Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Summary

Hochdurchsatz-Untersuchung von DNA und RNA basieren Pathogenen durch nanoskalige PCR beschrieben wird ein syndromic Eckzahn und equine Atmungs PCR Panel.

Abstract

Nano- Maßstab real-time PCR verwendet Spatial Multiplexing mehrere Tests zu ermöglichen, parallel auf einer einzigen Platte ohne die typischen Nachteile der Kombination von Reaktionen zusammen ausgeführt werden. Wir entwarfen und ausgewertet, um eine Platte auf diesem Prinzip beruhen, um schnell das Vorhandensein von gemeinsamen Krankheitserregern bei Hunden und Pferden mit akuten Atemwegserkrankungen zu identifizieren. Dieses Manuskript beschreibt einen nanoskaligen diagnostischen PCR-Workflow für die Probenvorbereitung, Amplifikation und Analyse von Zielpathogens Sequenzen, auf Verfahren konzentrieren, die von Mikrolitermaßstab Reaktionen unterschiedlich sind. In der Atem Panel vorgestellt wurden 18 Tests jeweils dreifach angesetzt, zu 48 Proben pro Platte aufnehmen können. Eine universelle Extraktion und Vorverstärkung Workflow wurde für Hochdurchsatz-Probenvorbereitung optimiert, um mehrere Matrizen und DNA- und RNA-basierte Krankheitserreger beherbergen. Repräsentative Daten sind für eine Ziel-RNA (Influenza-A-Matrix) und eine Ziel-DNA (Pferde-Herpesvirus vorgestellt1). Die Fähigkeit, schnell und genau zu prüfen, für eine umfassende, Syndrom-basierte Gruppe von Krankheitserregern ist ein wertvolles Instrument zur Verbesserung der Effizienz und Ergonomie von Diagnostik-Tests und für akute Atemwegserkrankungen Diagnose und Behandlung.

Introduction

Mit der Nachfrage nach schnellen und umfassenden Nachweis von mehreren Agenten in der klinischen Diagnostik für Mensch und Tier, Einzelorganismus molekulardiagnostischen Methoden zur Erregernachweis sind beschwerlich verwendet, es sei denn für eine große Anzahl von Proben für eine einzelne Krankheit getestet. Im Veterinär Zusammenhang sind Hochdurchsatz-Diagnosemethoden besonders wichtig aufgrund der zusätzlichen Bedarf an Pathogenen aus einer Vielzahl von Arten abdecken. OneHealth Ansätze zur Verwaltung von lebensmittelbedingten Erkrankungen und Schwellen Erreger Überwachung Beispiele für Testanforderungen sind, die eine Reihe von Bakterien enthalten, Viren (DNA oder RNA-Basis), Parasiten und Pilze. Die Herausforderung an Tests für mehrere Analyten kombiniert zusammen (Multiplexing), um Testeffizienz zu verbessern, ist ein möglicher Verlust der Empfindlichkeit und eine große Belastung für die Optimierung und Validierung von Assays.

Nano- Maßstab real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein alterauf die Praxis der Multiplex nativen , die viele getrennte Reaktionen laufen gleichzeitig auf derselben Probe ¹ ermöglicht. Die Openarray - Plattform ist eine Anwendung dieses Prinzips ^2; es kombiniert Microarray-Technologie mit Echtzeit-PCR. Basierend auf dem Konzept der räumlichen Multiplexen wird jede Probe für eine Vielzahl von Zielen in getrennten Durchgangslöchern getestet. Diese Plattform wurde zunächst mit Cyanin-basierten doppelsträngigen DNA - Bindungs Chemie ² und ist jetzt für sondenbasierte Chemie mit dunklen Lösch Sonden ³ verwendet. Diese Plattform hat in den Menschen ⁴ und Tiere für die genetische Profilierung ⁵ verwendet in erster Linie sind. Es wurde vor kurzem durch Blut übertragbaren DNA und RNA Pathogenen durch Grigorenko et al zu erfassen. ⁶ einen zweistufigen Reverse-Transkriptions / Vorverstärkung (Vorverstärker) Verfahren.

Wir beschreiben hier ein Ein-Schritt-Vorverstärker-basierte Verfahren für beide Arten von Krankheitserregern in der Atem sec Erkennungretions und eine Vielzahl von anderen Probentypen, die vollständig in einem Standard-Arbeitstag durchgeführt werden kann. Nach Beendigung der Ein-Schritt-Vorverstärker werden Proben auf eine Platte mit 384 Vertiefungen überführt, die das Format durch das automatisierte Flüssigkeitshandhabungssystem angenommen ist, die mit dieser nanoskaligen PCR Plattform kommt. Das System zeichnet die Master-Mix und die Probe über die Oberfläche von bis zu 4 Platten (192 Proben und Kontrollen) zu einer Zeit. Im Anschluss an diese Ladevorgang beschreiben wir, wie Proben verstärkt und analysiert, um eine Makro-Tabelle verwenden, die den Durchschnitt der drei technische Replikate für jede Probe / Ziel-Kombination in einer Tabelle zusammengefasst, die auf einer gedruckten Seite passt.

