À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

Summary

test à haut débit d'agents pathogènes à base d'ADN et d'ARN par PCR à l'échelle nanométrique est décrit en utilisant un chien syndromique et le panneau PCR respiratoire équine.

Abstract

PCR échelle nanolitres en temps réel utilise le multiplexage spatial pour permettre à plusieurs essais pour être exécutés en parallèle sur une seule plaque sans les inconvénients typiques de la combinaison de réactions ensemble. Nous avons conçu et évalué un groupe basé sur ce principe pour identifier rapidement la présence d'agents pathogènes courants chez les chiens et les chevaux souffrant d'une maladie respiratoire aiguë. Ce manuscrit décrit un flux de PCR de diagnostic à l'échelle nanométrique pour la préparation des échantillons, l'amplification et l'analyse de séquences cibles d'agents pathogènes, en se concentrant sur les procédures qui sont différentes des réactions à l'échelle du microlitre. Dans le panneau respiratoire présenté, 18 essais ont été chacun mis en place en trois exemplaires, pouvant accueillir jusqu'à 48 échantillons par plaque. Une extraction et de pré-amplification flux de travail universel a été optimisé pour haut débit préparation d'échantillons pour accueillir plusieurs matrices et des agents pathogènes à base d'ADN et d'ARN. Des données représentatives sont présentées pour un ARN cible (grippe A de la matrice) et une cible d'ADN (herpesvirus équin1). La possibilité de tester rapidement et avec précision pour un groupe complet, basé sur les syndromes d'agents pathogènes est un outil précieux pour améliorer l'efficacité et l'ergonomie des tests de diagnostic et pour le diagnostic de la maladie respiratoire aiguë et la gestion.

Introduction

Avec la demande pour la détection rapide et complète de plusieurs agents dans le diagnostic clinique pour les humains et les animaux, les méthodes de diagnostic moléculaire unique organisme pour la détection des pathogènes sont lourdes à moins utilisé pour un grand nombre d'échantillons ont été soumis à une seule maladie. Dans le contexte vétérinaire, les méthodes de diagnostic à haut débit sont particulièrement importants en raison de la nécessité supplémentaire pour couvrir les agents pathogènes à partir d'une grande variété d'espèces. OneHealth approches pour la gestion des maladies d'origine alimentaire et à la surveillance des agents pathogènes émergents sont des exemples de besoins de test qui incluent un certain nombre de bactéries, (à base d'ADN ou ARN) des virus, des parasites et des champignons. Le défi de combiner des tests pour plusieurs analytes ensemble (multiplexage) afin d'améliorer l'efficacité des tests est une éventuelle perte de sensibilité et d'une grande charge pour l'optimisation et la validation des tests.

En temps réel échelle nanolitres réaction en chaîne par polymérase (PCR) est un alternative à la pratique de multiplexage qui permet de nombreuses réactions séparées de fonctionner simultanément sur le même échantillon ^1. La plate - forme OpenArray est une application de ce principe ^2; il combine la technologie des microréseaux avec la PCR en temps réel. Basé sur le concept de multiplexage spatial, chaque échantillon est testé pour un grand nombre de cibles dans séparés par des trous. Cette plate - forme a été initialement utilisée avec la chimie de liaison d' ADN double brin à base de ^cyanine-2 et est maintenant disponible pour la chimie à base de sonde en utilisant des sondes de trempe sombres ^3. Cette plate - forme a été principalement utilisé pour le profilage génétique chez les humains et les animaux ^{4 5.} Il a récemment été conçu pour détecter l' ADN et l' ARN des agents pathogènes transmis par le sang par Grigorenko et al. , ⁶ en utilisant une transcription inverse / préamplification (préamplificateur) , procédure en deux étapes.

Nous décrivons ici une procédure basée préampli-en une seule étape pour détecter les deux types d'agents pathogènes dans les sec respiratoiresretions et une variété d'autres types d'échantillons qui peuvent être exécutées entièrement dans une journée normale de travail. Après achèvement de la pré-ampli en une seule étape, les échantillons sont transférés à une plaque à 384 puits, ce qui est le format accepté par le système de manipulation de liquides automatisé qui vient avec cette plate-forme par PCR à l'échelle nanométrique. Le système dessine le mélange maître et de l'échantillon à travers la surface jusqu'à 4 plaques (192 échantillons et contrôles) à la fois. Suite à ce processus de chargement, nous décrivons comment les échantillons sont amplifiés et analysés en utilisant une feuille de calcul macro qui résume la moyenne de 3 répétitions techniques pour chaque combinaison échantillon / cible dans une table qui tient sur une page imprimée.

