Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Summary

Nano ölçekli PCR ile DNA ve RNA bazlı patojenlerin yüksek verimlilik testi bir sendromik köpek ve at solunum PCR panelini kullanarak tarif edilir.

Abstract

Nanoliter ölçekli real-time PCR birden deneyleri birbirine tepkileri birleştiren tipik dezavantajları olmadan tek plaka üzerinde paralel çalışmasına izin vermek için mekansal çoğullama kullanır. Biz tasarlanmış ve hızla akut solunum yolu hastalığı olan köpek ve atlarda yaygın bir hastalıktır ajanların varlığını belirlemek için bu ilkeye dayanan bir panel değerlendirdi. Bu yazıda mikrolitre ölçekli reaksiyonlar farklı prosedürler odaklanarak, örnek hazırlama, yükseltme ve hedef patojen dizilerin analizi için bir nano ölçekli teşhissel PCR akışını tarif eder. sunulan solunum panelinde, 18 deneyleri her plaka başına 48 numuneye kapasiteli, üç nüsha olarak kuruldu. Evrensel bir ekstre ve ön amplifikasyon akışı çok matrisler ve DNA ve RNA göre patojenleri karşılamak için yüksek verimli örneği hazırlanması için optimize edilmiştir. Temsilcisi veri bir RNA hedefinin (influenza A matrisi) ve bir DNA hedefe (at herpes virüsü sunulmuştur1). hızlı ve doğru patojen kapsamlı, sendrom tabanlı grup için test etme yeteneği verimlilik ve tanısal testlerin ergonomisini geliştirmek için ve akut solunum hastalığı tanı ve tedavisi için değerli bir araçtır.

Introduction

Tek bir hastalık için test edilen örneklerin büyük sayılar için kullanılan sürece insanlar ve hayvanlar için klinik teşhis birden ajanların hızlı ve kapsamlı tespiti için talebin, patojen tespiti için tek organizma moleküler tanı yöntemleri külfetli bulunmaktadır. Veteriner bağlamda, yüksek verimli teşhis yöntemleri nedeniyle türlerin çeşitli patojenleri kapsayan ek ihtiyaca özellikle önemlidir. bakteri sayısını içerir test ihtiyaçları örnekleridir OneHealth gıda kaynaklı hastalığın tedavisi ve ortaya çıkan bir patojen gözetim yaklaşımlar, virüsler (DNA ya da RNA bazlı), parazit ve mantar. test verimliliğini artırmak amacıyla birlikte birden fazla analitlerin (çoğullama) testleri birleştirerek meydan duyarlılık olası bir kayıp ve optimizasyon ve tahliller onaylanması için büyük bir yüktür.

Nanoliter ölçekli gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir alter olduğunubirçok ayrı reaksiyonlar aynı örnek ¹ üzerinde aynı anda çalışmasına olanak sağlayan çoğullama uygulamasına yerli. OpenArray platformu bu ilkenin ² bir uygulamadır; gerçek zamanlı PCR ile mikroarray teknolojisini birleştiriyor. mekansal çoğullama kavramına göre, her örnekten geçiş delikleri farklı hedeflerin çok sayıda test edilir. Bu platform, başlangıçta cyanine tabanlı çift sarmallı DNA bağlayıcı kimya ² ile kullanılabilir ve karanlık söndürme sondalar ³ kullanılarak prob tabanlı kimya için kullanılabilir oldu. Bu platform, esas olarak, insanlarda ve hayvanlarda ^{4 5} genetik profil oluşturma için kullanılmıştır. Bu en son Grigorenko ve diğerleri tarafından kan yoluyla DNA ve RNA patojenleri tespit etmek için adapte edilmiştir. ^{Şekil 6,} iki aşamalı bir ters transkripsiyon / ön amplifikasyon (pre-amp) prosedürü kullanılarak.

Bu, solunum sn patojen her iki tip tespit için tek aşamalı bir preamplifikatör tabanlı bir prosedür tarifretions ve standart bir iş günü tamamen gerçekleştirilebilir diğer numune türleri çeşitli. tek-aşamalı preamplifikatörün tamamlanmasından sonra, numuneler bu nano PCR platform ile birlikte otomatik bir sıvı taşıma sistemi tarafından kabul biçimi olan bir 384 gözlü plakaya aktarılır. Sistem aynı anda en fazla 4 plakaları (192 numuneleri ve kontrolleri) yüzeyi boyunca ana karışımı ve örnek çizer. Bu yükleme işlemi takiben, numuneler yükseltilir ve basılan tek bir sayfaya sığan bir tablodaki her numune / hedef kombinasyonu için 3 teknik çoğaltır ortalamasını özetleyen bir makro tablo kullanarak nasıl analiz edildiği açıklanmaktadır.