Ein einheitliches Verfahren zur Analyse von extrahierten DNA und / oder RNA aus Proben mit Hilfe dieser Plattform etabliert. Eine große Vielfalt von Proben wurden extrahiert, revers transkribiert und in einer 96-Well-Format-Pre verstärkt, das Potenzial für Fehler zu minimieren. Atemproben getestet enthalten Nasenabstrichen, tiefe Pharynxabstriche,trans-tracheale wäscht, Bronchiallavage und Lungengewebe. Da einige der Agenten im peripheren Blut vorhanden sein können, auch getestet oder Kot, eingebaut wir diese Arten von Proben in das Verfahren. durch eine effiziente Prüfung durch Panel-basierte Erreger und Toxin-Gen Detektion anstelle einzelner Test Diese optimierten Workflow hilft, Zeit und Ressourcen zu sparen im Vergleich zu Experimenten in mehreren Platten ausgeführt wird. Die Atem Panel hier gezeigt hatte 18 Assays in dreifacher Ausfertigung Durchgangslöcher gedruckt jeweils zu 48 Proben pro Platte aufnehmen können. Die Pferde-Erreger nachgewiesen enthalten Pferde-Adenovirus 1 und 2, Pferde-Arteriitis - Virus, Pferde-Rhinitis Virus A und B, Pferde - Herpesvirus (EHV) Typen 1 und 4 und Streptococcus equi. Die Hunde-Erreger enthalten Hunde-respiratorischen corona (betacoronavirus), Hundestaupevirus, Hunde - Adenovirus, Hunde-Parainfluenza - Virus, Eckzahn Pneumovirus, Bordetella bronchiseptica und Mycoplasma Cynos. EINuniversellen Influenza-A-Test und eine interne Kontrolle (MS2 RNA-Phagen) wurden ebenfalls enthalten.

Protocol

Keine menschlichen Probanden oder Versuchstiere wurden für die Entwicklung dieses Protokolls verwendet. Die Kontrollen wurden durch Reinigung von sequenz bestätigt Amplicons und in - vitro - Transkription für RNA - Targets erzeugt. Klinische Proben wurden für Routinediagnostik zur Cornell Animal Health Diagnostic Center vorgelegt.

1. Platten-Entwurf

1. Verwenden Sie Primer-Design-Software, um sicherzustellen, dass jeder Test entspricht den Standard-Sonde-basierte Echtzeit-PCR-Zyklusbedingungen mit 60 ° C Annealing der Primer-Probe-Test-Tool (wählen Sie die Quantifizierung Sonde mit Standardparameter einstellen).
   HINWEIS: Die repräsentative Ziel - RNA verwendet wurde , aus dem universellen Influenza - A - Matrix gezielt Test von Shu et al angepasst ^7.. Die Primer und Sonde sind wie folgt: Vorwärtsprimer: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Reverse-Primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Probe: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. Die repräsentative DNA-Test hier verwendet wurde, her angepasstm die Pferde-Herpes - Virus Typ 1 (EHV-1) Nachweisverfahren von Elia veröffentlicht et al. ^8. Die Primer und Sonde sind wie folgt: Vorwärtsprimer: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Reverse-Primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Sonde: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. Bestellen nanoskaligen PCR Amplifizierung Platten in der gewünschten Konfiguration.
   HINWEIS: Für diese Studie wurden die 18x3 Genexpression Format verwendet wurde (Tabelle 1). Liefern Sequenzen für alle Primer und Sonden (oder inventarisiert Assay IDs) für jedes Ziel zu Hersteller.

2. Nukleinsäureextraktions

1. Extrahieren Gesamt Nukleinsäure (DNA und RNA) durch ein beliebiges Verfahren.
   HINWEIS: Eine automatisierte Magnetic-Bead-basierten Extraktions-Kits hier verwendet wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle Materialien für weitere Details).
2. Bereiten Sie die Proben wie folgt:
   1. Reinigen Sie die Außenseite eines jeden Probenbehälter mit 10% Bleiche und gründlich trocknen. Wischen Sie behandschuhten finger Spitzen mit 10% Bleiche zwischen den Proben eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
   2. Platz nasal oder tief Pharynxabstriche in jedem sterilen, verschlossenen Fläschchen (wie zum Beispiel einem roten Oberblutentnahmeröhrchen) mit einigen Tropfen Kochsalzlösung hinzugefügt Austrocknungs vor der Verarbeitung zu verhindern.
      HINWEIS: Baumwolle, Kunststoff, Holz Henkeln und Dacron und andere synthetische Tupfer sind akzeptabel, aber Calciumalginat Tupfern vermeiden.
   3. Für Tupfer und tracheale Wäschen, fügen Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), so dass es mindestens 1-2 ml Flüssigkeit ist. Mischen Sie den Tupfer und DMEM kräftig in die Röhre. Dann verwenden eine Pipette ca. 1 ml Medium in ein neues Röhrchen übertragen.
   4. Mechanisch lysieren Gewebe (100-200 mg in 1 ml von DMEM) eine Gewebe Disruptor unter Verwendung entsprechend den Anweisungen des Herstellers, gefolgt von Zentrifugation für 3 Minuten bei 825 x g. Transfer 500 ul des Überstands in ein neues Röhrchen.
   5. Für Kot, kombinieren 400 mg Kot mit 800 ul 1x phosphatgepufferter saLinie pH 7,4 (PBS). Vortexen die Suspension 1 min oder länger, bis die Probe homogenisiert wird oder vollständig suspendiert. Sobald homogenisiert, Zentrifugieren Sie die Suspension für 10 min bei 18.000 · g, dann Transfer 400 ul in ein neues Röhrchen.
   6. Für ganze unkoaguliert Blut, Strudel der Probe und machen eine 250-ul-Aliquot. In sechs Tropfen Lysereagenz und Wirbel zu mischen. Inkubieren 15 min bei 37 ° C.
3. Bereiten Sie die Lyse und Waschpuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers. In MS2 Phagen oder eine interne Kontrolle der Wahl zu dem Lysepuffer als interne positive Extraktionskontrolle ^9.
4. Hinzufügen, 235 & mgr; l Lyse-Puffer und 175 & mgr; l der Probe (oder PBS für die Negativkontrolle) zu jedem Wulst Rohr. Fahren Sie mit dem Protokoll des Herstellers.
   HINWEIS: Gereinigtes Gesamt wurde Nukleinsäure hier in 90 & mgr; l eluiert.

