A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) er en kraftfuld teknik til undersøgelse af diffusion af molekyler i biologiske membraner med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. FCS kan kvantificere den molekylære koncentration og diffusionskoefficient fluorescensmærkede molekyler i cellemembranen. Denne teknik har evnen til at udforske de molekylære diffusion karakteristika molekyler i plasmamembranen af immunceller i stationær tilstand (dvs. uden processer, som påvirker resultatet under selve måletid). FCS er god til at undersøge udbredelsen af proteiner, som udtrykkes ved niveauer typiske for de fleste endogene proteiner. Her er en enkel og robust metode til at bestemme diffusionshastigheden af cellemembran proteiner på primære lymfocytter demonstreret. En effektiv måde at udføre målinger på antistof-farvede levende celler og almindeligt forekommende observationer efter erhvervelsen beskrevet. De seneste fremskridti udviklingen af foto-stabilt fluorescerende farvestoffer kan anvendes ved at konjugere antistofferne af interesse til passende farvestoffer, der ikke blege udførligt under målingerne. Desuden tillader dette til påvisning af langsomt spredende enheder, som er et fælles træk ved proteiner udtrykt i cellemembraner. Analysen procedure at udtrække molekylære koncentration og diffusion parametre fra de genererede autokorrelationsfunktioner kurverne fremhæves. Sammenfattende er en grundlæggende protokol for FCS målinger leveres; det kan efterfølges af immunologer med en forståelse af konfokal mikroskopi, men med nogen anden tidligere erfaring med teknikker til måling af dynamiske parametre, såsom molekylær diffusion satser.
Mange immunceller funktioner er afhængige af molekylær diffusion og interaktioner inden membraner. Biologiske membraner er komplekse, og mange faktorer, der kan være vigtige for funktionen af immunceller kan påvirke hastigheden af translationelle diffusion af proteiner i cellemembraner 1. Vi har for nylig vist, at naturlige dræberceller (NK-celler), lymfocytter, der tilhører det medfødte immunsystem, udviser differentieret diffusion af to undersøgte proteiner på cellemembranen afhængigt af tilstanden af NK-celle-aktivering 2.
Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) er en teknik, der er i stand til at kvantificere molekylære diffusionshastigheder inden biologiske membraner. Det rapporterer den gennemsnitlige diffusionshastighed af fluorescensmærkede molekyler i et bestemt volumen, typisk i fokus i et konfokalt mikroskop. Den er baseret på måling af udsvingene i fluorescens, der forekomme ved molekylær bevægelse iet system i steady state. FCS har været meget anvendt til undersøgelse af diffusion af fluorescerende farvestoffer og proteiner, både i opløsning og i lipidmembraner. Andre output parametre, der påvirker diffusionshastigheden kan også indirekte undersøgt på denne måde (fx konformationelle ændringer af proteiner eller interaktioner af molekyler på cellemembraner) 3, 4. FCS står i forhold til andre teknikker på grund af dens høje følsomhed, hvilket vil give mulighed for enkelt-molekyle detektion. Det fungerer godt for molekylære koncentrationer i det nanomolære til millimolære område, hvilket er typisk for endogene ekspressionsniveauer af de fleste proteiner 5. Endvidere kan FCS giver en tilnærmelse af det absolutte antal proteiner i den undersøgte volumen, mens de fleste andre teknikker kun give relativ oplysninger om protein ekspressionsniveauerne. Andre fremgangsmåder til måling af molekylære diffusionshastigheder inden membraner indbefatter fluorescence inddrivelse efter fotoblegning (FRAP), enkelt partikel sporing (SPT), flere pinhole FCS, og image korrelation metoder. FRAP og image korrelation metoder er ensemble teknikker, som generelt ikke giver oplysninger om det absolutte antal af molekyler 10. Sammenlignet med SPT, gennemløb af FCS er højere i forhold til at karakterisere gennemsnit befolkningen. Analysen er også mindre krævende, da den gennemsnitlige diffusionshastighed af molekylerne til stede i laserfokus måles, snarere end hastigheden af enkelte molekyler. Også, medmindre specialiserede mikroskoper er tilgængelige 11, SPT kan ikke give nogen oplysninger om koncentrationer, da standard SPT mærkning skal være meget lav til at gøre det muligt at identificere enkelte molekyler. På den anden side, FCS kræver molekylerne under behandling, til at være mobile. Det vil simpelthen ikke afsløre eventuelle formodede immobile fraktioner eller molekyler bevæger sig meget langsomt. Diffusionshastigheden af molekyler,opholde sig fokus længere end ca. en tiendedel af købet tid vil ikke være korrekt repræsenteret i FCS målinger 3, 12. Derfor diffusionskoefficienter indspillet af FCS tendens til at være hurtigere end diffusion satser rapporteret fra teknikker som FRAP og SPT, hvor der træffes de tæt-på-immobile og meget langsom fraktioner i betragtning. SPT vil også give en mere detaljeret beskrivelse af variabiliteten af diffusion satser inden for den molekylære befolkning end FCS vil.
