Abstract
Gastrulatie is de eerste set van morfologisch dynamische gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de embryonale ontwikkeling van meercellige dieren zoals Drosophila. Deze morfologische wijziging wordt ook erkend als epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT). Ontregeling van EMT is geassocieerd met fibrose en kanker metastase. Er wordt steeds duidelijker dat EMT wordt bestuurd door een aantal moleculaire mechanismen. Als zodanig veel belangrijke genen die apicale vernauwing controle is ook bekend dat belangrijke factoren in de EMT waargenomen bij kanker metastase. Net als EMT tijdens Drosophila gastrulatie, kunnen epitheelcellen worden aangezet om hun vorm te veranderen en worden geherprogrammeerd om lot van de cel richten op verschillende andere celtypen. Hier bieden we een robuuste imaging methode Drosophila gastrulatie om de inleiding van morfogenetische cellulaire bewegingen en het lot van de cel identificatie testen tijdens deze fase van de embryonale ontwikkeling. Met behulp van deze methode, identificeren we cell omlegging bij de gastrulatie en tonen het belang van apicale constrictie tijdens gastrulatie behulp GFP gemerkte DE-cadherine.
Introduction
Gastrulatie is de eerste set van morfologisch dynamische gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de embryonale ontwikkeling van meercellige dieren zoals Drosophila 1,2. Interessant nieuwe aanwijzingen dat dit proces wordt gereguleerd door de wisselwerking tussen mechanische en moleculaire mechanismen 3. Bovendien is het epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), een cruciale proces gastrulatie, ook betrokken bij menselijke ziekteprocessen zoals kanker metastase 4-8. Als zodanig vele genen die apicale vernauwing controle is ook bekend dat een sleutelfactor is in het EMT waargenomen bij kanker metastase 9. Aldus apicale vernauwing bij de gastrulatie is een uitstekend model voor de genoemde regulerende mechanismen te onderzoeken en aan ons begrip van kanker metastase bevorderen. Het voordeel van deze techniek is dat we celbeweging bij de gastrulatie in real-time en daarom kan waarnemen, zullen wekunnen genen betrokken bij gastrulatie kanker metastase scherm.
Hoewel relatief onbekend is cel-cel adhesie vermoedelijk een centrale rol spelen bij het apicale constrictie 1. Drosophila genetica is goed geschikt voor single cell niveau onderzoeken verkennen regulerende moleculaire mechanismen. Dit model stelt ons in staat om het belang van apicale beklemming ontdekken tijdens gastrulatie. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om genen betrokken bij kanker metastase screenen. Het vastleggen van live beelden van Drosophila gastrulatie verder ons in staat om te begrijpen in meer detail de moleculaire mechanismen die ten grondslag weefsel omlegging. Hierin geven we een uitvoerige beschrijving van een eenvoudige methode om dit te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De transgene vliegen die in deze studie zijn: DE-cad :: GFP 10.
1. Bereiding van Apple Plate
- Maak een mengsel van 12,5 g agar, 125 ml 100% in de handel verkrijgbaar appelsap, 12,5 g glucose en 375 ml H2O Verhit het mengsel in een magnetron en giet het in een 3 cm celkweek schotel. Bewaar het mengsel bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
- Na bereiding van de appel plaat, voeg een dunne laag gekneed gistpasta bovenop om de vliegen van eieren leggen.
2. Embryo Voorbereiding en Live-Imaging Protocol
- Plaats ongeveer 50 vliegen (25 mannen en 25 vrouwen) in een fles om te paren en vervolgens eieren leggen 's nachts op een appel plaat bedekt met gekneed gist. Stel de appelsap plaat aan de monding van de fles. Bewaar de fles op zijn kop in een couveuse. Wikkel de plastic Drosophila voorraad flessen met aluminiumfolie om prompt the vliegt naar meer eieren te leggen.
- De volgende ochtend, vervang de oude appelsap plaat met een nieuwe.
- Laat de vliegen eitjes leggen gedurende 3-4 uur door het wikkelen van de fles met aluminiumfolie.
