Abstract
تكون المعيدة هي أول مجموعة من الفعاليات الحيوية شكليا التي تحدث أثناء التطور الجنيني من الحيوانات متعددة الخلايا مثل ذبابة الفاكهة. يتم التعرف على هذا التغيير الصرفي أيضا الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT). ويرتبط ديسريغولاتيون من EMT يعانون من التليف والانبثاث السرطان. وهناك أدلة الناشئة التي EMT مسيطر عليها من قبل عدد من الآليات الجزيئية. على هذا النحو، فإن العديد من الجينات الرئيسية التي تتحكم في انقباض قمي ومن المعروف أيضا أن يكون من العوامل الهامة في EMT لوحظ في الانبثاث السرطان. مثل EMT خلال ذبابة الفاكهة تكون المعيدة، الخلايا الظهارية يمكن أن يتسبب في تغيير شكلها وإعادة برمجتها لإعادة توجيه مصير خلية تجاه مختلف أنواع الخلايا الأخرى. هنا نقدم طريقة التصوير قوية من ذبابة الفاكهة تكون المعيدة لفحص بدء الحركات الخلوية التخلق وتحديد مصير الخلايا خلال هذه المرحلة من التطور الجنيني. باستخدام هذه الطريقة، أن نحدد جالذراع إعادة ترتيب في وقت تكون المعيدة وإظهار أهمية انقباض قمي خلال المعيدة باستخدام GFP المسمى DE-كادهيرين.
Introduction
تكون المعيدة هي أول مجموعة من الفعاليات الحيوية شكليا التي تحدث أثناء التطور الجنيني من الحيوانات متعددة الخلايا مثل ذبابة الفاكهة 1،2. ومن المثير للاهتمام، شواهد تشير إلى أن هذه العملية ينظم من خلال التفاعل بين الآليات الميكانيكية والجزيئية 3. وعلاوة على ذلك، هو تورط الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، وهي عملية حاسمة في تكون المعيدة، وأيضا في عمليات الأمراض البشرية مثل سرطان خبيث 4-8. على هذا النحو، فإن العديد من الجينات التي تتحكم في انقباض قمي ومن المعروف أيضا أن تكون العوامل الرئيسية في EMT لوحظ في سرطان خبيث 9. وهكذا، انقباض قمي في وقت تكون المعيدة هو نموذج ممتاز للتحقيق في الآليات التنظيمية المشار إليها وتعزيز فهمنا لورم خبيث من السرطان. والاستفادة من هذه التقنية هو أن نتمكن من مراقبة حركة الخلية في وقت تكون المعيدة في الوقت الحقيقي، وبالتالي، سنكونقادرة على فحص الجينات المسؤولة عن تكون المعيدة وكذلك الانبثاث سرطان.
على الرغم من أن غير معروف نسبيا، ويعتقد التصاق الخلية الى خلية للعب دور مركزي في انقباض القمي 1. علم الوراثة ذبابة الفاكهة هي مناسبة تماما للتحقيقات واحدة على مستوى الخلية استكشاف الآليات الجزيئية التنظيمية. وهذا النموذج سوف تمكننا من كشف أهمية انقباض قمي خلال المعيدة. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لفحص الجينات المسؤولة في الانبثاث السرطان. والتقاط الصور الحية من ذبابة الفاكهة تكون المعيدة مزيد مكنتنا من فهم بمزيد من التفصيل الآليات الجزيئية التي تحكم إعادة ترتيب الأنسجة. هنا، ونحن نقدم وصفا شاملا لطريقة بسيطة لتحقيق ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: الذباب المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة ما يلي: DE-نذل :: GFP 10.
1. إعداد أبل لوحة
- تحضير خليط من 12.5 غ أجار، 125 مل 100٪ المتاحة تجاريا عصير التفاح، 12.5 غرام جلوكوز، و 375 مل H 2 O. حرارة المزيج في الميكروويف وسكبه في 3 سم طبق ثقافة الخلية. تخزين الخليط في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- بعد إعداد لوحة التفاح، إضافة طبقة رقيقة من معجون معجون الخميرة على أعلى من ذلك للسماح للالذباب لوضع البيض.
2. الأجنة إعداد وبروتوكول تصوير لايف
- وضع حوالي 50 الذباب (25 ذكور و 25 إناث) في زجاجة للتزاوج ووضع البيض في وقت لاحق بين عشية وضحاها على لوحة التفاح المشمولة في خميرة تعجن. تعيين لوحة عصير التفاح في فم الزجاجة. إبقاء زجاجة رأسا على عقب في حاضنة. التفاف الزجاجات البلاستيكية الأسهم ذبابة الفاكهة بورق الألمنيوم للمطالبة عشرالبريد الذباب لوضع المزيد من البيض.