Bu platformu kullanarak örneklerinden çıkarılan DNA ve / veya RNA analiz etmek için bir tek tip bir yöntem kurulmuştur. numune çok çeşitli ekstre ters transkribe ve olası hataları en aza indirmek, 96 oyuklu bir formatta önceden amplifiye edilmiştir. Test Solunum örnekleri nazal bezlerden, derin farengeal bezlerden dahil,Trans-trakeal yıkar, bronkoalveoler lavaj ve akciğer dokusu. Ayrıca, periferal kan ya da dışkıların mevcut olabilir test maddelerinin bazıları için, biz prosedürü Alınan numunelerin bu tür dahil. Bu aerodinamik iş akışı bireysel test yerine panel tabanlı patojen ve toksin geni tespiti yoluyla verimli test sağlayarak birden fazla plakalar deneyler çalışan kıyasla zaman ve kaynak tasarrufu sağlar. Burada gösterilen solunum paneli 18 deneyleri her plaka başına 48 numuneye kadar uzlaşmacı,-deliklerden üç nüsha olarak basılan vardı. Tespit at patojenler at adenovirüs 1 ve 2, at arterit virüsü, at rinit virüsü A ve B, at herpes virüsü (EHV) tip 1 ve tip 4 ve Streptococcus equi dahildir. Köpek patojenler köpek solunum koronavirüsünün (betacoronavirus), köpek distemper virüsü, Kanin adenovirüs, Kanin parainfluenza virüsü, köpek Pneumovirus, Bordetella bronchiseptica, ve Mycoplasma cynos dahildir. birEvrensel İnfluenza A tahlil ve iç kontrol (MS2 RNA faj) da dahil edildi.

Protocol

Hiçbir insan denekler veya deney hayvanları bu protokolün geliştirilmesi için kullanıldı. Kontroller dizisi doğrulanmış amplikonların saflaştırma ve RNA hedefleri için in vitro transkripsiyonu ile üretildi. Klinik örnekler Cornell Hayvan Sağlığı Tanı Merkezi'ne rutin tanısal testler için sunuldu.

1. Plaka Tasarımı

1. her tahlil primer prob testi aracını kullanarak 60 ° C tavlama standart prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR çevrim koşullarına uygunluğunu doğrulamak için astar tasarım yazılımını kullanın (varsayılan parametreleri ile ayarını miktar prob seçin).
   NOT:. Kullanılan temsili RNA hedef evrensel grip Shu ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir matris hedeflenen tahlil ⁷ uyarlanmıştır. aşağıdaki gibi primerler ve prob vardır: İleri primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Probe: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Primer Ters. Burada kullanılan temsili DNA testi fro uyarlanmıştırElia ve arkadaşları tarafından yayımlanan, at herpes virüs tip 1 (EHV-1) tespit metodu m. ^8. aşağıdaki gibi primerler ve prob vardır: İleri primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Probe: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Primer Ters FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. İstenilen yapılandırmada nano PCR plakaları sipariş edin.
   NOT: Bu çalışma için, 18x3 gen ekspresyon biçimi kullanılmıştır (Tablo 1). üreticiye her hedef için tüm primer ve prob (veya envanteri tahlil kimlikleri) için sekansları sağlamaktadır.

2. Nükleik Asit Ekstraksiyon

1. arzu edilen herhangi bir yöntem ile, toplam nükleik asit (DNA ve RNA) ekstrakte edin.
   Not: Otomatik bir manyetik boncuk esaslı çıkarma Kiti, üreticinin talimatlarına göre burada kullanılan (daha fazla ayrıntı için malzeme tabloya bakınız).
2. Örnekler şu şekilde hazırlayın:
   1. iyice% 10 çamaşır suyu ve kuru her numune kabının dışını temizleyin. eldivenli f Wipeçapraz bulaşmayı önlemek için örnekler arasında% 10 çamaşır suyu ile inger ipuçları.
   2. Talep nazal veya tuz birkaç damla (örneğin kırmızı En kan toplama tüpü) herhangi bir steril, sızdırmaz bir şişede derin yutak çubuklar işleme öncesinde kuruma önlemek için ilave edildi.
      NOT: Pamuk, plastik, tahta saplı ve Dacron ve diğer sentetik bezlerden tüm kabul edilebilir, ancak kalsiyum aljinat bezlerden kaçının.
   3. sıvının en azından 1-2 ml olacak şekilde çubuklar ve trakeal yıkama için, Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) ilave edin. tüp içinde kuvvetlice bez ve DMEM karıştırın. Daha sonra, yeni bir tüpe ortamın yaklaşık 1 ml aktarmak için bir pipet kullanın.
   4. 825 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj ile ve ardından üreticinin talimatlarına göre, bir doku Topu ile mekanik olarak lize dokular (DMEM 1 ml 100-200 mg) eklenmiştir. yeni bir tüpe süpernatan 500 ul aktarın.
   5. dışkı için, 1 x fosfat tamponlu sa 800 ul dışkı 400 mg kombinehattı pH 7.4 (PBS). Numune homojenize veya tamamen askıya kadar 1 dakika veya daha uzun süreyle askıya karıştırın. Bir kez homojenize edilmiş, daha sonra yeni bir tüpe 400 ul transfer 18.000 x g'de 10 dakika süre ile süspansiyon santrifüj.
   6. Bütün uncoagulated kan, örnek vorteks ve 250 ul tablet yapmak. karıştırmak için parçalayıcı reaktifle ve vorteks altı damla ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika kuluçkalayın.
3. üreticinin talimatlarına uygun olarak parçalama ve yıkama tamponları hazırlayın. MS2 faj veya bir iç pozitif çıkarma kontrol ⁹ olarak liziz tamponu için tercih edilen bir iç kontrol ekleyin.
4. her bir tane boruya lizis tamponu 235 ul (negatif kontrol ya da PBS) örnek 175 ul ekle. üreticinin protokol ile devam edin.
   Not: Arıtılmış tüm nükleik asit 90 ul burada elüt edilmiştir.

