High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Summary

High-throughput testen van DNA en RNA gebaseerde pathogenen op nanoschaal PCR wordt omschreven met een syndromale honden en paarden luchtwegen PCR panel.

Abstract

Nanoliter schaal real-time PCR gebruikt ruimtelijke multiplexing om meerdere tests worden uitgevoerd parallel op een enkele plaat zonder de gebruikelijke nadelen van het combineren reacties. We ontworpen en geëvalueerd een panel op basis van dit principe de aanwezigheid van gemeenschappelijke ziekteverwekkers bij honden en paarden met acute respiratoire aandoening snel kan identificeren. Dit manuscript beschrijft een nanoschaal diagnostische PCR workflow voor monsterbereiding, amplificatie en analyse van de doelgroep pathogeen sequenties, met de nadruk op procedures die verschillen van microliter schaal reacties zijn. In de luchtwegen panel voorgelegd, werden 18 assays elke set in drievoud, met een capaciteit tot 48 monsters per plaat. Een universele extractie en pre-amplificatie workflow werd geoptimaliseerd voor high-throughput monstervoorbereiding om meerdere matrices en DNA en RNA gebaseerde pathogenen tegemoet te komen. Representatieve gegevens worden gepresenteerd voor een RNA-doel (influenza A matrix) en een DNA target (equine herpesvirus1). De mogelijkheid om snel en nauwkeurig te testen op een uitgebreide, syndroom gevestigde groep van ziekteverwekkers is een waardevol instrument voor het verbeteren van de efficiëntie en de ergonomie van diagnostische tests en voor acute respiratoire aandoeningen diagnostiek en behandeling.

Introduction

Met de vraag naar snelle en volledige detectie van meerdere agentia in klinische diagnostiek voor mens en dier, single-organisme moleculaire diagnostische methoden voor detectie van pathogenen belastend indien gebruikt voor grote aantallen monsters getest voor een ziekte. In de veterinaire context, high-throughput diagnostische methoden zijn bijzonder belangrijk vanwege de bijkomende noodzaak voor het afdekken van pathogenen uit diverse soorten. OneHealth benaderingen voor het beheer van door voedsel overgedragen ziekten en opkomende ziekteverwekker surveillance zijn voorbeelden van testen behoeften die een aantal bacteriën bevatten, virussen (DNA of RNA gebaseerde), parasieten en schimmels. De uitdaging combineren test op meerdere analyten tegelijk (multiplexing) om testen efficiëntie te verbeteren is een mogelijk verlies van gevoeligheid en een grote belasting voor de optimalisatie en validatie assays.

Nanoliter schaal real-time polymerase-kettingreactie (PCR) is een alterinheems in de praktijk van het multiplexen die het mogelijk maakt een groot aantal afzonderlijke reacties tegelijk draaien op hetzelfde monster ^1. De OpenArray platform is een toepassing van dit principe ^2; het combineert microarray technologie met real-time PCR. Gebaseerd op het concept van ruimtelijke multiplexing, wordt ieder monster getest op een groot aantal doelen in afzonderlijke doorgangen. Dit platform werd aanvankelijk gebruikt met cyanine gebaseerde dubbelstrengs DNA-bindende chemie ² en is nu beschikbaar voor-probe gebaseerde chemie met behulp van donkere blussen probes ^3. Dit platform is voornamelijk gebruikt voor genetische profielen bij mens en dier ^{4 5.} Onlangs werd aangepast door bloed overgedragen DNA en RNA pathogenen te detecteren door Grigorenko et al. ⁶ onder toepassing van een tweestaps-omgekeerde transcriptie / pre-amplificatie (voorversterker) procedure.

We beschrijven hier een één-stap-voorversterker gebaseerde procedure voor het opsporen van beide soorten van ziekteverwekkers in de luchtwegen secretions en diverse andere soorten monsters die volledig kan worden uitgevoerd in een standaard werkdag. Na voltooiing van de eenstaps voorversterker, worden monsters overgebracht naar een 384-well plaat, wat het formaat van het automatische vloeistofverwerkingsysteem die bij dit nanoschaal PCR platform aanvaard. Het systeem maakt de master mix en monster over het oppervlak van maximaal 4 platen (192 monsters en controles) per keer. Vervolgens laadproces wordt beschreven hoe monsters worden geamplificeerd en geanalyseerd met een macro spreadsheet dat het gemiddelde van 3 technische replicaten per monster / target combinatie samengevat in een tabel die past op één vel.