3. Reverse-Transkription / Vorverstärkung (Vorverstärker)

HINWEIS: Bewahren Sie alle Reagenzien und Proben verwendet inder Vorverstärker Reaktion jederzeit auf dem Eis. Im Anschluss an Vorverstärker, halten alle Reagenzien bei Raumtemperatur.

1. Montieren Sie eluierte DNA und / oder RNA, PCR-Reaktionsmischung, Nuklease-freies Wasser als negative Kontrolle und gepoolt Standards für die positive Verstärkung Kontrolle.
   HINWEIS: Bis zu 48 Proben können auf einer Verstärkungsplatte, die Kontrollen durchgeführt werden (zumindest einen negativen Extraktionskontrolle für jede Extraktionsplatte, aus denen Proben gezogen werden).
2. Drucken Sie eine Probe Karte. Eine zweite Person soll prüfen, ob die Karte und Probe Layout Spiel.
3. In einem 1,5-ml-Röhrchen, fügen Sie folgendes den Vorverstärker Master-Mix vorzubereiten.
   HINWEIS: Ein Endvolumen von 14 & mgr; l wurde hier verwendet.
   1. Fügen Sie einen Pool von vorgemischten Primer von jedem Ziel, so dass die endgültige Konzentration jedes Primers beträgt 900 nM.
      HINWEIS: Der Pool verwendet hier wurde bei einer 10-fach Konzentration hergestellt und 1,4 ul pro Reaktion zugegeben.
   2. Hinzufügen von Zufallsprimern in einer Endkonzentration von 600 nM oder 0,1x. In 2x RT-qPCR-Mix auf die Hälfte des Endvolumens (7 ul hier).
   3. Mischen Sie die Master-Mix-Komponenten zusammen, indem Sie vorsichtig verwirbelt und zum Stillstand kommen.
4. Führen Sie den Vorverstärker in einem Standard-96-Well-Platte auf der linken Seite der Platte mit nur (Spalten 1-6).
5. 8.5 ul Vorverstärker Master-Mix und 5,5 ul DNA / RNA-Probe in jede Vertiefung.
6. Alle Reagenzien (Proben, positive Kontrollen und negative Kontrollen mit Preamp-Mix), Siegel gründlich die Standard-96-Well-Platte mit einer klaren Klebeplombe Nach dem Kombinieren. Entfernen Sie überschüssiges Dichtung mit einer Rasierklinge Bildung Lücken von Dichtung zu verhindern, während des Radfahrens. Zentrifugieren Sie die versiegelte Platte für 20 Sekunden eine PCR-Platte Spinner verwendet wird. Überprüfen Sie, um sicherzustellen, alle Reagenzien in der Unterseite der Platte Brunnen kombiniert werden.
7. Führen Sie die Vorverstärker-Assay auf einer konventionellen Thermocycler unter den folgenden Bedingungen: 15 min bei 50 ° C; 1 min bei 95 ° C; 20 Zyklen von 15 sec bei 95 ° C, dann 2 min bei 60 ° C; 99,9 & #176; C für 10 min; bei 4 ° C zu halten. Programm diese Bedingungen vor dem Start.
8. Schalten Sie den herkömmlichen Thermocycler, wählen Sie den Vorverstärker Radsport-Programm und das Programm starten. Legen Sie die 96-Well-Platte in den Thermocycler nur dann, wenn der untere Teil des Thermocycler (nicht die Abdeckung), um die Temperatur für die cDNA-Produktion (50 ° C) durch Überwachung der Temperaturmesswert auf dem Bildschirm erforderlich erreicht. Vor dieser Zeit halten die Platte kalt das Risiko der Herstellung falsch positive Ergebnisse zu minimieren.
9. Sobald der Vorverstärker Lauf abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Platte verschlossen geblieben ist.
10. Gehen Sie sofort 4.1 zu treten. Um diese Platte zu speichern über Nacht, führen Sie die Verdünnung wie in den Schritten 4.2 bis 4.5, mit der Ausnahme, anstatt die Platte lose Abdeckung, versiegeln Sie die Platte mit einem klaren Klebeverschluss und Platz in einem Reißverschluss-Lock-Beutel, bei 4 ° C.

4. Verdünnung der Preamp-Platte

1. Entfernen Sie die entsprechende Anzahl von Verstärkungsplatten herm die Gefrierschrank (bis zu 4 auf einmal ausgeführt werden). Sie nicht die Verpackung öffnen. Das Feinblech für mindestens 15 min bei Raumtemperatur zu erwärmen. Notieren Sie die Seriennummer und die Chargennummer der Platte.
   HINWEIS: Ungeöffnete Platten können bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur bleiben, aber für die beste Praxis, entfernen Sie diese aus dem Gefrierschrank nicht mehr als 30 Minuten vor erforderlich.
2. Zentrifugieren Sie die fertige Vorverstärker Platte für 20 Sekunden mit Hilfe der PCR-Platte Spinner. Schalten Sie die Verstärkung Gerät und Computer und starten Sie das dazugehörige Programm.
3. Entfernen Sie alle unnötigen Gegenstände aus einem PCR-Setup-Bereich. Setzen Sie auf doppelte Handschuhe und Ärmelschoner.
4. Entfernen Sie die Dichtung vom Vorverstärker Platte und sorgfältig entfernen und entsorgen Sie die äußeren Handschuhe. Verdünnen Sie die Vorverstärker-Produkte bei 1: 5 durch Zugabe von 56 ul TE-Puffer in jede Vertiefung der Spalten 1-6 der 96-Well-Platte Vorverstärker und Mischen durch Pipettieren von oben und unten. Gehen nur bis zum ersten Anschlag der Pipette, von unten angesaugt und höher Abgabe jedoch nicht die SchaffungBlasen. In TE-Puffer in alle 6 Spalten unabhängig von nicht verwendeten Wells.
5. Reseal die Platte mit entweder einem klaren Klebstoff oder Foliendichtung und Zentrifuge für 20 sec die PCR-Platte Spinner verwendet wird. Setzen Sie diese Platte beiseite (lose abgedeckt) bis Schritt 6.1 abgeschlossen ist. Entsorgen restlichen Handschuhe und Ärmelschoner.

5. Vorbereitung für 384-Well-Transfer zum Amplification Platte

1. Stellen Sie die Materialien benötigt, um die Verstärkungsplatte zu bedecken und abzudichten: Deckel, Stecker, Spritze Tauchflüssigkeit, Plattenpresse, Ethanol sprizenflasche und fusselfreien Labor wischt. Entfernen Sie die Spritzenkappe und verriegeln Sie eine kleine Plastikspitze auf die Spritze (Kraft erfordert). Werfen Sie eine kleine Menge von Tauchflüssigkeit auf einem Papiertuch Luft um Ablagerungen zu entfernen (es ist in Ordnung, wenn einige kleine Luftblasen in der Spitze bleiben). Verwenden Sie die Tauchflüssigkeit innerhalb von 60 min die Spritze aus dem Vakuum versiegelt Aluminiumbeutel zu entfernen. Sobald eine Spritze geöffnet wird, nicht wieder anbringen nicht die Kappe für die spätere Verwendung.
2. Prüfendass der Abfallbehälter der Flüssigkeitshandhabungsplatte Laden ist leer und die Schachtel mit den Spitzen öffnen. Schreiben Sie das Ablaufdatum der Spitzen an der Spitze Kastendeckel, wenn ein neues Feld geöffnet wird, und stellen Sie sicher, dass die Spitzen nicht abgelaufen sind. Schalten Sie den Liquid Handler und Computer und öffnen Sie die Liquid Handler-Software, die einen Selbsttest durchführen wird.
3. Klicken Sie auf "Setup und Load". Klicken Sie auf "Durchsuchen", um die CSV-Datei aus dem Sample Tracker Software erstellt auszuwählen. Wenn die Datei nicht angezeigt wird, gehen Sie zu "Instrument / Einstellungen bearbeiten" und klicken Sie dann auf "Change" von "Probenplatte File Folder". Wählen Sie den Ordner, in dem die CSV-Datei gespeichert wird. Klicken Sie dann auf "Setup und Laden", dann auf "Durchsuchen" und wählen Sie die Datei.
4. Anschließend klicken Sie auf "Durchsuchen" neben dem "Platten-Halter Position 1" und die TPF-Datei (vom Hersteller zur Verfügung gestellt), die die gleiche Seriennummer wie die Platte hat.

6. Liquid Handler Übertragung

Hinweis: Beginnen Sie nicht mit fiBefüllungs die 384-Well-Platte, bis alle der oben genannten Schritte abgeschlossen sind. Die Verdampfung ist ein Anliegen, mit kleinen Mengen - nicht die 384-Well-Platte mit Flüssigkeit im Inneren aufgedeckt sitzen lassen.