3. Ters transkripsiyon / ön amplifikasyon (pre-amp)

NOT: kullanılan tüm reaktifler ve örnekleri tutunher zaman buz üzerine preamplifikatör reaksiyonu. preamp sonra, oda sıcaklığında, tüm reaktifler tutun.

1. elüt DNA ve / veya RNA, PCR reaksiyon karışımı, nükleaz içermeyen su bir negatif kontrol olarak ve pozitif amplifikasyon kontrolü için bir araya getirilmiş standart bir araya getirin.
   NOT: 48 numuneye kadar kontrolleri de dahil olmak üzere bir amplifikasyon plaka üzerinde çalıştırılabilir (numuneler çekilecek olan her çıkarma plaka için en az bir negatif çıkarma kontrolü içerir).
2. Bir örnek haritası çıktı. harita ve örnek düzeni maç olduğunu ikinci bir kişi kontrol var.
3. 1.5 ml tüp içinde, preamp ana karışımı hazırlamak için aşağıdaki ekleyin.
   Not: 14 ul'lik bir nihai hacim burada kullanılmıştır.
   1. her bir hedeften önceden karıştırılmış bir primer havuzu ekleme şekilde, her primerin son konsantrasyonu 900 nM'dir.
      Not: Burada kullanılan havuz 10x konsantrasyonda hazırlanmış ve 1.4 ul reaksiyon başına ilave edildi.
   2. 600 nM ya da 0.1x nihai konsantrasyona kadar rastgele primerler ekleyin. Nihai hacminin yarısına (7 ul Burada) 2x RT-qPCR karışımı ekleyin.
   3. hafifçe karıştırın ve aşağı iplik birlikte master miks bileşenleri karıştırın.
4. levhanın yalnızca (sütunlar 1-6) sol tarafını kullanılarak standart bir 96-çukurlu plaka içinde preamp gerçekleştirin.
5. preamp ana karışımı 8.5 ul ve her DNA / RNA örnek 5.5 ul iyi ekleyin.
6. Tüm reaktifler (örnekleri, pozitif kontrol ve Ön amfi karışımı ile negatif kontroller) birleştirilmesinden sonra, iyice açık bir yapışkan contası ile standart 96 oyuklu plaka mühür. bisiklete binme sırasında mühür boşlukları oluşmasını önlemek için bir jilet kullanarak herhangi bir aşırı contasını çıkartın. PCR plaka eğiren kullanarak 20 saniye boyunca mühürlü plaka santrifüjleyin. tüm reaktifler plaka kuyuların dibine kombine emin olmak için kontrol edin.
7. aşağıdaki koşullar altında bilinen bir ısıl ilgili ön amplifikatör deneyi çalıştırın: 50 ° C'de 15 dakika; 95 ° C'de 1 dakika; 95 ° C, 2 dakika 60 ° C'de 15 saniye 20 döngü; 99.9 & #176; 10 dakika boyunca ° C; 4 ° C'de tutun. Program başlamadan önce, bu koşullar.
8. Geleneksel PCR açmak preamp bisiklet programı seçin ve programı başlatın. PCR (değil kapak) alt kısmı ekranda okuma sıcaklığının kontrolü ile cDNA üretimi (50 ° C) için gerekli sıcaklığa ulaştığında sadece PCR 96-plaka koyun. Bundan önce, yalancı pozitif sonuç üretme riskini en aza indirmek için plaka soğuk tutmak.
9. preamp çalışma tamamlandıktan sonra, plaka mühürlü kaldı doğrulayın.
10. 4.1 adıma hemen geçin. Gece boyunca, bu plaka depolamak yerine gevşek plaka kaplama hariç adım 4.2 ila 4.5 de tarif edildiği gibi seyreltme gerçekleştirmek için, 4 ° C'de depolanan bir fermuar kilidi torba içinde berrak bir yapışkan contası ve yeri, plaka kapatın.

Preamp Plate 4. seyreltilmesi

1. fro amplifikasyon plakaların uygun sayıda kaldırdondurucu (4'e kadar tek seferde çalıştırmak olabilir) m. ambalaj açmayın. Plaka, oda sıcaklığında en az 15 dakika ısıtın. plaka seri numarası ve lot numarasını kaydedin.
   NOT: Açılmamış plakaları 24 saat kadar oda sıcaklığında kalması, ancak en iyi uygulama, önce gerekli fazla 30 dakika daha dondurucudan bu kaldırabilirsiniz.
2. PCR plaka eğiren kullanarak 20 sn tamamlanan preamp plaka santrifüj. amplifikasyon makine ve bilgisayarı açın ve ilişkili programı başlatın.
3. Bir PCR kurulum alanından tüm gereksiz öğeleri kaldırın. çift ​​eldiven ve kol kapakları koyun.
4. preamp plakasından mühür çıkarın ve dikkatlice çıkarın ve dış eldiven atın. Yukarı ve aşağı pipetleme sütun 96 oyuklu preamplifikatör plaka 1-6 ve karıştırma her bir kuyu için TE tamponu 56 ul ekleyerek 5: 1 ile ön-amplifikatör ürünleri seyreltilir. alttan aspire ve daha yukarı dağıtım fakat yaratmak değil, sadece pipet ilk durağı gitkabarcıklar. Kullanılmayan kuyuların ne olursa olsun 6 sütun TE tamponu ekleyin.
5. net bir yapıştırıcı veya folyo mühür ya plaka Reseal ve PCR plaka eğiren kullanarak 20 sn için santrifüj. kenara bu plakayı ayarlayın (gevşek kapalı) adım 6.1 tamamlanana kadar. Kalan eldiven ve kol kapakları atın.