Een uniforme werkwijze voor het analyseren geëxtraheerde DNA en / of RNA uit monsters met deze platform opgericht. Een grote verscheidenheid aan monsters werden geëxtraheerd, omgekeerd getranscribeerd en voorversterkte in een 96-well formaat, het minimaliseren van de kans op fouten. geteste respiratoire monsters die nasale uitstrijkjes, diep in de keelholte wattenstaafjes,trans-tracheale wast, bronchoalveolaire lavage, en longweefsel. Aangezien enkele van de geteste kunnen ook in perifeer bloed of ontlasting zijn middelen opgenomen we die soorten monsters in de procedure. Deze gestroomlijnde workflow helpt tijd en middelen in vergelijking met het uitvoeren van experimenten in meerdere platen door het inschakelen van een efficiënte het testen door middel van panelen op basis van pathogenen en toxine-gen detectie in plaats van de individuele testen te redden. De respiratoire panel hier gedemonstreerd hadden 18 assays elkaar gedrukt in drievoud doorgaande gaten, voor maximaal 48 monsters per plaat. Paarden ziekteverwekkers gedetecteerd inbegrepen equine adenovirus 1 en 2, equine arteritis virus, equine rhinitis virus A en B, equine herpesvirus (EHV) typen 1 en 4, en Streptococcus equi. De hond ziekteverwekkers opgenomen hoektand respiratoir coronavirus (betacoronavirus), hondenziekte virus, canine adenovirus, canine para-influenza virus, honds pneumovirus, Bordetella bronchiseptica en Mycoplasma cyno. EENuniverseel influenza A assay en een interne controle (MS2 RNA-faag) werden ook opgenomen.

Protocol

Geen menselijke proefpersonen of proefdieren werden gebruikt voor de ontwikkeling van dit protocol. Controles werden gegenereerd door zuivering van sequentie bevestigde amplicons en in vitro transcriptie van RNA targets. Klinische monsters werden voor routinematige diagnostische testen om de Cornell Animal Health Diagnostisch Centrum ingediend.

1. Ontwerp van de Plaat

1. Gebruik primer design software om te controleren of elke test voldoet aan de standaard-probe op basis van real-time PCR cycling omstandigheden met 60 ° C gloeien met behulp van de primer probe test tool (selecteer de kwantificering sonde instelling met standaard parameters).
   Opmerking: De representatieve RNA doelwit gebruikt werd aangepast van de universele influenza A matrix gerichte assay gepubliceerd door Shu et al ^7.. De primers en de probe zijn als volgt: Forward primer: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Reverse Primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Probe: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. De vertegenwoordiger van de DNA-test die hier gebruikt werd weer aangepastben het soort paarden herpesvirus 1 (EHV-1) detectiemethode gepubliceerd door Elia et al. ^8. De primers en de probe zijn als volgt: Forward primer: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Reverse Primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Probe: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. Bestellen nanoschaal PCR amplificatie platen in de gewenste configuratie.
   OPMERKING: Voor deze studie werd de 18x3 genexpressie formaat gebruikt (tabel 1). Verschaffen sequenties voor primers en probes (of geïnventariseerd assay ID's) voor elk dier waarvoor de fabrikant.

2. Nucleic Acid Extraction

1. Extract totale nucleïnezuur (DNA en RNA) van elke gewenste werkwijze.
   LET OP: Een geautomatiseerde magnetische bead-based extractie kit werd hier gebruikt volgens de instructies van de fabrikant (zie de materialen tabel voor meer details).
2. Bereid monsters als volgt:
   1. Maak de buitenkant van elk monster container met 10% bleekwater en afdrogen. Veeg gehandschoende finger tips met 10% bleekwater tussen monsters om kruisbesmetting te voorkomen.
   2. Plaats nasale faryngeale of diep swabs in een steriele, gesloten flesje (bijvoorbeeld een rode top bloedafnamebuis) met enkele druppels zoutoplossing toegevoegd om uitdroging vóór verwerking.
      LET OP: katoen, plastic, hout-behandeld, en Dacron en andere synthetische swabs zijn allemaal aanvaardbaar, maar vermijd calciumalginaat swabs.
   3. Voor swabs en trachea wast, voeg Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), zodat er ten minste 1-2 ml vloeistof. Vortex het staafje en DMEM krachtig in de buis. Gebruik vervolgens een pipet ongeveer 1 ml medium overbrengen naar een nieuwe buis.
   4. Mechanisch Lyse weefsels (100-200 mg in 1 ml DMEM) met een tissue disruptor volgens de instructies van de fabrikant gevolgd door centrifugatie gedurende 3 min bij 825 x g. Transfer 500 pi van het supernatant naar een nieuwe buis.
   5. Voor uitwerpselen Combineer 400 mg feces met 800 gl 1 x met fosfaat gebufferde salijn pH 7,4 (PBS). Vortex de suspensie gedurende 1 min of meer tot het monster gehomogeniseerd of volledig onderbroken. Eenmaal gehomogeniseerd, centrifuge de suspensie gedurende 10 min bij 18.000 xg, vervolgens over 400 ul naar een nieuwe buis.
   6. Voor de hele uncoagulated bloed, vortex het monster en een 250 ul aliquot. Voeg zes druppels lytisch reagens en vortex te mengen. Incubeer 15 min bij 37 ° C.
3. Bereid lysis en wassen buffers volgens de instructies van de fabrikant. Voeg MS2-faag of een interne controle van de keuze om de lysisbuffer als een interne positieve extractie controle ^9.
4. Voeg 235 ul lysis buffer en 175 gl monster (of PBS negatieve controle) aan elke kraal buis. Ga verder met het protocol van de fabrikant.
   LET OP: Gezuiverd totaal nucleïnezuur werd hier geëlueerd in 90 pi.