- في صباح اليوم التالي، تحل محل القديمة لوحة عصير التفاح مع واحدة جديدة.
- اسمحوا الذباب تضع البيض لمدة 3 إلى 4 ساعات بواسطة التفاف زجاجة مع رقائق الألومنيوم.
- بعد ثلاث إلى أربع ساعات، وجمع الأجنة في مصفاة الجنين من لوحة عصير التفاح باستخدام فرشاة أو القطن سيئة وغسلها مع برنامج تلفزيوني. غسل الأجنة 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني في أطباق ثقافة 12-جيدا.
- Dechorionate الأجنة مع التبييض 50٪ لمدة 5 دقائق في أطباق ثقافة 12-جيدا.
- بعد عملية dechorionation، وغسل الأجنة 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- نقل الأجنة إلى صحن ثقافة الخلية 3 سم تحتوي على برنامج تلفزيوني ثم اختر المرحلة 5 الأجنة تحت المجهر استنادا إلى مستوى من الشفافية في حدودها. ماصة للأجنة نظموا باستخدام 200 ميكرولتر ماصة.
- بعد ذلك، وضع اثنين من الأجنة المختارة على ساترة الزجاج، وإزالة الزائد برنامج تلفزيوني مع المناديل الورقية الملتوية ناعما. توجيه الأجنة الجانب الظهري حتى علىساترة باستخدام المناديل الورقية الملتوية ناعما. بعد ذلك، ونعلق الأجنة إلى ساترة الزجاج مع الشحوم السيليكون باستخدام إبرة رفيعة والمناديل الورقية الملتوية.
- إضافة قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون 700 على الأجنة ووضع ساترة تحتوي على أجنة رأسا على عقب على الشريحة بادئة، وترك بعض المساحة في أسفل الشريحة.
- فحص الأجنة باستخدام نظام متحد البؤر التصوير، والأرجون / 488 ليزر، وهدف النفط الغمر (63X).
ملاحظة: تحديد الجنين في هذه المرحلة التنموية المناسبة مهمة لالتقاط الصور لهذا الحدث تكون المعيدة. في ظل هذه الظروف، ومراقبة تقريبا جميع الأجنة تتطور عادة ما يصل إلى ما لا يقل عن مرحلة 14. الجنين تحليلها يمكن تربيتها مواصلة تطوير كشخص بالغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، نقدم لك مجموعة من الأحداث تكون المعيدة للجنين ذبابة الفاكهة ولمحة عامة عن إجراءات إعداد الجنين (الشكل 1). وصفت أغشية الخلايا باستخدام DE-كادهيرين :: GFP وأن يتم التصوير المباشر لحركات الخلية في وقت تكون المعيدة في ذبابة الفاكهة (الشكل 2). منذ الذباب DE-كادهيرين GFP تسمح لنا تصور تقاطعات الالتزام خلية، ونحن قادرون على تتبع قمي الشكل والحركات التي تستخدم هذا النظام الخلية. الأهم من ذلك، فإن هذا النظام كما يتيح لنا أن تتبع أنماط التعبير DE-كادهيرين الذاتية.
الشكل 1: نظرة عامة على الأجنة الإجراءات التحضير. أ) إعداد الذباب لوضع البيض. ب) جمع الأجنة ووضعها في مصفاة الجنين. C) بعد غسلجي الأجنة مع برنامج تلفزيوني، dechorionate على الفور. د) نقل الأجنة إلى صحن ثقافة الخلية 3 سم باستخدام برنامج تلفزيوني. E) الماصة الأجنة التي هي في هذه المرحلة التنموية الصحيحة ووضعها على ساترة. F) إرفاق الأجنة إلى ساترة باستخدام الشحوم فراغ. G) المقبل إضافة قطرة من النفط الهالوكربون على ساترة. H) وأخيرا وضع ساترة رأسا على عقب على الشريحة بادئة. الأجنة جاهزة الآن للتصوير مرور الزمن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نتيجة إجراء التجارب باستخدام DE-نذل :: القائم GFP لايف التصوير خلال المعيدة. وصفت أغشية الخلايا باستخدام DE-كادهيرين ::ثم تم القبض GFP والتصوير المباشر لحركة الخلية لحوالي 500 ق خلال المعيدة ذبابة الفاكهة. تم تصور محيط الخلية القمية باستخدام مضان GFP من DE كاد من أجل تتبع المناطق قمية من الخلايا الفردية باستخدام مجموعة تمثيلية من الوقت الفاصل بين الصور. شريط النطاق = 20 ميكرون. وتظهر رؤوس سهام حيث يحدث انقباض قمي وانغلاف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3 (2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