1. Sobald alle der oben genannten Schritte abgeschlossen sind setzen auf neue, gut ausgestattete Doppel Handschuhe und Ärmelschoner. Dann fügen Sie 2,5 ul der Verstärkung Master-Mix auf einer 384-Well-Platte.
2. Übertragen 2,5 ul des verdünnten Vorverstärker Produkt der 384-Well - Platte nach der Karte in Tabelle 2 und sofort die Platte abgedeckt fest mit einer Foliendichtung. Entsorgen Sie äußere Handschuhe und Ärmelschoner.
3. Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte für 20 Sekunden in der PCR-Platte Spinner.
4. Sie nicht die Foliendichtung, zu entfernen, aber die 384-Well-Platte in der Liquid Handler platzieren.
5. Öffnen Sie die Verpackung eines umhüllten Verstärkungsplatte enthält, und legen Sie sie vorsichtig in den Liquid Handler in dem ersten Schlitz mit der Seriennummer auf der rechten Seite - halten Sie den Fall an den Kanten ohne Berührung der Oberfläche of der Platte. Verwenden Sie ungeöffneten Platten innerhalb einer Stunde nach Öffnung.
   Hinweis: Der Zweck der Fall ist, um die Platte zu schützen gegen Berührung, da diese die kleinen Mengen an Primer und Sonden in den Durchgangslöchern stören könnten.
6. Entfernen Sie die Folie von der 384-Well-Platte in der Liquid Handler einmal alles an seinem Platz ist. Klicken Sie auf Weiter und dann überprüfen Sie alle Felder, wie jeder Schritt abgeschlossen ist. Klicken Sie auf OK, um den Lauf zu starten.
7. Schließen Sie die Tür zu dem Liquid Handler und sofort den Füllvorgang beginnen. Bleiben Sie neben dem Liquid Handler und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren, sobald die Platte gefüllt ist.
8. Während die Liquid Handler ausgeführt wird, entfernen Sie die Schutzfolie von der Unterseite eines Gehäusedeckels.
   HINWEIS: Der Klebstoff an der Unterseite des Gehäusedeckels wird durch ein rotes Band und einem Schutzfilm bedeckt. Der Film muss entfernt werden zuerst das rote Band zuzugreifen.
   1. Lassen Sie die obere Folie an Ort und Stelle, bis Schritt 6.15. Prime das rote Band durch leicht zu releas ziehene aus dem Klebstoff.
9. Entfernen Sie die geladen (gefüllt) Verstärkungsplatte aus dem Liquid Handler und legen Sie sie vorsichtig in die Plattenpresse mit der Seriennummer auf der rechten Seite.
10. Setzen Sie den Deckel auf der Oberseite der Platte mit dem gekerbten Ende auf der rechten und der Klebstoff auf dem Boden (zeigt auf der Platte).
11. Ziehen Sie auf der Platte drücken Sie den Hebel vorsichtig schließen sie; das Licht wird für 20 Sekunden blinken. Sie nicht die Plattenpresse während dieser Zeit berühren. Sobald das Licht dauerhaft grün leuchtet, heben Sie den Hebel vorsichtig nach oben und sorgfältig die versiegelte Platte entfernen, indem sie an den Rändern halten.
12. die versiegelte Verstärkungsplatte vertikal durch die Ränder des Falles sofort legen Sie die Spritzenspitze in die Ladeöffnung am Ende des Falles verzichtet werden dann die Eintauchflüssigkeit langsam in eine sanfte kontinuierliche Bewegung Halten Sie den Raum zwischen der Platte zu füllen und die Deckel. Lassen Sie eine kleine Luftblase in der Ecke, wenn die Platte eingetaucht ist.
13. Während er weiterhin zu halt die Platte vertikal durch die Kanten, versiegeln Sie die Ladeöffnung durch den Stecker in den Anschluss einführen und den Stecker im Uhrzeigersinn drehen, genügend Druck ausgeübt wird, bis der Griff abbricht. Griff die Kanten des Gehäuses fest, so daß die Kraft des Griffs Brechen verursacht nicht der Fall zu fallen. Wenn eine Platte fallen gelassen wird, entsorgen Sie sie.
14. Reinigen Sie das Gehäuse mit einem fusselfreien Tuch das wurde mit Ethanol gründlich besprüht. Um den Fall zu trocknen, wischen Sie das Gehäuse nach unten mit einem sauberen abwischen. Griff vorsichtig den Fall; achten Sie darauf, keinen Druck auf das Glas über den Vertiefungen gelten.
15. Bringen Sie die versiegelte Platte zur Verstärkung Maschine. Unter dem "Instrument", wählen Sie "Instrument-Konsole." Wählen Sie die Verstärkung Maschine dann klicken Sie auf die "Open Door" Taste.
16. Legen Sie die Verstärkungsplatte in den ersten Schlitz des Plattenadapter, Prüfen, dass der Adapter richtig mit A1 bis in der oberen linken Ecke ausgekleidet ist. Richten Sie die Platte mit dem Barcode nach oben und aufdie Vorderseite des Instruments. Klicken Sie auf die "Tür schließen" klicken. Beachten Sie die Verwendung des Adapters Fach - es gibt eine Grenze von 10 verwendet wird.
17. Unter der Registerkarte Start am unteren Rand des Bildschirms unter dem Run-Menü wählen Sie Openarray. Klicken Sie auf "Platte IDs abrufen." Die leeren Kisten werden automatisch mit Informationen über die Platte gefüllt. Um den Lauf zu beginnen, klicken Sie auf "Start Run".
18. Schließen Sie die Liquid Handler Software und schalten Sie den Liquid Handler aus. Setzen Sie die Spitze Abdeckung über dem Spitzengestell. Entsorgen Sie die Tipps aus dem Abfalleimer und reinigen. Reinigen und Dekontaminieren alle Elemente, einschließlich der Arbeitsfläche, Pipette, Abfallbehälter und Spitzen-Boxen.
19. Reseal die Vorstufe Platte mit einem klaren Klebeverschluss und bei -20 ° C.

7. Ergebnisauswertung

1. Nachdem der Lauf beendet hat, speichern Sie die Datei und klicken Sie dann auf das "X" auf der Registerkarte mit dem Laufnamen am unteren Rand des Bildschirms, um die Datei zu schließen.
2. Klicken Sie auf "Open Door"Am oberen Rand des Bildschirms, die Tür zu öffnen. Entfernen Sie die Verstärkungsplatte überprüfen, dass kein Immersionsflüssigkeit ausgelaufen ist. Klicken Sie auf" Close Door "am oberen Rand des Bildschirms, die Tür zu schließen.
3. Klicken Sie auf "Öffnen" und wählen Sie die Lauf Datei, um sie zu öffnen. Drücken Sie die grüne Analysieren Button oben rechts auf dem Bildschirm. Klicken Sie auf "Exportieren" auf der linken Seite des Bildschirms und dann "Start Export" Ergebnisse exportieren (als TXT-Datei). Minimieren Sie die Datei, nachdem sie sich öffnet. Klicken Sie dann auf "Export QC Bilder."
4. Überprüfen Sie QC Bilder in der Bildanalyseprogramm nach den folgenden Kriterien:
   1. Beurteilen Sie Laden Qualität mit PRE-READ_CHANNEL_4.tiff und POST-READ_CHANNEL_4.tiff, indem geprüft wird, dass es keine dunklen Flecken oder Flecken.
      HINWEIS: Ein Farbstoff, der durch diesen Kanal detektiert wird vom Hersteller an die Primer und Sonden zugesetzt, die in die Lösung freigesetzt wird, wenn die Reaktions geladen wird. Die Lesung in diesem Kanal zeigt an, dass die Reaktionen waren richtiggeladen und dass die Primer und Sonde mit Farbstoff gemischt waren anwesend.
   2. Überprüfen Sie auf Lecks oder Rühren zu der Platte nach dem Laden S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff verwenden. Wenn das Bild zu dunkel aussieht, erhöhen Sie die Helligkeit (drücken Sie Strg + Shift + C Steuerung zu öffnen), bis die gesamte Platte sichtbar ist. Überprüfen Sie, ob das Bild einheitlich aussieht ohne Schatten, Blasen oder verschoben Proben.
   3. Beurteilen Deckel Platzierung und Schmutz unter den Deckel (helle Punkte) mit STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff und STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. Optional: Öffnen Sie eine Tabelle der Ergebnisse Macro (Supplemental-Code-Datei) enthält. In der Datendatei exportiert, klicken Sie rechts auf der Registerkarte am unteren Rand des Bildschirms und wählen Sie "Verschieben oder Kopieren". Im Feld "zu buchen", wählen Sie "Ergebnisse Macro.xlsm". Klicken Sie auf "Move to end" und das Kontrollkästchen "Kopie erstellen". Dann klicken Sie auf OK.
   1. Wenn die Ergebnisse Macro Option erscheint nicht im Feld "zu buchen", simlagig kopieren Sie den Inhalt der Datei Arbeitsblatt exportierten Daten (klicken Sie auf die linke obere Zelle alle Zellen und Strg-C zu markieren) und in einem neuen Tab einfügen.
6. Löschen Sie die alte Registerkarte "Export" und benennen Sie die neu hinzugefügte Tab als "Export".
7. Klicken Sie auf "Alt-F8" (oder klicken Sie auf Ansicht dann auf Makros), dann wählen Sie "Macro" und klicken Sie auf "Ausführen". Wiederholen Sie dies für Makro2 von "Alt-F8" dann "Makro2" und dann auf "Ausführen" klicken.
8. Benennen Sie die Ergebnisse Makro-Datei über die relevanten Informationen (Datum und Seriennummer), setzen Sie diese Informationen über den Tisch, und speichern als die gleiche Dateinamen im Exportiert Ordner Ergebnisse. Schließlich, drucken Sie das Makro-generierte Ergebnistabelle aus.
9. In der Maschine Software Verstärkung, überprüfen Sie die Kurven für jede Probe und Kontrolle gegen die Makrotabelle durch Analyse / Amplification Plot auf der linken Seite des Bildschirms auswählen. Wählen Sie dann das Register Beispiel, und klicken Sie auf jede Probebestätigen, dass es 2 oder 3 positive Verstärkungskurven für jede der positive Ergebnisse in der Tabelle.
10. Schalten Sie die Verstärkung Maschine ab.

Representative Results

Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 für einen repräsentativen RNA - Assay (Influenza Matrix) und DNA - Test (EHV-1) mit einer Kombination von positiven Kontrollen und klinischen Proben abgegeben für diagnostische Routinetests gezeigt. Die Fluoreszenzsignale in dieser typischen Reaktion emittiert werden , in Abbildung 1 gezeigt , die rohen Fluoreszenzwerte pro Zyklus plottet. Alle relativen cycle threshold (Ct) -Werte wurden durch die Verstärkung Maschine Software automatisch generiert. Die Hintergrundfluoreszenz wurde als separate Metrik für die Beurteilung der Belastungs Qualität verwendet, anstatt sie in die Fluoreszenzmesswerte vor der Berechnung der Ct-Werte enthält.

Die analytische Nachweisgrenze (LOD) für jedes Ziel wurde auf dem Gesamtmittelwert der Ct-Werte bei 95% Erkennungspegel plus 2 Standardabweichungen in einem Pool von Kontrollen berechnet füralle Ziele. Die höchste Verdünnung, bei denen mindestens 95% der Replikate positiv für den repräsentativen Assays wurden war 50 Kopien; Nachweis von 5 Kopien war in 50% der Wiederholungsversuche erfolgreich. Weder Test wurde bei unterhalb einer Kopie erkannt. Die LOD für die RNA und DNA-Test wurden bei Ct-Werte von 21,92 und 20,05 berechnet. Diese Werte wurden als die Cutoffs für die Berichterstattung Werte als positiv gegenüber verdächtig zu sein (möglicherweise nicht wiederholbar).

Andere Aspekte der analytischen Leistungsfähigkeit der Ziele wurde mit Reihenverdünnungen von gepoolten positiven Kontrollen laufen bewertet an drei verschiedenen Tagen (Abbildung 2). Die mittleren Wirkungsgrade der repräsentativen RNA und DNA-Tests wurden 101,1% und 106,6%; der Gesamtmitteleffizienz für alle Ziele war 101,3%. Die Tests hatten auch eine gute Linearität (R ^2> 0,98). Variation innerhalb Replikation Durchgangslöcher war in der Regel innerhalb von Standardabweichungen von 0,2 für beide klinischen Proben eind Kontrollen. Keine Kreuzreaktivität zwischen jedem der Targets beobachtet.

Die endgültigen Ergebnisse Arbeitsblatt in der zusätzlichen Datei zeigt repräsentative quantitative Ergebnisse für 10 klinische diagnostische Proben und 4 steuert. Die klinischen Proben sind eine Teilmenge der Arten von Proben routinemäßig einschließlich nasal / Oropharynxabstriche getestet, Lungengewebe und Stuhlproben. Ein (Pferde-) Stuhlprobe in dieser Reihe zeigt eine gescheiterte MS2 interne Kontrolle, die die Anwesenheit von Inhibitoren in der Probe anzeigt. Dies wird typischerweise durch Verdünnung der eluierten Probe und / oder Wiedergewinnung geleitet. Wie es hier der Fall ist, sollte die negativen Verstärkungssteuerung für alle Ziele negativ sein, und die negative Extraktionskontrolle sollte nur die interne Kontrolle enthält. In der klinischen Satz hergestellten Proben Ct - Werte für betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, Hundestaupevirus A, Hunde-Parainfluenza - Virus, Eckzahn Pneumovirus und GrippeEIN.