3. Reverse transcriptie / Pre-amplificatie (voorversterker)

LET OP: Houd alle reagentia en samples gebruikt inde voorversterker reactie op ijs te allen tijde. Na voorversterker, houden alle reagentia bij kamertemperatuur.

1. Assembleren geëlueerde DNA en / of RNA, PCR Reaction Mix, nuclease-vrij water als negatieve controle, en samengevoegd normen voor de positieve controle-amplificatie.
   LET OP: Tot 48 monsters kunnen worden uitgevoerd op een versterking plaat inclusief controles (ten minste één negatieve extractie besturing voor elke extractie plaat waaruit monsters worden getrokken).
2. Druk een sample kaart. Laat een tweede persoon te controleren of de kaart en voorbeeld lay-out wedstrijd.
3. In een 1,5 ml tube, het volgende toevoegen aan de voorversterker master mix voor te bereiden.
   LET OP: Een laatste volume van 14 ul werd gebruikt hier.
   1. Voeg een pool van voorgemengde primers van elk doel, zodat de uiteindelijke concentratie van elke primer 900 nM.
      LET OP: Het zwembad hier gebruikt werd bereid bij een 10x concentratie, en 1,4 pl toegevoegd per reactie.
   2. Voeg willekeurige primers tot een uiteindelijke concentratie van 600 nM of 0,1x. Add 2x RT-qPCR mix helft van het eindvolume (7 pi hier).
   3. Meng de master mix componenten met elkaar door voorzichtig vortexen en te stoppen met draaien.
4. Voer de voorversterker in een standaard 96-putjesplaat met de linker zijde van de plaat alleen (kolommen 1-6).
5. Voeg 8,5 gl voorversterker hoofdmengsel en 5,5 pl DNA / RNA-monster aan elk putje.
6. Na het combineren van alle reagentia (monsters positieve controles en negatieve controles voorversterker mix), grondig sluit de standaard 96-putjesplaat namelijk kleefband. Verwijder overtollig afdichting met behulp van een scheermesje om de vorming van afdichting gaten tijdens het fietsen te voorkomen. Centrifugeer de verzegelde plaat gedurende 20 seconden met behulp van een PCR-plaat spinner. Controleer alle reagentia worden gecombineerd in de bodem van de putjes.
7. Run de voorversterker assay op een gebruikelijke thermocycler onder de volgende omstandigheden: 15 min bij 50 ° C; 1 min bij 95 ° C; 20 cycli van 15 sec bij 95 ° C, daarna 2 minuten bij 60 ° C; 99,9 & #176; C gedurende 10 min; houden op 4 ° C. Programma deze voorwaarden voorafgaand aan het starten.
8. Zet de conventionele thermocycler, selecteert u de voorversterker fietsen programma en start het programma. Plaats de 96-wells plaat in de thermocycler wanneer het onderste gedeelte van de thermocycler (niet kaft) de temperatuur die nodig is voor de productie van cDNA (50 ° C) door de temperatuur lezen op het scherm bereikt. Daarvoor houden de plaat koud het risico van het produceren van vals positieve resultaten te minimaliseren.
9. Zodra de voorversterker run is voltooid, controleert u of de plaat is gebleven verzegeld.
10. Gaat u direct naar stap 4.1. Om deze plaat 's nachts op te slaan, voert u de verwatering, zoals beschreven in de stappen 4,2-4,5, behalve in plaats van los die de plaat, sluit de plaat met een duidelijke kleefband en plaats binnen een rits-lock zakje, opgeslagen bij 4 ° C.

4. Verwatering van voorversterker Plate

1. Verwijder het juiste aantal amplificatie platen weerm de vriezer (maximaal 4 kunnen worden uitgevoerd in een keer). Laat het verpakkingsmateriaal niet openen. Laat de plaat opwarmen gedurende tenminste 15 minuten bij kamertemperatuur. Noteer het serienummer en het lotnummer van de plaat.
   OPMERKING: Ongeopende platen kunnen bij kamertemperatuur gedurende maximum 24 uur, maar voor de beste praktijken, verwijder deze uit de vriezer niet meer dan 30 minuten voor nodig.
2. Centrifugeer de voltooide voorversterker plaat gedurende 20 seconden met behulp van de PCR-plaat spinner. Zet de versterking apparaat en de computer en start het bijbehorende programma.
3. Verwijder alle overbodige items uit een PCR-setup omgeving. Doe dubbele handschoenen en mouw covers.
4. Verwijder de afdichting van de voorversterker bord en verwijder voorzichtig en gooi de buitenste handschoenen. Verdun de voorversterker producten bij 1: 5 door toevoeging van 56 ui TE-buffer aan elk putje kolommen 1-6 van de 96-well plaat voorversterker en mengen door en neer te pipetteren. Alleen naar de eerste halte van de pipet, opzuigen van de bodem en het doseren hoger, maar niet het creëren vanbubbels. Voeg TE-buffer om alle 6 kolommen, ongeacht de gebruikte bronnen.
5. Verzegelt de plaat met ofwel een doorzichtige tape of folie afdichting en centrifugeren het voor 20 sec met behulp van de PCR-plaat spinner. Stel deze plaat opzij (losjes overdekt) tot stap 6.1 is voltooid. Gooi resterende handschoenen en mouw covers.

5. Voorbereiding voor 384-wells Transfer naar Amplification Plate

1. Het opzetten van de materialen die nodig zijn om te dekken en sluit de versterking plaat: deksel, stop, spuit onderdompeling vloeistof, plaat pers, ethanol squirt fles, en niet-pluizende laboratorium doekjes. Verwijder de dop van de injectiespuit en zet een kleine plastic tip op de spuit (vereist kracht). Eject een kleine hoeveelheid van de onderdompeling vloeistof op een papieren handdoek om lucht opbouw te verwijderen (het is ok als enkele kleine luchtbelletjes in de top te blijven). Gebruik de immersievloeistof binnen 60 minuten van het verwijderen van de spuit uit de vacuüm aluminiumzak. Zodra een spuit wordt geopend, niet plaats de kap voor later gebruik.
2. checkdat de afvalbak van de plaat laden vloeistof handler is leeg en open de doos van de tips. Schrijf de vervaldatum van de tips op het puntje deksel wanneer er een nieuwe doos wordt geopend, en ervoor zorgen dat de uiteinden niet verstreken. Zet de vloeistof handler en de computer en open de vloeistof handler software, die een zelftest zal uitvoeren.
3. Klik op "Setup en Load". Klik op "Browse" om het CSV-bestand gemaakt op basis van de Sample Tracker software te selecteren. Als het bestand niet wordt weergegeven, ga naar "Instrument Preferences / Edit" en vervolgens op "Change" door "Sample Plate Folder File". Selecteer de map waarin het csv-bestand wordt opgeslagen. Klik vervolgens op "Setup en Load", dan "Bladeren" en selecteer het bestand.
4. Vervolgens klikt u op "Browse" naast de "Plate Holder Stand 1" en selecteer het TPF bestand (verstrekt door de fabrikant) dat hetzelfde serienummer als de plaat.

6. Liquid Handler Transfer

Opmerking: Begin niet fivullen van de 384-well plaat tot alle bovenstaande stappen zijn voltooid. Verdamping is een punt van zorg met kleine volumes - laat niet de 384-wells plaat zitten ontdekt met vloeistof in.

