Abstract
Гаструляция первый набор морфологически динамических событий , которые происходят во время эмбрионального развития многоклеточных животных , таких как дрозофилы. Это морфологическое изменение также признается как эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT). Дисрегуляция EMT связано с фиброзом и метастазирование рака. Существует доказательство того, что возникающие ЕМТ контролируется ряда молекулярных механизмов. Как также известны такие, многие ключевые гены, контролирующие верхушечный перетяжку являются важными факторами в ЕМТ наблюдается в метастазирования рака. Как EMT во время гаструляции Drosophila, эпителиальные клетки можно заставить изменить свою форму и быть перепрограммирован перенаправлять судьбу клеток по отношению к различным другим типам клеток. Здесь мы предлагаем надежный метод визуализации дрозофилы гаструляцией для анализа инициации морфогенетических клеточных движений и идентификации клеточных судеб на этой стадии эмбрионального развития. Используя этот метод, мы определяем грELL перегруппировки во время гаструляции и демонстрируют важность апикального сужения во время гаструляции с помощью GFP маркированы DE-кадгерин.
Introduction
Гаструляция первый набор морфологически динамических событий , которые происходят во время эмбрионального развития многоклеточных животных , таких как Drosophila 1,2. Интересно отметить , что возникающие данные свидетельствуют о том, что этот процесс регулируется через взаимодействие между механическими и молекулярных механизмов 3. Кроме того, эпителиальный к переходу мезенхимальной (EMT), которая представляет собой важный процесс в гаструляцией, также участвует в процессах заболеваний человека , таких как рак 4-8 метастаз. Как также известны такие, многие гены , которые контролируют верхушечный перетяжку, являются ключевыми факторами в ЕМТ наблюдается при раке метастазирования 9. Таким образом, верхушечный Сужение во время гаструляции является отличной моделью для исследования вышеупомянутых регулирующих механизмов и повысить понимание метастазирования рака. Преимущество этого метода заключается в том, что мы можем наблюдать движение клеток во время гаструляции в режиме реального времени и, следовательно, мы будемвозможность скрининга генов, участвующих в гаструляции, а также метастазирование рака.
Хотя относительно неизвестной, клеточная адгезия к клетке , как полагают , играет центральную роль в вершинной сужением 1. Drosophila генетика хорошо подходит для отдельных исследований на уровне клеток , исследующих регуляторных молекулярных механизмов. Эта модель позволит нам раскрыть важность апикального сужения во время гаструляции. Более того, этот метод может быть использован для скрининга генов, участвующих в метастазировании рака. Захват живые образы Drosophila гаструляцией еще больше позволило нам понять более подробно молекулярные механизмы , регулирующие перестановку ткани. Здесь мы приводим подробное описание простого способа для достижения этой цели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Трансгенные мухи , используемые в настоящем исследовании , включают следующее: DE-хама :: GFP 10.
1. Подготовка компании Apple плиты
- Приготовить смесь из 12,5 г агара, 125 мл 100% коммерчески доступного яблочный сок, 12,5 г глюкозы и 375 мл H 2 O. Смесь нагревают в микроволновой печи и вылить его в 3 см для культивирования клеток блюдо с. Хранить смесь при температуре 4 ° С для последующего использования.
- После приготовления яблочного тарелку, добавить тонкий слой замешанного дрожжевого пасты поверх него, чтобы позволить мухи заложить яйца.
2. Эмбрион Подготовка и протокол Живая съемка
- Поместите около 50 мух (25 мужчин и 25 женщин) в бутылке к спариванию, а затем откладывают яйца на ночь на яблочной пластины, покрытой в замешанного дрожжей. Установите яблочный сок пластины во рту бутылки. Держите бутылку вверх дном в инкубаторе. Оберните пластиковые бутылки Drosophila акции с алюминиевой фольгой , чтобы подсказать йе летит заложить больше яиц.
- На следующее утро, заменить старый яблочный сок пластины с новым.
- Пусть мухи откладывают яйца в течение 3 до 4 часов, обернув бутылку с алюминиевой фольгой.
- Через три-четыре часа спустя, собирают эмбрионов в зародыше ситечко из яблочного сока пластины с помощью кисти или ватный плохо, и мыть их с PBS. Вымойте эмбрионов от 2 до 3 раз больше с PBS в 12-луночные планшеты для культивирования.
- Dechorionate эмбрионов с 50% хлорной извести в течение 5 мин в 12-луночные планшеты для культивирования.
- После процесса dechorionation, мыть эмбрионов от 2 до 3 раз больше с PBS.
- Перенос эмбрионов до 3 см для культивирования клеток блюдо, содержащую PBS и выберите стадии 5 эмбрионов под микроскопом на основе уровня прозрачности в их границах. Пипетировать инсценированном эмбрионов с использованием 200 мкл кончиком пипетки.
- Затем поместите два выбранных эмбрионов на покровного стекла, и удалить избыток PBS с бумагой крученого ткани. Сориентировать эмбрионов спинной стороной вверх напокровное с использованием бумаги крученого ткани. После этого, приложите эмбрионов к покровного стекла с силиконовой смазкой с помощью тонкой иглы и бумаги витую ткани.
- Добавьте небольшую каплю масла галоидоуглеводородов 700 на зародышах и помещают покровное, содержащий зародыши вверх дном на отступом горкой, оставляя некоторое пространство в нижней части слайда.
- Изучение эмбрионов с помощью конфокальной системы визуализации, аргоновой / 488 лазера, а также цель нефти погружения (63x).
Примечание: Определение эмбриона на соответствующей стадии развития имеет важное значение для захвата изображений события гаструляции. В этих условиях наблюдается почти все эмбрионы развиваются нормально до, по меньшей мере стадии 14. Анализируемый эмбрионов можно культивировать в дальнейшем развивать как взрослый.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы покажем , гаструляции события зародыша дрозофилы и общий обзор процедуры подготовки эмбриона (Рисунок 1). Клеточные мембраны помечены с помощью DE-кадгерин :: GFP и живой визуализации движений клеток производится во время гаструляции у дрозофилы (рисунок 2). Так как DE-кадгерин GFP мух позволяют визуализировать приверженности клеток перекрестки, мы можем проследить верхушечный форму и движения с использованием этой системы клеток. Что еще более важно, эта система также позволяет проследить эндогенные паттерны экспрессии DE-кадгерина.
Рисунок 1: Общий обзор Эмбрион Методика получения. A) Установите мух для откладки яиц. Б) Сбор эмбрионов и поместить их в зародыше ситечко. C) После промывкиИНГ эмбрионов с PBS, dechorionate их немедленно. D) Перенос эмбрионов до 3 см для культивирования клеток блюдо с использованием PBS. Е) пипеткой эмбрионы , которые находятся на правильной стадии развития и поместить их на покровное. F) Прикрепите эмбрионов к покровное с помощью вакуумной смазки. G) Затем добавьте каплю масла на галоидоуглеводородов покровное. H) Наконец поместите покровное вверх дном на отступом слайде. Эмбрионы теперь готовы к покадровой обработки изображений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Результат процедуры экспериментального использования DE-кадмиевые :: GFP на основе живого изображения во время гаструляции. Клеточные мембраны метили DE-кадгерин ::GFP и живой визуализации движения клеток был захвачен в течение примерно 500 секунд во время гаструляции у дрозофилы. Верхушечные периметры клеток визуализировали с помощью GFP флуоресценции DE-Cad для того, чтобы проследить вершинные участки отдельных клеток с использованием репрезентативного набора покадровой изображений; Шкала бар = 20 мкм. Стрелки показывают, где происходят апикального сужения и инвагинации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3 (2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