Amplifikasyon Plate 384-kuyu Transferi 5. Hazırlık

1. kapak, fiş, daldırma sıvısı, plaka basın, etanol fışkırtma şişe ve havsız laboratuvar mendil şırınga: amplifikasyon plakasını kapsayacak ve mühür gerekli malzemeleri ayarlayın. (Kuvvet gerektirir) şırınga kapağını çıkarın ve şırınga üzerine küçük bir plastik ucu kilitleyin. Hava birikintisini temizlemek için kağıt havlu üzerine daldırma sıvısı küçük bir miktar çıkarın (bazı küçük hava kabarcıkları ucunda kalır eğer ok). Vakum mühürlü alüminyum torbasından şırınga çıkarmadan 60 dakika içinde daldırma sıvısı kullanın. bir şırınga açıldığında, daha sonra kullanılmak üzere bir başlık takın değildir.
2. Kontrolplaka yükleme sıvı işleyici atık depo boş ve ipuçları kutusunu açmak söyledi. Yeni bir kutu açıldığında uç kutusu kapağının ipuçları son kullanma tarihini yazın ve ipuçları dolmamış olduğundan emin olun. Sıvı işleyici ve bilgisayarı açın ve kendi kendine test gerçekleştirecektir sıvı işleyici yazılımı açın.
3. "Kurulum ve Yükleme" tıklayın. Örnek Tracker yazılımı oluşturulan CSV dosyasını seçmek için "Browse" düğmesine tıklayın. Dosya görünmüyorsa, "Enstrüman / Düzenleme Tercihler" gidin ve ardından "Örnek Plaka Dosya Klasör" tarafından "Değiştir" e tıklayın. csv dosyası kaydedilir klasörü seçin. Sonra, sonra "Browse" ve dosyayı seçin, "Kurulum ve Yükleme" seçeneğini tıklatın.
4. Sonraki sonraki "Plaka Tutucu Pozisyonu 1" "Gözat" ı tıklayın ve plaka ile aynı seri numarası vardır (üretici tarafından sağlanan) TPF dosyasını seçin.

6. Sıvı Tutucu Transferi

Not: fi başlatmak etmeyinYukarıdaki tüm adımları tamamlanıncaya kadar 384-plaka lling. Buharlaşma küçük hacimli bir husustur - 384-plaka içindeki sıvı ile ortaya oturup izin vermeyin.