FCS kvantificerer udsving i fluorescens intensitet over tid inden for ophidset volumen. I tilfælde af membran målinger svarer dette til det belyste område af membranen. I dette papir, udnytter vi det faktum, at sådanne udsving er fremkaldt af molekyler udviser brownske diffusion og er således bevæger sig ind og ud af excitation volumen. Der er også flere andre mulige kilder til udsvingoner i fluorescenssignalet, såsom blinkende eller tilstedeværelsen af en triplet tilstand i fluoroforer, miljømæssige virkninger, binding-uforpligtende af liganden, eller bevægelse af hele cellemembranen. Disse formodede fejlkilder skal tages i betragtning ved udformning af et FCS eksperiment for nøjagtigt fortolke resultaterne 12, 13. Typisk laterale diffusionshastigheder i biologiske membraner er lav på grund af fortrængning og interaktioner, både mellem membranproteiner og mellem proteiner og cytoskelettet. Historisk set har anvendelsen af FCS i membraner således blevet hæmmet af manglen på foto-stabil fluoroforer, som er nødvendige for at undgå blegning i den forlængede transittider gennem excitation fokus 14. Men i dag, er der masser af muligheder for egnede foto-stabil farvestoffer. Væsentlige forbedringer i detektorer og andet hardware tillader også påvisning af fluorescerende proteins og farvestoffer med lavere lysstyrke. Her, en grundlæggende protokol for anvendelse af FCS ved anvendelse murine primære lymfocytter, hvor proteinet af interesse er mærket med en fluorescerende mærkede antistof, er beskrevet. En tilgang til at passe til autokorrelationsfunktioner kurver for at ekstrahere diffusionskoefficienten og den molekylære tæthed er også vist. Protokollen har til formål at blive let efterfulgt af immunologer uden tidligere erfaring med teknikker til at studere diffusion af molekyler. Dog forventes en grundlæggende forståelse af konfokal mikroskopi (for at få denne grundlæggende forståelse, se reference 15). Denne protokol kan relativt let tilpasses andre suspensionsceller, begge cellelinier og primære celler. For mere erfarne FCS-brugere, findes mere raffinerede analysemetoder, hvoraf nogle er beskrevet i diskussionen.
Denne protokol for FCS kan anvendes til vurdering af de molekylære dynamik overflademolekyler på alle typer immunceller (murine, humane eller andre arter). FCS måler spatio-temporale molekylær dynamik ned til enkelt-molekyle opløsning i levende celler. Den molekylære tæthed, samt diffusionshastigheden og klyngedannelse dynamik proteinerne af interesse, kan ekstraheres fra autokorrelationsfunktioner kurver.
Den fluorescerende mærkning er af central betydning for en vellykket FCS ekspe…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Vladana Vukojević, Center for Molekylær Medicin, Karolinska Institutet for vedligeholdelse af Zeiss Confocor 3 instrument og for nyttige tips om celle målinger. Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud fra Vetenskapsrådet (tilskud nummer 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, og fra Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
Clone JR9.318 | |||
Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
Clone 34.5.8S | |||
MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |