziona bene per concentrazioni molecolari nel nanomolari alla gamma millimolare, che è tipico per livelli di espressione endogeni di maggior parte delle proteine 5. Inoltre, FCS può dare un'approssimazione del numero assoluto delle proteine all'interno del volume studiati, mentre la maggior parte altre tecniche solo dare informazione relativa livelli di espressione della proteina. Altri metodi per misurare i tassi di diffusione molecolare all'interno delle membrane includono fluorecupero rescence dopo photobleaching (FRAP), singola particella di monitoraggio (SPT), multipla pinhole FCS, e di correlazione immagine metodi. FRAP e correlazione immagine metodi sono tecniche di ensemble, che in genere non danno informazioni sul numero assoluto di molecole 10. Rispetto al SPT, il throughput di FCS è maggiore per quanto riguarda caratterizzare la media della popolazione. L'analisi è anche meno impegnativa in quanto il tasso medio di diffusione delle molecole presenti nel fuoco del laser viene misurata, piuttosto che il tasso di singole molecole. Inoltre, a meno microscopi specializzati sono disponibili 11, SPT non può fornire alcuna informazione circa concentrazioni, poiché etichettatura serie SPT deve essere molto bassa per consentire l'identificazione di molecole singole. D'altra parte, FCS richiede le molecole sotto studio per essere mobili. E 'semplicemente non rilevare eventuali frazioni immobile putativi o molecole si muovono molto lentamente. La velocità di diffusione delle molecole cherisiede nel fuoco più di circa un decimo del tempo di acquisizione non verrà rappresentata correttamente misurazioni FCS 3, 12. Pertanto, coefficienti di diffusione registrati da FCS tendono ad essere più veloce di velocità di diffusione riportati da tecniche come FRAP e SPT, dove le frazioni close-to-immobile e molto lenti sono presi in considerazione pure. SPT darà anche una descrizione più dettagliata della variabilità dei tassi di diffusione nella popolazione molecolare di FCS sarà.
FCS quantifica la fluttuazione di intensità di fluorescenza nel tempo all'interno del volume eccitato. Nel caso di misure di membrana, questo si traduce in zona illuminata della membrana. In questo lavoro, utilizziamo il fatto che tali fluttuazioni sono indotti da molecole espongono diffusione browniano e si muovono quindi in e fuori del volume di eccitazione. Ci sono anche diverse altre possibili fonti per il fluctuazioni nel segnale di fluorescenza, come lampeggiante o la presenza di uno stato di tripletto nei fluorofori, effetti ambientali, vincolante unbinding del ligando, o movimento di tutta la membrana cellulare. Queste fonti di errore putativi devono essere presi in considerazione quando si progetta un esperimento FCS al fine di interpretare con precisione i risultati di 12, 13. In genere, i tassi di diffusione laterale nelle membrane biologiche sono bassi a causa di affollamento e le interazioni, sia tra proteine di membrana e tra le proteine e il citoscheletro. Storicamente, l'uso di FCS in membrane è pertanto stata ostacolata dalla mancanza di fluorofori fotostabili, che sono necessari per evitare sbiancamento durante i tempi di transito estesi attraverso la messa a fuoco di eccitazione 14. Tuttavia, oggi, ci sono molte opzioni per adatti coloranti foto-stabile. Miglioramenti significativi nella rilevatori e altro hardware consentono anche l'individuazione di prote fluorescenteins e coloranti di luminosità inferiore. Qui, un protocollo di base per l'applicazione di FCS utilizzando linfociti primari murini, dove la proteina di interesse è etichettato con una fluorescente contrassegnati anticorpi, è descritto. Un approccio per adattarsi alle curve di autocorrelazione per estrarre il coefficiente di diffusione e la densità molecolare è anche mostrato. Il protocollo si propone di essere facilmente seguita da immunologi con nessuna esperienza precedente di tecniche per studiare la diffusione delle molecole. Tuttavia, si prevede una conoscenza di base di microscopia confocale (per ottenere questa conoscenza di base, vedi riferimento 15). Questo protocollo può abbastanza facilmente essere adattato ad altre cellule in sospensione, entrambe le linee cellulari e cellule primarie. Per gli utenti più esperti FCS, esistono più raffinati metodi di analisi, alcuni dei quali sono descritti nella discussione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo per FCS può essere utilizzato per la valutazione delle dinamiche molecolari di molecole di superficie su tutti i tipi di cellule immunitarie (murina, umana, o altre specie). Misure FCS spazio-temporali dinamica molecolare fino a risoluzione di una singola molecola in cellule vive. La densità molecolare, nonché le dinamiche dei tassi di diffusione e di clustering delle proteine di interesse, possono essere estratte dalle curve di autocorrelazione.
L'etichettatur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Vladana Vukojević, Centro di Medicina Molecolare, Karolinska Institutet per la manutenzione dello strumento Zeiss ConfoCor 3 e per suggerimenti utili per quanto riguarda le misure di cella. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dal Vetenskapsrådet (concessione numero 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, e da Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
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