1. Bir kez tüm yukarıdaki adımların yeni, iyi donatılmış çift eldiven koymak tamamlanmış ve kol kapsar. Daha sonra, 384 oyuklu plaka amplifikasyon ana karışımı 2.5 ul ekle.
2. Tablo 2'de haritaya göre 384 plaka seyreltilmiş pre-amp ürünün 2.5 ul transferi ve hemen folyo conta ile sıkıca plaka kapsamaktadır. Dış eldiven ve kol kapakları atın.
3. Santrifüj PCR plaka spinner 20 saniye boyunca 384-plaka.
4. folyo mühür kaldırmak, ancak sıvı işleyici 384-plaka koymayın.
5. Bir kaplı amplifikasyon plakasını içeren paketi açın ve sağdaki seri numarası ile ilk yuvaya sıvı işleyici dikkatlice yerleştirin - yüzey o dokunmadan kenarlarından tutun davayıplaka f. açıklığın bir saat içinde kullanıcıya plakalar kullanılmıştır.
   Not: Davanın amacı dokundu olmaktan plaka korumak, bu geçiş delikleri içinde astar ve prob küçük miktarlarda rahatsız olabilir çünkü.
6. Her şey yerinde olduğunu bir kez sıvı işleyicisi içinde 384-plaka folyo mühür çıkarın. İleri'yi tıklatın ve sonra her adım tamamlandığında tüm onay kutularını. koşmak başlatmak için Tamam'a tıklayın.
7. Sıvı işleyici kapağını kapatın ve hemen doldurma işlemini başlatın. Sıvı işleyicisi yanında kalmak ve plaka doldurulur kez hemen bir sonraki adıma geçin.
8. Sıvı işleyici çalışırken, bir vaka kapağın altından koruyucu filmi çıkarın.
   NOT: Olgu kapağının altındaki yapışkan bir bürokrasi ve koruyucu film ile kaplıdır. Film bürokrasiyi erişmek için ilk kaldırılması gerekiyor.
   1. Adım 6.15 kadar yerinde üst filmi bırakın. Releas hafifçe çekerek Başbakan bürokrasiyapışkan o e.
9. Sıvı işleyici yüklenen (dolu) amplifikasyon plakasını çıkarın ve yavaşça sağda seri numarası ile plaka basın yerleştirin.
10. (Plaka bakacak) alt sağ ve yapıştırıcı üzerinde girintili ucu ile plaka üzerine kapağını yerleştirin.
11. dikkatlice kapatarak plaka pres kolu aşağı çekin; Işık 20 saniye boyunca yanıp söner. Bu süre içinde plaka basın dokunmayın. Işık yeşil renkte sürekli yanar sonra, dikkatlice kolu yukarı kaldırın ve dikkatlice kenarlarda tutarak mühürlü plaka kaldırmak.
12. Davanın kenarlarından dikey mühürlü amplifikasyon plakasını tutarken, hemen davanın sonunda yükleme ağzının içine şırınga ucu yerleştirin, daha sonra plaka arasındaki boşluğu doldurmak için bir yumuşak sürekli hareket halinde yavaş yavaş daldırma sıvısı dağıtmak kapak. Plaka batırılır sonra köşede küçük bir hava kabarcığı bırakın.
13. h devam ederkenEski plaka dikey kenarlarından, sap kopana kadar yeterli basınç uygulayarak, limana fişini takmadan ve fiş saat yönünde çevirerek yükleme noktasını kapatın. Kavrama durumunda kenarları sıkıca sap kırma gücü durumda bırakmasına neden kalmaması. Bir tabak düştü ise, onu atın.
14. Tüy bırakmayan bir o silme iyice etanol ile püskürtülür olmuştur ile davayı temizleyin. davayı kurutmak için, silin temiz ile aşağı doğru silin. Yavaşça davayı ele; kuyular üzerinde camına baskı uygulamak değil emin olun.
15. Amplifikasyon makinesine sızdırmaz plaka getirin. "Enstrüman" sekmesi altında, "Enstrüman Konsolu" i seçin. sonra amplifikasyon makineyi seçin "Açık Kapı" butonuna tıklayın.
16. adaptörü doğru sol üst köşede A1 ile dizilmiş olduğunu kontrol plaka adaptörünün ilk yuvaya amplifikasyon plaka koyun. Barkodlu plaka yukarı bakacak ve doğru yönlendirmekCihazın ön. "Kapağını kapatın" düğmesine tıklayın. Adaptör tepsisinin kullanımına dikkat edin - 10 kullanımların bir sınırı vardır.
17. Ekranın alt kısmındaki Ana Sayfa sekmesinde Çalıştır menüsü altında, OpenArray seçin. "Plaka kimlikleri alın." Tıklayın Boş kutular otomatik plaka hakkında bilgi ile doldurulur. çalıştırmak başlamak için, "Başlat Çalıştır" a tıklayın.
18. Sıvı işleyici yazılımını kapatın ve sıvı tutucu kapatın. ucu raf üzerinde uç kapağı yerleştirin. çöp kutusu ipuçlarını atın ve temizleyin. Temiz ve çalışma yüzeyi, pipet, atık kovası ve ipuçları kutuları da dahil olmak üzere tüm öğeleri dekontamine.
19. -20 ° C'de berrak yapışkan mühür ve mağaza ile preamp plakasını kapatın.