1. Nadat alle bovenstaande stappen zijn voltooid gezet op nieuwe, goed ingerichte dubbele handschoenen en mouw dekt. Voeg vervolgens 2,5 ul van versterking master mix van een 384-wells plaat.
2. Transfer 2.5 ul van verdund voorversterker product aan de 384-wells plaat volgens de kaart in tabel 2 en onmiddellijk de plaat te dekken goed af met een folie afdichting. Gooi buitenste handschoenen en mouw covers.
3. Centrifuge de 384-wells plaat gedurende 20 seconden in de PCR-plaat spinner.
4. Verwijder de folie afdichting, maar plaatst u de 384-wells plaat in de vloeistof handler.
5. Open het pakket met een ingepakt versterking bord en plaats deze voorzichtig in de vloeistof handler in de eerste sleuf met het serienummer op de rechter - in het bezit van de zaak door de randen zonder het aanraken van het oppervlak of de plaat. Gebruik ongeopende platen binnen een uur na opening.
   Opmerking: Het doel van de behuizing is aan de plaat te beschermen tegen aanraking, aangezien de kleine hoeveelheid primers en probes in de doorgaande openingen kunnen verstoren.
6. Verwijder de folie afdichting van de 384-wells plaat in de vloeistof handler een keer alles op zijn plaats. Klik op Volgende en controleer vervolgens alle vakken als elke stap is voltooid. Klik op OK om de run te starten.
7. Sluit de deur om de vloeistofmanipulator en geeft de vulproces beginnen. Blijven naast de vloeistofmanipulator en onmiddellijk naar de volgende stap nadat de plaat gevuld.
8. Terwijl de vloeistofmanipulator loopt, verwijdert de beschermende laag van de bodem van een kofferdeksel.
   Opmerking: het kleefmiddel aan de onderkant van het kofferdeksel onder een rode band en een beschermende film. De film dient eerst om de rompslomp te verwijderen.
   1. Laat de bovenste laag in plaats totdat stap 6.15. Prime de administratieve rompslomp door iets te trekken naar release uit de lijm.
9. Verwijder de geladen (gevulde) versterking plaat uit de vloeistof handler en voorzichtig plaats deze in de plaat pers met het serienummer aan de rechterkant.
10. Plaats het deksel bovenop de plaat met de ingekeepte einde rechts en lijm aan de onderzijde (richting van de plaat).
11. Trek op de plaat pers hendel zorgvuldig te sluiten; het licht knippert gedurende 20 sec. Laat de plaat pers niet aan tijdens deze periode. Zodra het lampje continu groen, til de hendel voorzichtig en verwijder voorzichtig de verzegelde plaat door vast te houden aan de randen.
12. Terwijl de verzegelde versterking plaat verticaal door de randen van de zaak, onmiddellijk plaatst u de spuit in de haven van belading aan het einde van de zaak, dan afzien van de onderdompeling vloeistof langzaam in een zachte vloeiende beweging naar de ruimte tussen de plaat en het vullen deksel. Laat een kleine luchtbel in de hoek wanneer de plaat wordt ondergedompeld.
13. Terwijl u houd de plaat verticaal door de randen, sluit de laadhaven door het inbrengen van de stekker in de haven en het verdraaien van de stekker met de klok mee, het toepassen van voldoende druk totdat het handvat afbreekt. Pak de randen van de behuizing vast zodat de kracht van de greep breken veroorzaakt niet het geval te laten vallen. Als een plaat is gevallen, gooi hem weg.
14. Reinig de behuizing met een pluisvrije doek, dat grondig is besproeid met ethanol. Om de zaak te drogen, veeg de zaak naar beneden met een schoon te vegen. Voorzichtig omgaan met de zaak; zeker druk uitoefenen op het glas boven de putjes.
15. Breng de verzegelde plaat om de versterking machine. Onder het tabblad "Instrument", selecteer "Instrument Console." Selecteer de versterking machine klik op de knop "Open Deur".
16. Plaats de versterking plaat in de eerste sleuf van de plaat adapter en controleer of de adapter goed up is bekleed met A1 in de linker bovenhoek. Richt de plaat met de barcode naar boven en in de richtingde voorzijde van het instrument. Klik op de "Sluit klep" knop. Let op het gebruik van de adapter tray - er is een maximum van 10 toepassingen.
17. Onder het tabblad Start aan de onderkant van het scherm, onder het menu Run, selecteert OpenArray. Klik op 'Get Plate ID's. " De lege dozen worden automatisch gevuld met informatie over de plaat. Om de run te beginnen, klikt u op 'Start Run ".
18. Sluit de vloeibare handler software en zet de vloeistof handler. Plaats de tip deksel over de tip rack. Gooi de tips van de afvalbak en reinigen. Schoon en ontsmetten van alle items, waaronder het werkvlak, pipet, emmer, en tips boxen.
19. Verzegelt de voorversterker plaat met een duidelijke kleefband en bewaar bij -20 ° C.