Abbildung 1. Amplification Plots. Fluoreszenzablesungen gegen Amplifikationszyklen für die RNA - Assay (A) aufgetragen und DNA - Assay (B). Triangles sind bezeichnet Ct - Werte angezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Standardkurven. Standardkurven aus der RNA und DNA - Test an drei verschiedenen Tagen getestet werden aufgetragen , um die Linearität und den Bereich der Amplifikation unter Verwendung von Positivkontrollen zu demonstrieren. Zyklus Schwellenwert (Ct) -Werte gegen log aufgetragen (10) der Anzahl von Kopien von RNA (A) oder DNA ( Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1 : Schematische der Verstärkungsplatte und Zielorten. Die Platten verwendet für nanoskalige real-time PCR - Tests auf dieser Plattform sind Mikroskop - Objektträger-Größe und sind in 48 Sub - Arrays von 64 Durchgangslöcher mit insgesamt 3.072 Durchgangslöcher angeordnet für einzelne Reaktionen. Eine Sub-Array wird hier gezeigt, mit 18 Zielen in dreifacher Ausfertigung. Jede Probe wird hinzugefügt, um ein Subarray der Flüssigkeitshandhabungs. Platten werden mit hydrophilen und hydrophoben Verbindungen beschichtet Reagenzien in Durchgangslöchern durch die Oberflächenspannung zu halten. Der Edelstahl-Chip "photolithographisch strukturiert und nass geätzt von 3072 Mikro bearbeitet, 320 & mgr; m diamete eine geradlinige Anordnung zu bilden. r Löcher von 33 nl jeder ^"2 Abkürzungen für Ziele sind wie folgt: BCOR, Hunde- Atemcorona (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, Hunde - Adenovirus; CPIV, Hunde-Parainfluenza - Virus; CPNV, Eckzahn Pneumovirus; DISTA / B, Hunde- Staupevirus A und B; EADV1 / 2, Pferde-Adenovirus 1/2; EAV, Pferde-Arteriitis-Virus; EHV1 / 4, Pferde-Herpes-Virus Typ 1/4; ERVA / B, Pferde- Rhinitis Virus A / B; IVM, Influenza-A-Matrix; MCYNOS, Mycoplasma Cynos; MS2, die interne Kontrolle (MS2 RNA - Phagen); TeilAnl, Streptococcus equi.

Tabelle 2. Platte Transfer Karte. Eine farbkodierte Platte Transfer Karte für die Verwendung eines festen 8-Kanal - Pipette aus der 96-Well - Vorverstärker Platte zu übertragen , um die 384-Well - Platte gezeigt. Alternativ kann eine einstellbare Pipette verwendet werden. Das gleiche Verfahren wird jedes Mal durchgeführt, unabhängig von h ow viele Proben sind in der Platte.

Supplemental - Datei. Ein Makro-fähigen Tabellenkalkulationsdatei zwei Makros für die Formatierung Ergebnisse in einer Übersichtstabelle enthält (wie im Protokoll beschrieben) vorgesehen ist. Ein typisches Ergebnis Tabelle durch die Makros erzeugt wird in der Datei (unter Jahresergebnis) enthalten. Die beiden Makros werden in den Musternamen in der ersten Spalte (bis zu 48 Proben) und der Durchschnitt der drei Ct-Werte für jedes Ziel für die mit positiven Ergebnissen zu füllen; beachten Sie, dass die Ziele, die nicht verstärken hat in dieser Tabelle leer angezeigt. Dies kann leicht auf ein Blatt Papier gedruckt werden, und als Referenz verwendet effizient die Rohdaten für die Überprüfung. In der abschließenden Ergebnisse Registerkarte repräsentative Ergebnisse für 10 klinische Proben und 4 Kontrollen gezeigt. Abkürzungen für die Assay - Namen sind in der Legende von Tabelle 1 aufgelistet.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Dieses Verfahren wurde für die Routineprüfung von respiratorischen Pathogenen in unserem Labor im Laufe von sechs Monaten (2-3 mal pro Woche) verwendet. Wir haben auch Erfolg das gleiche Verfahren für magensaftresistente Erreger Profilierung in Kotproben und bakterielle Isolate auf einem separat angepasst Platte verwenden. Sobald die Platten hergestellt werden, können erfahrene Mitarbeiter Schritte abgeschlossen innerhalb einer Standard Arbeitstag 2-7. Die kritischsten Schritte sind die einwandfreie Abdichtung des Vorverstärkers Platte, wobei die Übertragung von vorverstärkt Proben zwischen den Platten, und die endgültige Überdeckung der Verstärkungsplatte (die schnell Verdampfung durchgeführt werden müssen, um zu verhindern). Verwendung des Makro-Tabelle als Leitfaden für die Ergebnisanalyse (Kurven für Proben und Kontrollen Kontrolle) war ebenfalls wichtig, da sie stark die Menge an Zeit und Papiere für diesen Prozess benötigt reduziert. Die bereitgestellte Makro-Tabelle ist ein Beispiel; es müssten für Platten mit unterschiedlichen Konfigurationen modifiziert oder neu erstellt werden. Dies kann leicht sein performed von jemandem mit grundlegenden Tabellen Wissen.