7. Sonuç Analizi

1. çalışma tamamlandıktan sonra, dosyayı kaydedin ve sonra dosyayı kapatmak için ekranın altındaki çalışma adıyla sekmesinde "X" üzerine tıklayın.
2. "The Open Door tıklayın"Kapıyı açmak için ekranın üst kısmındaki. Hiçbir daldırma sıvısı dışarı sızdırılmış olduğunu kontrol amplifikasyon plakasını sökün. Tıklayın" kapıyı kapatmak için ekranın üst kısmındaki Kapat Door ".
3. "Aç" ı tıklayın ve açmak için çalışma dosyasını seçin. Yeşil ekranın sağ üst kısmındaki düğmesine Analiz basın. (.txt Dosyası olarak) sonuçları ihracat daha sonra ekranın sol tarafında ve "Başlat İhracat" konulu "Export" düğmesine tıklayın. o açıldıktan sonra dosyayı en aza indirin. Ardından, "İhracat QC Images" i tıklayın.
4. Aşağıdaki kriterlere göre görüntü analiz programı QC görüntüleri gözden:
   1. Hiçbir karanlık noktalar veya lekeler olduğunu kontrol ederek, ÖNCESİ READ_CHANNEL_4.tiff ve POST-READ_CHANNEL_4.tiff kullanarak yükleme kalitesini değerlendirmek.
      NOT: Bu kanal tarafından algılanan bir boya Reaksiyon yüklendiğinde çözelti içine serbest primerler ve problar için imalatçı tarafından ilave edilir. Bu kanal okuma reaksiyonları doğru olduğunu göstermektedirYüklenen ve boya ile karışık primerler ve prob mevcut olduğunu.
   2. S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff kullanarak yükleme sonrasında plaka sızıntı veya ajitasyon kontrol edin. görüntü karanlık görünüyorsa, parlaklık (Ctrl + Shift + kontrolleri açmak için C) tüm plaka görülene kadar artar. Görüntü yok gölgeler, kabarcıklar, ya da yerinden numuneler ile formasını görünüyor olmadığını kontrol edin.
   3. STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff ve STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff kullanarak kapak (parlak noktalar) altında kapak yerleştirme ve enkaz değerlendirin.
5. İsteğe bağlı: Sonuçlar makro (Company kod dosyası) içeren bir tabloyu açın. Dışa aktarılan veri dosyasında, ekranın sağ alt kısmında sekmesine tıklayın ve "Taşı veya Kopyala" yı seçin. "Kitaba" alanında, "Macro.xlsm Sonuçları" seçeneğini seçin. Tıklayın ve kutu "kopyasını oluşturun" kontrol "sonuna kadar taşı". Ardından, Tamam'ı tıklayın.
   1. Sonuçlar Makro seçeneği "kitap" alanında görünmüyorsa, simkat Dışa aktarılan veri dosyasının çalışma sayfasının içeriğini kopyalamak (tüm hücreleri vurgulamak için sol üst hücreye tıklayın ve Ctrl-C) ve yeni bir sekmede yapıştırın.
6. Eski "İhracat" sekmesine silin ve ardından "Export" olarak yeni eklenen sekme yeniden adlandırın.
7. "Alt-F8" Click (veya makrolar Görünüm tıklayın) sonra "Makro" seçin ve "Çalıştır" a tıklayın. Ardından "Alt-F8" sonra "Macro2" seçerek ve "Çalıştır" tıklayarak tıklayarak Macro2 için bu tekrarlayın.
8. ilgili bilgileri (tarih ve seri numarası) kullanarak Sonuçları Makro dosyasını yeniden adlandırın, tablonun üzerindeki bu bilgileri koymak ve İhraç Sonuçları klasörüne aynı dosya adıyla kaydedin. Son olarak, makro oluşturulan sonuçlar tablo çıktı.
9. amplifikasyon makine yazılımında, ekranın sol tarafındaki Analizi / Büyütme Plot seçerek makro tabloya karşı her numune ve kontrol için eğrileri kontrol edin. Sonra, Örnek sekmesini seçin ve her bir numune üzerine tıklayınTabloda olumlu sonuçlar her biri için 2 veya 3 pozitif amplifikasyon eğrileri vardır emin olun.
10. amplifikasyon Makineyi kapatın.

Representative Results

Sonuçlar pozitif kontroller rutin tanı testleri için sunulan klinik numuneler bir kombinasyonu ile temsil eden bir RNA deneyi (grip matris) ve DNA deneyi (EHV-1), Şekil 1 ve 2'de gösterilmiştir. Bu tipik reaksiyon boyunca yayılan floresan sinyalleri döngüsü başına ham floresans değerlerini grafik olarak gösteren Şekil 1 'de gösterilmiştir. Tüm göreli döngü eşiği (Ct) değerleri otomatik olarak büyütme makine yazılımı tarafından üretildi. Arkaplan floresan Ct değerlerini hesaplamak önce floresan okumaları içine dahil ziyade yükleme kalitesinin değerlendirilmesi için ayrı bir ölçüt olarak kullanılmıştır.

Her hedef için tespit analitik sınırı (LOD) hesaplandı kontrollerin bir havuz için Ct% 95 algılama düzeyinde değerler artı 2 standart sapma genel ortalama dayalıTüm hedefler. replika en az% 95 Örnek deneyleri için pozitif en yüksek dilüsyon 50 kopya vardı; 5 kopya algılama çoğaltır% 50 başarılı oldu. Ne tahlil aşağıda bir kopya tespit edildi. RNA ve DNA testi için LODs 21.92 ve 20.05 Ct değerleri hesaplandı. Bu değerler şüpheli vs olarak pozitif (potansiyel olarak değil tekrarlanabilir) raporlama değerleri için sınır değerler olarak kabul edildi.

Hedeflerin Analitik performans diğer yönleri, üç farklı günde (Şekil 2) üzerinde çalışan bir araya getirilmiş pozitif kontrol seri dilüsyonları kullanılarak değerlendirildi. temsili RNA ve DNA testlerinin ortalama verimleri 101.1 ve% 106.6,% idi; Tüm hedefler için, ortalama etkinlik 101.3% idi. Deneyleri de iyi doğrusallık (> 0.98 ^R2) vardı. çoğaltmak içinde Varyasyon geçiş delikleri genellikle hem klinik örnekler için 0.2 standart sapmaları içinde olan bird kontroller. hedefleri arasında hiçbir çapraz reaktivite gözlemlenmedi.

ek dosyada Final Sonuçları çalışma 10 klinik tanı örnekleri ve 4 denetimler için temsili nicel sonuçlarını gösterir. Klinik örnekler örneklerin türlerinin bir alt rutin burun / orofaringeal bezlerden, akciğer dokusu ve dışkı örneklerinin de dahil olmak üzere test edilmiştir. Bu sette biri (at) fekal örnek numunede inhibitörlerinin varlığını gösterir başarısız bir MS2 iç kontrol, gösterir. Bu, tipik olarak elüt numune ve / veya yeniden ekstre seyreltilmesiyle yönetilmektedir. Burada olduğu gibi, negatif amplifikasyon kontrolü tüm hedefler için negatif olmalıdır ve negatif çıkarma kontrolü sadece iç kontrol içermelidir. Klinik setinde numuneler betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica'dan, köpek distemper virüsü A, Kanin parainfluenza virüsü, köpek Pneumovirus ve grip için Ct değerleri ürettiA.

