כאן אנו מתארים הליך ללכידת תמונות חיות של גסטרולציה של דרוזופילה. זה אפשר לנו להבין טוב יותר את ההתכווצות האפיקלית הכרוכה בהתפתחות מוקדמת ולנתח עוד יותר מנגנונים השולטים בתנועות התאים במהלך שינוי מבנה הרקמה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה של שינוי צורה של התא ותנועתו ב תסיסנית Gastrulation שימוש Reporter DE-cadherin זבובים טרנסגניים
במאמר זה
סיכום
תקציר
Gastrulation הוא הסט הראשון של אירועים דינמיים מורפולוגית המתרחשים במהלך ההתפתחות העוברית של בעלי חיים רבים-תאיים כגון תסיסנית. שינוי מורפולוגי זו מוכרת גם בשם אפיתל המעבר mesenchymal (EMT). חוסר ויסות של EMT קשורה סיסטיק ו גרורות סרטניות. יש ראיות המתעוררים כי EMT נשלטת על ידי מספר מנגנונים מולקולריים. כמו גנים מפתח כגון, רבים השולטים התכווצות הפסגה גם ידועים להיות מרכיב חשוב EMT ציין בהתפשטות גרורות סרטניות. כמו EMT במהלך gastrulation תסיסנית, תאי אפיתל יכולים להיגרם לשנות את צורתם ואת לתכנת מחדש להפנות תא גורל כלפי סוגי תאים שונים אחרים. כאן אנו מספקים שיטת הדמיה חזקה של gastrulation תסיסנית כדי assay את החניכה של תנועות הסלולר המוךפו"גנטי שהולכות וזיהוי תאי גורל בשלב זה של התפתחות עוברית. באמצעות שיטה זו, אנו מזהים גell התארגנות בזמן gastrulation ולהפגין את החשיבות של התכווצות הפסגה במהלך gastrulation באמצעות GFP שכותרתו DE-cadherin.
מבוא
Gastrulation הוא הסט הראשון של אירועים דינמי מורפולוגית המתרחשים במהלך ההתפתחות העוברית של בעלי חיים רב-תאיים כגון תסיסנית 1,2. מעניין, המתעוררים הראיות עולה כי תהליך זה מוסדר באמצעות משחק הגומלין בין מנגנונים מכניים ומולקולרית 3. יתר על כן, אפיתל המעבר mesenchymal (EMT), שהוא תהליך מכריע gastrulation, הוא מעורב גם בתהליכי מחלות אנושיות כגון גרורות סרטן 4-8. כמו גנים כאלה, רבים השולטים התכווצות פסגה גם ידועים כגורמי מפתח EMT שנצפתה בסרטן גרור 9. לפיכך, מועקה הפסגה בעת gastrulation הוא מודל מצוין לחקור את מנגנוני ויסות הנ"ל כדי לשפר את ההבנה שלנו של גרורות סרטניות. היתרון של ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הזבובים המהונדסים נעשו שימוש במחקר זה כולל את הפעולות הבאות: DE-CAD :: GFP 10.
1. הכנת הצלחת האפלה
- הכינו תערובת של אגר 12.5 גרם, 125 מ"ל 100% מיץ תפוחים זמינים מסחרית, 12.5 גלוקוז g, ו- 375 מ"ל H 2 O. מחממים את התערובת במיקרוגל ויוצקים אותו לתוך צלחת תרבית תאים 3 ס"מ. אחסן את התערובת על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
- לאחר הכנת צלחת התפוח, להוסיף שכבה דקה של ממרח שמרים לש על גבי זה כדי לאפשר הזבובים להטיל ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן, אנו מציגים את אירועי gastrulation של עובר תסיסנית סקירה כללית של הליך הכנת עובר (איור 1). קרום התא מסומנים באמצעות DE-cadherin :: GFP ו הדמיה חיה של תנועות תא מתבצע בעת gastrulation תסיסנית (איור 2). מאז זבובי DE-cadherin GFP מאפשרים לנו לדמיין צמתים דבקות תא, אנו מסוגלים לעקוב אחר צורת תא פסגה ותנועות באמצעות מערכת זו. יתרה מכך, מערכת זו גם מאפשרת לנו להתחקות אחר דפוסי ביטוי DE-cadherin אנדוגני.
.......הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות שדיווחנו בעבר על הליך דומה לצילום תמונות חיות של תהליך הקיבה בדרוזופילה1, השיטה שאנו מתארים כאן מפורטת וקלה למעקב אחר ביטוי קדרין אנדוגני ולכן היא שימושית למדי לסריקה גנטית של גורמי מפתח המעורבים בקיבה. כדי למקסם את ההצלחה בהליך הדמיה זה, חיוני להשתמש בשקופית שקועה. לחץ מכני גורם לפעמים למוות עוברי. לכן, חשוב גם לטפל בעוברים בעדינות ככל האפשר מכיוון שכל לחץ מכני עלול לשבש את תהליך הקיבה העוברית. שימוש בכמות הנכונה של שומן במהלך קיבוע העובר ישפר עוד יותר את תוצאות הליך ההדמיה החיה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי קרן אסטלס לחקר הפרעות מטבוליות (HT), קרן טקדה למדע (HT) והתוכנית הנתמכת על ידי MEXT עבור קרן המחקר האסטרטגי באוניברסיטאות פרטיות (HT).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שמן Halocarbon 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| גריז ואקום סיליקון | בקמן | 335148 | |
| כיסוי זכוכית | זכוכית מטסונאמי | מס' | 1 24 - 36 מ"מ |
| כוכב עובר | קורנינג קורנינג | 3477 | |
| בקבוקי מלאי מפלסטיק דרוזופילה | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin זבובי | REF (10) |
מקורות
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