7. Resultaat Analyse

1. Zodra de run is voltooid, sla het bestand en klik vervolgens op de "X" op het tabblad met de run naam aan de onderkant van het scherm om het bestand te sluiten.
2. Klik op "Open Deur"Aan de bovenkant van het scherm om de deur te openen. Verwijder de versterking plaat, controleren dat er geen onderdompeling vloeistof is uitgelekt. Klik op" Sluit de deur "aan de bovenkant van het scherm om de deur te sluiten.
3. Klik op "Open" en selecteer de run-bestand om het te openen. Druk op de groene knop Analyseren in de rechterbovenhoek van het scherm. Klik op "Export" aan de linkerkant van het scherm en vervolgens op "Start Export" om de resultaten te exporteren (als txt-bestand). Minimaliseer het bestand na het opent. Klik vervolgens op "Export QC afbeeldingen."
4. Beoordeel QC beelden in de beeldanalyse programma volgens de volgende criteria:
   1. Beoordelen van het laden van hoge kwaliteit met behulp van PRE-READ_CHANNEL_4.tiff en POST-READ_CHANNEL_4.tiff, door te controleren dat er geen donkere vlekken of vlekken.
      OPMERKING: Een kleurstof gedetecteerd door dit kanaal wordt toegevoegd door de fabrikant aan de primers en probes, die in oplossing vrijkomt bij de reactie geladen. De lezing in dit kanaal geeft aan dat de reacties niet goed warengeplaatst en de primers en probe gemengd met kleurstof aanwezig waren.
   2. Controleer op lekken of agitatie aan de plaat na het inladen met S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. Als het beeld ziet er donker, verhoogt u de helderheid (druk op Ctrl + Shift + C om de controles te openen) totdat de gehele plaat zichtbaar is. Controleer dat het beeld ziet er uniform zonder schaduwen, bellen, of verplaatst samples.
   3. Evalueren deksel plaatsing en puin onder het deksel (lichtpuntjes) met behulp van STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff en STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. Optioneel: Open een spreadsheet met daarin de resultaten Macro (Aanvullende code-bestand). In het geëxporteerde bestand, klik met de rechtermuisknop op de tab aan de onderkant van het scherm en selecteer "Verplaatsen of Kopiëren". In het veld "te boeken", selecteer "Resultaten Macro.xlsm". Klik op "Move to end" en vink het vakje "Create kopiëren". Klik vervolgens op OK.
   1. Als de optie Resultaten Macro niet wordt weergegeven in het veld "te boeken", simply kopieert u de inhoud van het geëxporteerde bestand werkblad (klik op de linkerbovenhoek cel om alle cellen te selecteren en Ctrl-C) en plak deze in een nieuw tabblad.
6. Verwijder het tabblad oude "Export" en vervolgens de naam van het tabblad nieuw toegevoegde als "Export".
7. Klik op 'Alt-F8' (of klik op vervolgens op Macro's) te selecteren en vervolgens "Macro" en klik op "Run". Herhaal dit voor Macro2 door te klikken op "Alt-F8" en vervolgens te kiezen voor "Macro2" en te klikken op "Run".
8. Hernoem de resultaten Macro-bestand met de relevante informatie (datum en het serienummer), zet deze informatie boven tafel, en opslaan als dezelfde bestandsnaam in de geëxporteerde map Results. Tot slot een afdruk van de macro-gegenereerde resultaten tafel.
9. In de amplificatie machine software, controleert u de curves voor elk monster en controle tegen de macro tafel door het selecteren van Analyse / Amplification Plot aan de linkerkant van het scherm. Vervolgens selecteert u het tabblad Sample, en klik op elk monster tebevestigen dat er 2 of 3 positief amplificatie curves voor elk van de positieve resultaten in de tabel.
10. Schakel de versterking machine.

Representative Results

Resultaten worden in figuren 1 en 2 voor een representatieve RNA assay (influenza matrix) en DNA-assay (EHV-1) met een combinatie van positieve controles en voor routinematige diagnostische geteste klinische monsters. De fluorescentie uitgezonden signalen in deze kenmerkende reactie worden getoond in Figuur 1, die rauw fluorescentiewaarden uitzet per cyclus. Alle relatieve cyclus drempel (CT) waarden werden automatisch gegenereerd door de versterking machine software. Achtergrondfluorescentie werd gebruikt als maatstaf voor afzonderlijke beoordeling van lading kwaliteit dan nemen in de fluorescentie metingen uit te berekenen Ct waarden.

De analytische aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor elk doel werd berekend gebaseerd op het totale gemiddelde van de Ct-waarden bij de 95% detectieniveau plus 2 standaarddeviaties in een pool van controles opalle doelen. De hoogste verdunning waarbij ten minste 95% van de duplo positief voor de representatieve assays was 50 kopieën; detectie van 5 exemplaren was succesvol in 50% duplo. Noch test werd ontdekt op minder dan één exemplaar. De LOD van het RNA en DNA assay werden berekend Ct-waarden van 21,92 en 20,05. Deze waarden werden beschouwd als de cutoffs voor rapportage waarden als positief vs. verdachte (potentieel niet herhaalbaar) zijn.

Andere aspecten van de analytische prestatie van de targets werd beoordeeld met seriële verdunningen van samengevoegde positieve controles uitgevoerd op drie verschillende dagen (figuur 2). De gemiddelde rendementen van de vertegenwoordiger van de RNA en DNA-testen waren 101,1% en 106,6%; de totale gemiddelde rendement voor alle doelen was 101,3%. De assays had ook goede lineariteit ^(R2> 0,98). Variatie binnen repliceren doorgaande gaten was typisch binnen standaarddeviaties van 0,2 voor zowel klinische monsters eend controles. Geen cross-reactiviteit tussen een van de doelen werd waargenomen.

De definitieve resultaten werkblad in de aanvullende dossier blijkt representatief kwantitatieve resultaten van 10 klinische diagnostische monsters en 4 controles. De klinische monsters vormen een deel van de soorten monsters routinematig getest zoals nasale / orofarynxswabs, longweefsel en fecale monsters. One (paarden) fecesmonster in deze set toont een mislukte MS2 interne controle, die de aanwezigheid van remmers in het monster aangeeft. Dit wordt typisch beheerd door verdunning van het geëlueerde monster en / of herextractie. Zoals hier het geval is, moet de negatieve versterking controle negatief voor alle doelen, en de negatieve extractie controle mogen alleen de interne controle bevatten. In de klinische set, monsters geproduceerd Ct-waarden voor betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, hondenziekte virus A, Canine para-influenza virus, honden pneumovirus, en griepEEN.