Şekil 1. amplifikasyon çizimini. Fluoresans ölçümleri RNA deneyi (A) ve DNA deneyi (B) amplifikasyon döngüsü karşı çizilmiştir. Üçgenler Ct değerleri gösteren gösterilmiştir edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. standart eğriler. Üç farklı günlerde test RNA ve DNA deneyi Standart eğriler pozitif kontroller kullanan amplifikasyon doğrusallık ve ortaya koymak amacıyla çizilmiştir. Döngü eşiği (Ct) değerleri RNA (A) ya da DNA kopya sayısı log (10) (karşı çizilmiştir Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Amplifikasyon plakası ve hedef nokta Tablo 1. şematik. Bu platform üzerinde nano ölçekli gerçek-zamanlı PCR testleri için kullanılan tabaklar mikroskop lamı boyutlu ve delik 3.072 bir toplam, geçiş delikleri 64, 48 altdizilimlerden düzenlenir Belirli tepkimelerde. Bir altdizilim üçlü olarak 18 hedeflerle, burada gösterilir. Her bir numune, sıvı tutucu yolu ile, bir alt dizisinde eklenir. Plakalar yüzey gerilimi vasıtasıyla geçiş delikleri reaktifleri korumak için, hidrofilik ve hidrofobik bileşikler ile kaplanır. Paslanmaz çelik çip "photolithographically desenli ve 3.072 mikro makinede, 320 um Diamete bir doğrusal dizi oluşturmak için ıslak-kazınmış. aşağıdaki gibi r hedefler için 33 nl her ^"2 Kısaltmalar delikleri vardır: BCOR, köpek solunum coronavirüs (betacoronavirus); Bord, Bordetella bronchiseptica CAV, köpek adenovirüs, CPIV, köpek parainfluenza virüsü, CPNv, köpek Pneumovirus; Dista / B, köpek distemper virüsü A ve B; EADV1 / 2, at adenovirüs 1/2, EAV, at arterit virüsü; EHV1 / 4, at herpes virüs tip 1/4; ERVA / B, at rinit virüsü A / B; IVM, influenza A matris; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, iç kontrol (MS2 RNA faj); dizisine, Streptococcus equi.

Tablo 2. Plaka transferi haritası. 384-plaka 96-kuyu preamp plaka aktarmak için sabit 8-kanallı pipet kullanarak bir renk kodlu plaka transfer haritası gösterilir. Alternatif olarak, ayarlanabilir bir pipet kullanılabilir. Aynı prosedür, h bağımsız olarak, her zaman gerçekleştirilmektedir ow birçok örnekleri plaka bulunmaktadır.

Company dosyası. Özet tabloya biçimlendirme sonuçları için iki makro içeren bir makro etkin tablo dosyası (protokol açıklandığı gibi) sağlanır. makroları tarafından oluşturulan tipik bir sonuç tablosu (Final Sonuçları altında) dosyası yer almaktadır. İki makro örnek adları ilk sütunda (48 örneğe kadar) ve olumlu sonuçlar olanlar için her hedef için üç Ct değerleri ortalama dolduracaktır; yükseltmek vermedi hedefler bu tabloda boş göründüğüne dikkat edin. Bu kolay bir kağıt parçası üzerine basılmış ve verimli bir ham veri kontrol için bir referans olarak kullanılabilir. nihai sonuçlar sekmesinde, 10 klinik örneklerden ve 4 kontroller için temsili sonuçlar gösterilmiştir. Tahlil isimleri için kısaltmalar Tablo 1'de efsanesi listelenmiştir.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "target =" _ blank "> Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Discussion

Bu prosedür, altı aylık (hafta 2-3 kez) boyunca laboratuarda solunum patojenlerinin rutin test için kullanılmıştır. Biz de bir ayrı özelleştirilmiş plaka üzerinde dışkı örnekleri ve bakteriyel izolatların enterik patojen profil için aynı prosedürü kullanarak başarıya sahiptir. Plakalar elde edildikten sonra, deneyimli kadrosu bir standart iş günü içinde 2-7 adımları tamamlayın. en kritik adımlar preamp plakasının uygun sızdırmazlık, (buharlaşmayı önlemek için hızla yapılmalıdır) plakalar arasında preamplified örneklerin transferi ve amplifikasyon plakasının son kaplama vardır. büyük ölçüde bu işlem için gereken süre ve evrak miktarı azalır olarak sonuç analizi (numune ve kontroller için eğrileri kontrol) için bir rehber olarak makro-tablonun kullanımı da eleştirdi. sağlanan makro tablo bir örnektir; farklı konfigürasyonları ile plakaları için değiştirilmiş veya yeniden oluşturulmuş olması gerekir. Bu kolayca pe olabilirtemel tablo bilgisi olan birisi tarafından rformed.