Aufgrund der sehr geringen Menge an Probe geladen auf die Verstärkungsplatte (33 nl) wird Vorverstärkung erforderlich. Bei der Optimierung dieses Protokolls (nicht gezeigt) verglichen wir eine Reihe von Vorverstärkung Parameter einschließlich der Master-Mix, Zugabe von Zufallsprimern, die Anzahl der Zyklen, Glühzeit und Verdünnung vor der Amplifikation. Jedes Ziel hatte seine eigenen optimalen Bedingungen und die hier beschriebenen repräsentieren diejenigen, die die besten Nachweisgrenze insgesamt für unsere Platte ergab. Dieses Panel deckt ein breites Spektrum von pathogenen Ziele und Probentypen, die in der Routine Veterinärdiagnostik angetroffen werden, aber Änderungen an den Vorverstärkung Verfahren können für verschiedene Platten erforderlich sein. Die Hersteller optimierte Amplifikationsbedingungen sind auf einem Standard-Sonde-basierte Echtzeit-PCR-Protokoll mit einem 10 min bei 95 ° C Enzymaktivierung, gefolgt von einer Denaturierung bei 95 ° C und ann basierendEaling / Extension bei 60 ° C. Die Primer und Sonden sind vorgedruckt auf den Platten auch hersteller optimierten Bedingungen verwenden und benötigen daher keine Titration. die Reverse-Transkription und Vorverstärkung Schritte Kombination für alle Proben (unabhängig von der Art des Ziels) war notwendig, um die Effizienz in der Arbeitsablauf zu halten. alle Proben transkribierten umkehren zu haben, ist auch von Vorteil für die Maximierung der Empfindlichkeit. Weiterhin kann die Verwendung eines Master-Mix für den Vorverstärker, die zur Minimierung Inhibitoren optimiert ermöglicht Vielseitigkeit in verschiedenen Probentypen auf der gleichen Platte verbinden.

Das Center for Disease Control (CDC) Influenza - Matrix - Test von Shu et al. ⁷ und hier für Nano- Maßstab Reaktionen angepasst ist ein universelles Influenza - A - Test, der für die Prüfung Proben von Menschen und Haustieren geeignet ist. Es wurde für den universellen Erfassung des Matrix-Gen aller Influenza-A-Viren mit Mikrolitermaßstab rea entworfenctions. Es wurde auf der ganzen Welt als Teil einer CDC humanen Influenzavirus-Panel und einer CDC Schweinegrippe-Panel verwendet. Der EHV-1 - Test ⁸ angepasst hier erkennt einen wichtigen respiratorischen Erreger der Pferde , die Abtreibungen und neurologische Krankheit (rezensiert von Pusterla und Hussey ¹⁰⁾ verursachen können. Die Bedeutung dieser Tests zu einer Hochdurchsatz-Plattform mit einer Spezies-unabhängige interne Kontrolle der Anpassung ist, dass sie in eine OneHealth Überwachung Ansatz integriert werden können. beide dieser Tests auf einem Hochdurchsatz-Testplattform hat, wird die Notfallplanung für die klinische Einrichtungen, Schutz und Performance-Events erleichtern.

Die oben beschriebenen Ergebnisse waren repräsentativ für alle Ziele auf der Platte mit Ausnahme von Mycoplasma Cynos, die in der analytischen Leistung deutlich mehr Variation zeigte. Dies war wahrscheinlich auf die suboptimale Schmelztemperatur (T _m) der Primer, die im Idealfall sein sollte 58-60 &# 176; C (die ideale Sonde Tm 68-70 ° C). Eine Einschränkung dieser Plattform ist, dass es länger als die Platten für die Bestellung von einzelnen Sonden, die die Fähigkeit, Sequenzen zu schnell ändern begrenzt zu entwerfen und herzustellen braucht. Eine weitere Einschränkung der Echtzeit-PCR in der Regel ist die Unfähigkeit, neuartige und unerwartete Pathogene zu erkennen. Dies kann durch die Gestaltung Assays zu einem gewissen Grad überwunden werden , die Sequenzen in mehreren Spezies entsprechen, aber unvoreingenommene ganze Genom - Sequenzierung basierte Methoden sind besser geeignet für die Entdeckung von neuen Wirkstoffen. ^11,12

Nanoskalige real-time PCR ermöglicht ein neues Paradigma für Syndrom-basierte eher als Spezies-basierte Tests, die für die Reduktionsmittel und Arbeitskosten im Hochdurchsatz-Molekulardiagnostik nützlich ist. Groß Panel Test durch diesen Ansatz kann OneHealth Überwachungs Bemühungen erleichtern, wie jene , die von Dunne und Gurfield ¹³ und Moutailler et al. ^14. Sammlung von Tupferproben früh,Regel innerhalb von 3 Tagen nach dem Auftreten klinischer Symptome, bietet die beste Chance, das Vorhandensein von Atemwegserreger zu identifizieren. Infektionskrankheit Auflaufen ist oft unvorhersehbar, und Tests, die auf verschiedene Arten, ohne die Notwendigkeit einer Änderung der Reagenzien durchgeführt werden können für Bereitschafts- ideal sind. Zukünftige Anwendungen dieser Technologie sind wahrscheinlich in Pathotypisierung, Antibiotikaresistenz Profilierung zu sein, und weitere Syndrom basierten klinischen Diagnostik-Panels. Nanoskalige real-time PCR ist besonders nützlich für eine schnelle, Hochdurchsatz-Screening von Mehrfachproben und Erregertypen, und würde durch unvoreingenommene oder teilweise voreingenommen Sequenzierung basierte Ansätze zur Identifizierung neuer und entstehender Erreger ergänzt werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0