Abstract
Gastrulation är den första uppsättningen av morfologiskt dynamiska händelser som inträffar under den embryonala utvecklingen av flercelliga djur såsom Drosophila. Denna morfologiska förändring är också erkänt som epitelceller till mesenkymala övergång (EMT). Dysreglering av EMT förknippas med fibros och cancermetastaser. Det finns växande bevis för att EMT styrs av ett antal molekylära mekanismer. Som sådan, många viktiga gener som styr apikala sammandragning är också kända för att vara viktiga faktorer i EMT observerats i cancermetastaser. Liknande EMT under Drosophila gastrulation, kan epitelceller induceras att ändra sin form och omprogrammeras för att omdirigera cellernas öde mot olika andra celltyper. Här ger vi en robust avbildningsmetod Drosophila gastrulation att analysera inledandet av morfogenetiska cellulära rörelser och cell öde identifiering under detta skede av embryonal utveckling. Med denna metod, vi identifierar cell ombildning vid tiden för gastrulation och visa vikten av apikala sammandragning under gastrulation använder GFP märkt DE-cadherin.
Introduction
Gastrulation är den första uppsättningen av morfologiskt dynamiska händelser som inträffar under embryoutvecklingen av flercelliga djur såsom Drosophila 1,2. Intressant nya bevis tyder på att denna process regleras genom samspelet mellan mekaniska och molekylära mekanismer 3. Dessutom är epitelceller till mesenkymala övergång (EMT), vilket är en viktig process i gastrulation, även inblandad i processer mänskliga sjukdomar såsom cancermetastas 4-8. Som sådan, många gener som styr apikala sammandragning är också kända för att vara viktiga faktorer i EMT observerats i cancermetastaser 9. Således, apikal förträngning vid gastrulation är en utmärkt modell för att undersöka de ovan nämnda regleringsmekanismer och att öka vår förståelse av cancermetastaser. Fördelen med denna teknik är att vi kan observera cellrörelse vid gastrulation i realtid och därför kommer vi attkunna screena gener involverade i gastrulation liksom cancermetastaser.
Även om relativt okänd, cell-till-cell-adhesion tros spela en central roll i apikala förträngning 1. Drosophila genetik är väl lämpad för enskilda undersökningar cellnivå utforska molekylära mekanismer reglerings. Denna modell gör det möjligt för oss att avslöja vikten av apikala sammandragning under gastrulation. Dessutom kan denna metod användas för att screena gener involverade i cancermetastas. Fånga levande bilder av Drosophila gastrulation har vidare gjort det möjligt för oss att förstå mer i detalj de molekylära mekanismer som styr vävnads ombildning. Häri ger vi en utförlig beskrivning av en enkel metod för att uppnå detta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: De transgena flugor som används i denna studie inkluderar följande: DE-cad :: GFP 10.
1. Framställning av Apple Plate
- Förbereda en blandning av 12,5 g agar, 125 ml 100% kommersiellt tillgänglig äppeljuice, 12,5 g glukos och 375 ml H2O Värm blandningen i en mikrovågsugn och häll det i en 3 cm cellodlingsskål. Lagra blandningen vid 4 ° C för framtida användning.
- Efter framställning av äppelplattan, lägg ett tunt lager av knådad jäst pasta ovanpå den så att flugorna att lägga ägg.
2. Embryo Upprättande och Live Imaging protokoll
- Placera cirka 50 flugor (25 hanar och 25 honor) i en flaska för att para sig och därefter lägger ägg över natten på ett äpple platta täckt av knådad jäst. Ställa in äppeljuice plattan vid mynningen av flaskan. Håll flaskan upp och ner i en inkubator. Wrap plast Drosophila lager flaskor med aluminiumfolie för att uppmana the flyger till lägga fler ägg.
- Nästa morgon, ersätta den gamla äppeljuice plattan med en ny.
- Låt flugorna lägger ägg för tre till fyra timmar genom att linda flaskan med aluminiumfolie.
- Tre till fyra timmar senare, samla embryon i ett embryo sil från äppeljuice plattan med hjälp av en pensel eller bomulls dåligt och tvätta dem med PBS. Tvätta embryona två till tre gånger med PBS i 12-brunnars odlingsskålar.
- Dechorionate de embryon med 50% blekmedel under 5 min i 12-brunnars odlingsskålar.
- Efter den dechorionation processen, tvätta embryona två till tre gånger med PBS.
- Överför embryon till en 3 cm cellodlingsskål innehållande PBS och välj etapp 5 embryon under mikroskop baserad på graden av öppenhet vid sina gränser. Pipett den iscensatta embryon med hjälp av en 200 mikroliter pipettspets.
- Därefter placerar två utvalda embryon på ett täckglas och avlägsna överskott PBS med tvinnat mjukpapper. Orientera embryona ryggsidan upp påtäck med hjälp av en tvinnat mjukpapper. Efter att fästa embryona till glastäck med silikonfett med hjälp av en fin nål och vred mjukpapper.
- Tillsätt en liten droppe Halocarbon olja 700 på embryon och placera täck innehåller embryon upp och ned på den indragna slide, lämnar lite utrymme längst ned i bilden.
- Undersök embryon med hjälp av ett konfokalt avbildningssystem, en Argon / 488 laser, och ett oljeimmersionsobjektiv (63X).
OBS: Identifiera embryot på lämplig utvecklingsstadium är viktigt att fånga bilder av gastrulation händelsen. Under dessa förhållanden, observera nästan alla embryon utvecklas normalt upp till åtminstone stadium 14. analyserade embryo kan odlas vidare att utvecklas som en vuxen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi de gastrulation händelserna i Drosophila embryo och en allmän översikt av förfarandet embryot preparatet (Figur 1). Cellmembranen märks med DE-cadherin :: GFP och levande avbildning av cellrörelser utförs vid gastrulation i Drosophila (figur 2). Eftersom DE-cadherin GFP flugor tillåter oss att visualisera cellvidhäftnings korsningar, har vi möjlighet att spåra apikala cellform och rörelser med hjälp av detta system. Ännu viktigare, gör detta system även för oss att spåra endogena DE-cadherin uttrycksmönster.
Figur 1: Allmän översikt av embryot framställningsförfarande. A) Ställ in flugor för äggläggning. B) Samla embryon och placera dem i ett embryo sil. C) Efter tvätting embryon med PBS, dechorionate dem omedelbart. D) Överför embryon till en 3 cm cellodlingsskål med PBS. E) Pipettera de embryon som är i rätt utvecklingsskede och placera dem på ett täckglas. F) Fäst embryon till täck utnyttjar vakuum fett. G) Tillsätt en droppe Halocarbon olja på täckglas. H) Slutligen placera täck upp och ned på den indragna bilden. Embryona är nu redo för time-lapse avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Resultat av en experimentförfarande som utnyttjar DE-cad :: GFP-baserade Live Imaging Under gastrulation. Cell membran märktes med användning DE-cadherin ::GFP och levande avbildning av cellrörelse därefter fångades ca 500 s under gastrulation Drosophila. Apikala cell omkrets visualiserades med hjälp av GFP fluorescens av DE-Cad i syfte att spåra apikala områden i enskilda celler med hjälp av ett representativt urval av tidsförlopp bilder; Skalstreck = 20 | im. Pilarna visar var apikal sammandragning och invagination inträffa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3 (2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