Nedeniyle amplifikasyon plakasına (33 nl) üzerine yüklendi numunenin çok küçük bir miktarı ile, ön amplifikasyon gerekir. Bu protokol (gösterilmemiştir) optimizasyonunda, önceden amplifikasyon ana karışımı, rastgele primerler ilavesi döngüsü sayısı, tavlama süresi ve seyreltme içeren amplifikasyon bir dizi parametre karşılaştırıldı. Her hedef, kendi optimal koşulları vardı ve burada tarif edilen bizim panelin algılama genel klasmanda en iyi sınırını vermiştir o temsil etmektedir. Bu panel patojenik hedefler ve rutin veteriner teşhis testleri karşılaşılan örnek türleri geniş bir yelpazesini kapsayan, ancak amplifikasyon prosedürlerine değişiklikler farklı panelleri için gerekli olabilir. Üretici optimize edilmiş amplifikasyon koşulları 95 ° C ve ann denatürasyon, ardından 95 ° C enzim aktivasyonu bir 10 dakika ile standart prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR protokolü dayanmaktadır60 ° C'de Ealing / uzatma. primerleri ve sondaları önceden basılmış aynı zamanda üretici optimize koşulları kullanarak ve bu nedenle titrasyonu gerekmez plakalar üzerinde bulunmaktadır. (Ne olursa olsun hedef Çeşidi) tüm örnekler için ters transkripsiyon ve ön amplifikasyon adımlarını birleştirerek iş akışı verimliliğini sağlamak için gerekliydi. Tüm örnekler, ters transkribe olması da duyarlılığı maksimize etmek için faydalıdır. Ayrıca, en aza indirilmesi inhibitörleri için optimize edilmiştir preamp için bir ana karışımı kullanılması, aynı plaka üzerinde farklı numune türleri birleştirerek çok yönlülük sağlar.

Hastalık Kontrol Merkezi (CDC) nanolitre ölçekli reaksiyonlar için Shu ve diğ. ⁷ tarafından tarif uyarlanmış grip matris deneyi için Merkezi evrensel influenza insanlar ve eşlik eden hayvanlar test örnekleri için uygun olan bir deneydir. Bu mikrolitre ölçekli rea kullanarak tüm influenza A virüsleri matris geninin evrensel tespiti için dizayn edilmiştirseksiyonlar. Bir CDC İnsan Gribi Virüsü Paneli ve CDC Domuz Gribi Panel parçası olarak tüm dünyada kullanılmaktadır. Burada uyarlanmış EHV- 1 tahlil ⁸ kürtaj ve nörolojik hastalığı (Pusterla ve Hussey ¹⁰ tarafından gözden) neden olabilir atların önemli bir solunum patojeni algılar. Bir türün bağımsız iç kontrol ile yüksek verimli bir platforma, bu testler adapte önemi bir OneHealth gözetim yaklaşım dahil edilebilmesidir. yüksek verimli bir test platformu bu tahlillerin her ikisine birden sahip klinik tesisleri, barınaklar ve performans etkinlikleri için acil durum hazırlık kolaylaştıracaktır.

Yukarıda tarif edilen sonuçlar, analitik performansı önemli ölçüde daha fazla varyasyon gösterdi Mycoplasma cynos hariç, plaka üzerinde, tüm hedeflerin temsil etmektedir. Bu durum, ideal bir 58-60 ve olmalıdır primerlerin optimal erime sıcaklığına _(Tm), muhtemel olduğunu# 176; C (ideal bir prob Tm 68-70 ° C). Bu platformun bir sınırlama hızla dizileri değiştirme yeteneği sınırlar bireysel sondalar, sipariş için daha plakaları tasarımı ve üretimi için daha uzun sürer olmasıdır. Genel olarak real-time PCR başka sınırlama roman veya beklenmeyen patojenleri algılamak için yetersizliğidir. Bu, birden fazla türde sekansları ile örtüşmek tahlilleri tasarlayarak bir ölçüde üstesinden, ancak tarafsız tüm genom sekanslama göre yöntemler, yeni maddelerin keşfedilmesi için daha uygundur. ^11,12

Nano ölçekli real-time PCR için yeni bir paradigma izin veren sendromu tabanlı yüksek verimli moleküler tanı reaktif ve işçilik maliyetlerini azaltmak için yararlıdır türler tabanlı test, yerine. Bu yaklaşım büyük ölçekli panel test örneğin Dunne ve Gurfield ¹³ ve Moutailler ve ark., ¹⁴ tarafından tarif edilenler gibi OneHealth kontrol çabalarını kolaylaştırabilir. Erken sürüntü örneklerinin toplanması,genellikle klinik başlangıcından 3 gün içinde, solunum patojenlerin varlığı tanımlamak için en iyi şansı sağlar. Bulaşıcı hastalığın ortaya çıkması, genellikle öngörülemeyen ve reaktifler modifikasyonu için gerek kalmadan farklı türleri üzerinde yapılabilir testler hazırlık için idealdir. Bu teknolojinin gelecekte uygulamaları patotiplendirme, antimikrobiyal direnç profilleme ve ayrıca sendrom dayalı klinik tanı panellerde olması muhtemeldir. Nano ölçekli real-time PCR çoklu örnek ve patojen türleri hızlı, yüksek verimli tarama için en yararlı olan, yeni ve acil patojenleri belirlemek için tarafsız veya kısmen önyargılı sıralama temelli yaklaşımlar ile tamamlanmaktadır olacaktır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0