- Drie tot vier uur later, het verzamelen van de embryo's in een embryo zeef van het appelsap plaat met een borstel of katoenen slecht en was ze met PBS. Was de embryo's 2-3 keer met PBS in 12-putjes.
- Dechorionate de embryo's met 50% bleekwater gedurende 5 min in 12-putjes.
- Na het dechorionation proces 2-3 keer was de embryo's met PBS.
- Overdracht van de embryo's om een 3 cm celkweek schotel met PBS en selecteer stadium 5 embryo's onder de loep op basis van het niveau van transparantie aan hun grenzen. Pipetteer de geënsceneerde embryo's met behulp van een 200 pi pipet tip.
- Plaats vervolgens twee geselecteerde embryo's op een glazen dekglaasje en verwijder overtollige PBS met fijn gedraaide papieren zakdoekje. Richt de embryo's dorsale kant naar boven ophet dekglaasje met behulp van een fijn gedraaide vloeipapier. Na dat, hechten de embryo's aan het glas dekglaasje met siliconen vet met behulp van een fijne naald en gedraaide papieren zakdoekje.
- Voeg een druppeltje Halocarbonolie 700 op het embryo en plaats het dekglaasje met de embryo omgekeerd op het ingesprongen dia iets ruimer aan de onderkant van de schuif.
- Onderzoek de embryo's met behulp van een confocale beeldvormingssysteem, een Argon / 488 laser, en een olie-immersie objectief (63x).
Opmerking: Het identificeren van de embryo in de juiste ontwikkelingsstadium belangrijk om beelden van de gastrulatie gebeurtenis vast te leggen. Onder deze omstandigheden acht bijna alle embryo's ontwikkelen gewoonlijk tot tenminste fase 14. De geanalyseerde embryo verder kunnen worden gekweekt ontwikkelen als volwassene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier tonen wij de gastrulatie gebeurtenissen van de Drosophila embryo en een algemeen overzicht van de embryo bereidingsprocedure (figuur 1). Celmembranen geëtiketteerd met DE-cadherine :: GFP en live beeldvorming van celbewegingen wordt uitgevoerd ten tijde van gastrulatie in Drosophila (figuur 2). Sinds DE-cadherine GFP vliegt ons toelaten om celadhesie kruispunten te visualiseren, zijn we in staat om apicale cel vorm en bewegingen van het gebruik van dit systeem op te sporen. Nog belangrijker, dit systeem kunnen we ook endogene DE-cadherine expressiepatronen traceren.
Figuur 1: Algemeen overzicht van de Embryowet voorbereidingsprocedure. A) Stel vliegen voor eileg. B) Verzamel embryo's en plaats ze in een embryo zeef. C) Na het wassening de embryo's met PBS, dechorionate ze onmiddellijk. D) Breng de embryo een 3 cm celkweekschaal behulp PBS. E) Pipet de embryo's die op de juiste ontwikkelingsstadium en leg ze op een dekglaasje. F) Bevestig de embryo's naar de dekglaasje met behulp van vacuüm vet. G) Vervolgens voeg een druppel halogene olie op het dekglaasje. H) Ten slotte plaatst het dekglaasje ondersteboven op de ingesprongen dia. De embryo's zijn nu klaar voor time-lapse imaging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: het resultaat van een Experimentele procedure gebruik te maken van DE-cad :: GFP-gebaseerde Live Imaging tijdens de gastrulatie. Celmembranen werden gelabeld met DE-cadherine ::GFP en live beeldvorming van de cel beweging werd vervolgens vastgelegd voor ongeveer 500 s tijdens de gastrulatie van Drosophila. Apicale cel perimeters werden gevisualiseerd met behulp van de GFP fluorescentie van DE-Cad met het oog op het apicale gebied van de individuele cellen met behulp van een representatieve set van time-lapse beelden op te sporen; Schaal bar = 20 micrometer. De pijlpunten laten zien waar apicale vernauwing en invagination optreden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3 (2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
