Abstract
原腸形成は、 ショウジョウバエのような多細胞動物の胚発生中に発生する形態学的に動的なイベントの最初のセットです。この形態学的変化はまた、間葉移行（EMT）に上皮として認識されています。 EMTの調節不全は、線維症および癌転移に関連しています。 EMTは、分子機構の数によって制御されることを出現の証拠があります。このように、頂端収縮を制御する多くの重要な遺伝子はまた、癌転移で観察されたEMTにおいて重要な要因であることが知られています。 ショウジョウバエの原腸形成の間にEMTのように、上皮細胞は、その形状を変更するように誘導することができ、様々な他の細胞型に向けて細胞の運命をリダイレクトするように再プログラムされます。ここでは、胚発生のこの段階の間に形態形成の細胞運動の開始と細胞運命の識別をアッセイするために、ショウジョウバエの原腸陥入の堅牢な撮像方法を提供します。この方法を使用して、我々は、cを識別しますエル原腸陥入時の再配列およびGFPを用いて、原腸陥入時の頂端収縮の重要性を実証するには、DEカドヘリンを標識しました。
Introduction
原腸形成は、 ショウジョウバエ 1,2などの多細胞動物の胚発生中に発生する形態学的に動的なイベントの最初のセットです。興味深いことに、証拠出現すると、このプロセスは、機械的および分子機構3との間の相互作用を介して調節されることを示唆しています。また、原腸形成において重要なプロセスである間葉移行（EMT）、上皮はまた、癌転移4-8、ヒト疾患過程に関与しています。このように、頂端収縮を制御する多くの遺伝子はまた、癌転移9で観察されたEMTにおいて重要な要因であることが知られています。このように、原腸陥入時の根尖狭窄は、前述の調節メカニズムを調査すると癌転移の我々の理解を高めるための優れたモデルです。この技術の利点は、我々はリアルタイムで原腸陥入時の細胞運動を観察することができ、したがって、私たちはなるということです原腸形成だけでなく、癌の転移に関与する遺伝子をスクリーニングすることができます。
比較的未知のが、細胞-細胞接着は、頂端狭窄1において中心的な役割を果たしていると考えられています。 ショウジョウバエの遺伝学は、規制分子メカニズムを探求する単一細胞レベルの研究に適しています。このモデルは、原腸陥入時の頂端収縮の重要性を明らかにすることが可能となります。また、この方法は、癌の転移に関与する遺伝子をスクリーニングするために使用することができます。 ショウジョウバエの原腸形成のライブ画像をキャプチャすること、さらに、より詳細に組織再編成を支配する分子メカニズムを理解することができました。ここで、我々はこれを達成するための簡単な方法の包括的な説明を提供します。
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Protocol
注：DE-CAD :: GFP 10：本研究で使用したトランスジェニックハエは、以下のものが挙げられます。
アップルプレートの調製
- 電子レンジで12.5グラム寒天、125 mLの100％市販のリンゴジュース、12.5グラムのグルコース、および375mLのH 2 Oの熱混合物の混合物を準備し、3センチメートル細胞培養皿にそれを注ぎます。将来の使用のために4℃で混合物を保管してください。
- リンゴのプレートを準備した後、ハエが卵を産むことができるように、その上に混練した酵母ペーストの薄い層を追加します。
2.胚の調製とライブイメージングプロトコル
- 交尾し、その後混練酵母に覆われたリンゴのプレート上で一晩卵を産むために瓶の中に約50ハエ（25人の男性と25人の女性）を配置します。瓶の口にリンゴジュースのプレートを設定します。 インキュベーター中で逆さまにボトルを保管してください。目を促すためにアルミホイルでプラスチックショウジョウバエストックボトルを包みますeはより多くの卵を産むために飛びます。
- 翌朝は、新しいものと古いリンゴジュースのプレートを交換してください。
- ハエはアルミホイルで瓶を包むことにより、3〜4時間の卵を産むしてみましょう。
- 3〜4時間後、ブラシや綿悪いを使用して、リンゴジュースのプレートから胚ストレーナーで胚を収集し、PBSでそれらを洗ってください。 12ウェル培養皿に胚をPBSで2〜3回洗浄します。
- 12ウェル培養皿中で5分間、50％の漂白剤を用いて胚をDechorionate。
- dechorionationプロセスの後、PBSで胚を2〜3回洗浄します。
- 国境での透明性のレベルに基づいて、PBSを選択し、ステージ顕微鏡下で5胚を含む3センチメートル細胞培養皿に胚を移します。 200μLのピペットチップを使用して段階的な胚をピペット。
- 次に、ガラスカバースリップ上で選択した2つの胚を置き、細かくねじれたティッシュペーパーで余分なPBSを除去します。オリエント胚は、最大のサイド背側細かくねじれたティッシュペーパーを使用してカバースリップ。その後、微細な針とねじれたティッシュペーパーを用いてシリコングリスをカバーガラスに胚を添付します。
- スライドの下部にあるいくつかのスペースを残して、胚のハロカーボン油700の小滴を追加し、逆さまにインデントスライド上の胚を含むカバースリップを配置。
- 共焦点イメージングシステム、アルゴン/ 488レーザー、油浸対物レンズ（63X）を使用して胚を調べます。
注：適切な発達段階での胚の識別は、原腸陥入イベントの画像をキャプチャすることが重要です。これらの条件下では、ほとんどすべての胚を分析胚が大人として成長するために、さらに培養することができる少なくともステージ14まで正常に発育観察します。
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Representative Results
ここでは、ショウジョウバエの胚の原腸陥入のイベントや胚の調製手順の概要（ 図1）を示します。細胞膜は、DE-カドヘリン:: GFPおよび細胞運動のライブイメージングは、 ショウジョウバエにおいて原腸形成の時点で行われる（ 図2）を用いて標識されます。 DEカドヘリンGFPのハエは、私たちは細胞接着接合を可視化することを可能にしますので、我々はこのシステムを使用して、頂端細胞の形状や動きを追跡することができます。さらに重要なことは、このシステムはまた、私たちは、内因性のDEカドヘリンの発現パターンをトレースすることができます。
図1：胚の準備手順の総括。 A）産卵のためにハエを設定します。 B）の胚を収集し、胚ストレーナーに配置します。洗浄した後、C）PBSで胚をる、すぐにdechorionate。 D）PBSで3センチの細胞培養皿に胚を移します。 E）正しい発達段階にある胚をピペットし、カバースリップ上に置きます。 F）真空グリースを使用してカバースリップに胚を取り付けます。 G）次は、カバーガラス上にハロカーボン油の滴を追加します。 H）最後にインデントされたスライド上に逆さまにカバースリップを配置。胚は、タイムラプスイメージングのための準備が整いました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：原腸陥入時にはDE-CAD :: GFPベースのライブイメージングを利用した実験手順の結果。細胞膜は、DE-カドヘリンを用いて標識した::GFPと細胞運動のライブイメージングは、その後、 ショウジョウバエの原腸陥入時に約500秒間撮影しました。頂端細胞の周囲には、タイムラプス画像の代表的なセットを使用して、個々の細胞の頂端領域を追跡するために、DE-CADのGFP蛍光を用いて可視化しました。 =20μmのスケールバー。根尖狭窄と陥入が発生する場所矢印が表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3 (2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