Figuur 1. Amplificatie plots. Fluorescentieaflezingen uitgezet tegen amplificatiecycli de RNA assay (A) en DNA-assay (B). Driehoeken worden weergegeven ter aanduiding van Ct-waarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Standaard curven. Standaard krommen van RNA en DNA assay getest op drie verschillende dagen worden uitgezet om de lineariteit en het bereik van amplificatie met behulp van positieve controles aantonen. Cycle drempel (CT) waarden worden uitgezet tegen log (10) van het aantal kopieën van RNA (A) of DNA ( Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Schematische voorstelling van de amplificatie plaat en doellocaties. De platen voor nanoschaal real-time PCR proeven op dit platform microscoopglaasje groot en zijn in 48 subarrays van 64 doorgaande gaten, met een totaal van 3072 doorgaande gaten individuele reacties. Een subarray wordt hier getoond, met 18 doelen in drievoud. Elk monster wordt één subarray toegevoegd door de vloeistof handler. Platen worden bekleed met hydrofiele en hydrofobe verbindingen reagentia in doorlopende gaten houden via oppervlaktespanning. De roestvrijstalen chip wordt "fotolithografisch patroon en nat-geëtst om een ​​rechtlijnige reeks van 3072 micro-gefreesd, 320 urn diamete vormen. r gaten van 33 nl elke ^"2 Afkortingen voor doelen zijn als volgt: BCOR, hoektand respiratoir coronavirus (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, honden adenovirus, CPIV, canine para-influenza-virus; CPNV, hoektand pneumovirus; DISTA / B, hoektand distemper virus A en B; EADV1 / 2, equine adenovirus 1/2, EAV, equine arteritis virus, EHV1 / 4, equine herpesvirus Type 1/4, Minerva / B, equine rhinitis virus A / B, IVM, influenza A matrix; MCYNOS, Mycoplasma cyno, MS2, interne controle (MS2 RNA-faag); lovert, Streptococcus equi.

Tabel 2. Plate overdracht kaart. Een kleurcode plaat overdracht kaart voor het gebruik van een vast 8-kanaals pipet om van de 96-well voorversterker plaat om de 384-wells plaat wordt getoond. Alternatief kan een instelbare pipet gebruikt. Dezelfde procedure wordt uitgevoerd telkens onafhankelijk van h ow veel monsters in de plaat.

Aanvullende bestand. A-macro-werkblad bestand met twee macro's voor de opmaak resultaten in een samenvattende tabel (zoals beschreven in het protocol) is voorzien. Een typisch resultaat tabel gegenereerd door de macro wordt opgenomen in het bestand (onder Eindresultaten). De twee macro's in de sample namen in de eerste kolom (maximaal 48 monsters) en het gemiddelde van de drie Ct-waarden voor elk doel voor die met positieve resultaten vullen; er rekening mee dat de doelstellingen die niet versterken verschijnen blanco in deze tabel. Dit kan gemakkelijk worden afgedrukt op een vel papier en als referentie voor het efficiënt controleren van de ruwe data. In het tabblad eindresultaten worden representatieve resultaten voor 10 klinische monsters en 4 controles getoond. Afkortingen voor de test namen zijn vermeld in de legende van tabel 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "target =" _ blank "> Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Deze werkwijze is gebruikt voor het routinematig testen van respiratoire pathogenen in ons laboratorium in de loop van zes maanden (2-3 keer per week). We hebben ook succesvol onder toepassing van dezelfde procedure darmpathogeen profilering in fecale monsters en bacteriële isolaten op een afzonderlijk aangepaste plaat. Zodra de platen worden geproduceerd, kunnen ervaren personeel stappen 2-7 binnen één standaard werkdag af te ronden. De belangrijkste stappen zijn de goede afdichting van de voorversterker plaat, de overdracht van voorversterkte monsters tussen platen (die snel moet worden gedaan om verdamping te voorkomen) en de eindafdekking van de amplificatie plaat. Gebruik van de macro spreadsheet als leidraad voor resultaat analyse (controle curves voor monsters en controles) werd ook kritiek omdat het in sterke mate de hoeveelheid tijd en papierwerk daarvoor benodigde verminderd. De verstrekte macro spreadsheet is een voorbeeld; zou moeten worden gewijzigd of opnieuw gemaakt voor platen met verschillende configuraties. Dit kan gemakkelijk worden performed door iemand met elementaire spreadsheet kennis.

Vanwege de zeer kleine hoeveelheid monster op de amplificatie plaat (33 nl) geladen wordt voorversterking vereist. In de optimalisatie van dit protocol (niet getoond), vergeleken we een aantal parameters waaronder de voorversterking master mix toevoeging van willekeurige primers, aantal cycli, annealing tijd en verdunning voorafgaand aan amplificatie. Elk doel had zijn eigen optimale omstandigheden en de hier beschreven vertegenwoordigen degenen die de beste detectielimiet totale opgeleverd voor ons panel. Dit paneel omvat een breed scala van pathogene targets en soorten monsters die zijn aangetroffen in routine diagnostische veterinaire testen, maar aanpassingen aan de voorversterking procedures kan het noodzakelijk zijn voor de verschillende panels. De fabrikant geoptimaliseerde amplificatie condities zijn gebaseerd op een standaard probe gebaseerde real-time PCR protocol met een 10 min bij 95 ° C enzymactivering gevolgd door denaturatie bij 95 ° C en annealing / verlenging bij 60 ° C. De primers en probes zijn voorgedrukt op de plaatjes ook met behulp fabrikant geoptimaliseerde omstandigheden en daarom niet nodig titratie. Het combineren van de reverse-transcriptie en pre-amplificatie stappen voor alle monsters (ongeacht het type van het doel) was nodig om de efficiency in de workflow handhaven. Met alle monsters reverse getranscribeerd is ook gunstig voor maximale gevoeligheid. Verder gebruik van master mix voor de voorversterker die is geoptimaliseerd voor het minimaliseren remmers veelzijdigheid maakt een combinatie van verschillende types monster op dezelfde plaat.

Het Center for Disease Control (CDC) influenza matrix assay beschreven door Shu et al. ⁷ en aangepast hier nanoliter schaal reacties is een universeel influenza A assay die geschikt voor het testen van monsters van mensen en huisdieren is. Het is gemaakt voor universele detectie van het matrix gen van influenza A virussen met behulp microliter schaal reaCTIES. Het is de hele wereld gebruikt als onderdeel van een CDC menselijk griepvirus Panel en een CDC Swine Flu Panel. Het EHV-1-test ⁸ hier aangepast detecteert een belangrijke respiratoire pathogeen van paarden die abortus en neurologische ziekte (beoordeeld door Pusterla en Hussey ¹⁰⁾ kan veroorzaken. Het belang van de aanpassing van deze tests om een ​​high-throughput platform met een soort-onafhankelijke interne controle is dat ze in een OneHealth surveillance aanpak kan worden opgenomen. Met beide deze assays op een high-throughput testen platform zal de voorbereiding op ongevallen voor de klinische faciliteiten, schuilplaatsen, en de prestaties evenementen te vergemakkelijken.

De hierboven beschreven resultaten waren representatief voor alle doelen op het bord behalve Mycoplasma cyno, die aanzienlijk meer variatie in de analytische prestatie liet zien. Dit was waarschijnlijk te wijten aan de sub-optimale smelttemperatuur _(Tm) van de primers, die idealiter 58-60 &# 176, C (het ideale probe Tm 68-70 ° C). Een beperking van dit platform is dat het langer duurt om het ontwerp en de vervaardiging van de platen dan voor het bestellen van afzonderlijke sondes, die het vermogen om snel sequenties wijzigen beperkt. Een andere beperking van real-time PCR in het algemeen is het onvermogen om nieuwe en onverwachte ziekteverwekkers te detecteren. Dit kan worden ondervangen enigszins door het ontwerpen van assays die overeenkomen met sequenties in verschillende soorten, maar onpartijdige whole genome sequencing-gebaseerde methoden zijn geschikt voor de ontdekking van nieuwe middelen. ^11,12

Nanoschaal real-time PCR kan een nieuw paradigma voor-syndroom basis in plaats van-soorten aan de hand testen, wat nuttig is voor het verminderen van reagens en arbeidskosten in high-throughput moleculaire diagnostiek. Grootschalige panel testen door deze aanpak kan OneHealth surveillance inspanningen, zoals die beschreven door Dunne en Gurfield ¹³ en Moutailler et al. ¹⁴ te vergemakkelijken. Het verzamelen van wattenstaafje monsters vroeg,algemeen binnen 3 dagen na de eerste klinische verschijnselen, biedt de beste kans op de aanwezigheid van respiratoire pathogenen te identificeren. Besmettelijke ziekte opkomst is vaak onvoorspelbaar, en proeven die op verschillende soorten kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak van een wijziging van de reagentia zijn ideaal voor paraatheid. Toekomstige toepassingen van deze technologie zijn waarschijnlijk in virustypering, antimicrobiële resistentie profilering, en verder-syndroom op basis van klinische diagnostische panelen. Nanoschaal real-time PCR is zeer nuttig voor snelle, high-throughput screening van meervoudige monsters en pathogene soorten, en worden aangevuld door onpartijdige of gedeeltelijk voorgespannen sequencing-gebaseerde benaderingen voor het identificeren van nieuwe opkomende pathogenen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0