Un procédé uniforme pour l'analyse de l'ADN extrait et / ou de l'ARN à partir d'échantillons à l'aide de cette plate-forme a été établie. Une grande variété d'échantillons ont été extraits, une transcription inverse, et pré-amplifié dans un format de 96 puits, ce qui minimise les risques d'erreurs. échantillons respiratoires testés comprenaient des écouvillons nasaux, écouvillons pharyngés profonds,lavage trans-trachéale, lavage broncho-alvéolaire et le tissu pulmonaire. Étant donné que certains des agents testés peuvent également être présents dans le sang périphérique ou des matières fécales, nous avons incorporé les types d'échantillons dans la procédure. Ce flux de travail simplifié permet d'économiser du temps et des ressources par rapport à l'exécution d'expériences dans de multiples plaques en permettant le test efficace par l'agent pathogène et la toxine détection de gènes à base de panneau en place des tests individuels. Le panneau respiratoire démontré ici avait 18 essais chacun imprimés en triple trous traversants, pouvant accueillir jusqu'à 48 échantillons par plaque. Les agents pathogènes équins détectés inclus adénovirus équin 1 et 2, le virus de l' artérite équine, le virus de la rhinite équine A et B, virus de l' herpès équin (EHV) de types 1 et 4, et Streptococcus equi. Les agents pathogènes canins inclus coronavirus canin respiratoire (betacoronavirus), le virus de la maladie de Carré, l' adénovirus canin, le virus parainfluenza canin, pneumovirus canine, Bordetella bronchiseptica et cynos Mycoplasma. UNEla grippe universelle Un dosage et un contrôle interne (MS2 ARN du phage) ont également été inclus.

Protocol

Aucun des sujets humains ou des animaux expérimentaux ont été utilisés pour le développement de ce protocole. Les contrôles ont été générés par la purification des amplicons de séquence confirmée et la transcription in vitro pour des cibles d'ARN. Les échantillons cliniques ont été soumis à des tests de diagnostic de routine au Centre de santé de diagnostic Cornell animaux.

1. Plate design

1. Utilisez un logiciel de conception d'amorce pour vérifier que chaque test est conforme à temps réel des conditions de cycle de PCR standard basées sur la sonde-avec 60 ° C recuit en utilisant l'outil de test de la sonde primaire (sélectionner la sonde de quantification de réglage avec les paramètres par défaut).
   NOTE: La cible d'ARN représentatif utilisé a été adapté à partir de la grippe universelle Un essai de matrice ciblée publiée par Shu et al ^7.. Les amorces et la sonde sont les suivantes: Amorce sens: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Reverse Primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Sonde: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. Le test d'ADN représentatif utilisé ici a été adapté from l'herpèsvirus de type 1 (EHV-1) Méthode de détection équine publiée par Elia et al. , ^8. Les amorces et la sonde sont les suivantes: Amorce sens: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Reverse Primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Sonde: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. Ordonner à l'échelle nanométrique des plaques d'amplification par PCR dans la configuration souhaitée.
   NOTE: Pour cette étude, le format de l' expression du gène de 18x3 a été utilisé (tableau 1). Fournir des séquences pour toutes les amorces et les sondes (ou ID d'essai inventoriés) pour chaque cible pour le fabricant.

2. Nucleic Acid Extraction

1. Extraire l'acide nucléique total (ADN et ARN) par tout procédé souhaité.
   REMARQUE: Un kit d'extraction automatique magnétique à base de perles a été utilisé ici selon les instructions du fabricant (voir la table des matières pour plus de détails).
2. Préparer les échantillons comme suit:
   1. Nettoyez l'extérieur de chaque conteneur d'échantillon avec 10% de l'eau de Javel et sécher soigneusement. Essuyez gantée fconseils Inger avec 10% eau de Javel entre les échantillons pour prévenir la contamination croisée.
   2. Placer nasale ou des tampons pharyngiens profonds dans tous, flacon scellé stérile (par exemple un tube de collecte de sang rouge en haut) avec plusieurs gouttes de solution saline ajoutés pour empêcher la dessiccation avant le traitement.
      NOTE: Coton, plastique, bois traités, et le Dacron et d'autres tampons synthétiques sont acceptables, mais il faut éviter de calcium écouvillons d'alginate.
   3. Pour les écouvillons et les lave-trachéales, ajouter du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM), de sorte qu'il y ait au moins 1-2 ml de liquide. Vortex l'écouvillon et DMEM vigoureusement dans le tube. Ensuite, utilisez une pipette pour transférer environ 1 ml de milieu dans un nouveau tube.
   4. lyser les tissus mécaniquement (100-200 mg dans 1 ml de DMEM) en utilisant un disrupteur de tissu selon les instructions du fabricant, suivi d'une centrifugation pendant 3 minutes à 825 x g. Le transfert de 500 ul du surnageant dans un nouveau tube.
   5. Pour les matières fécales, mélanger 400 mg de matières fécales avec 800 pi de tampon phosphate 1x saligne pH 7,4 (PBS). Vortex la suspension pendant 1 min ou plus jusqu'à ce que l'échantillon est homogénéisé ou totalement suspendu. Une fois homogénéisé, centrifuger la suspension pendant 10 minutes à 18.000 xg, puis transférer 400 ul dans un nouveau tube.
   6. Pour le sang non coagulé entier, vortex de l'échantillon et de faire une aliquote de 250 pi. Ajouter six gouttes de réactif lytique et vortex pour mélanger. Incuber 15 min à 37 ° C.
3. Préparer lyse et de lavage des tampons conformément aux instructions du fabricant. Ajouter MS2 phage ou un contrôle interne de choix pour le tampon de lyse comme un contrôle d'extraction positif interne ^9.
4. Ajouter 235 ul de tampon de lyse et 175 pi d'échantillon (ou du PBS pour témoin négatif) à chaque tube de talon. Procédez avec le protocole du fabricant.
   REMARQUE: Purified acide nucléique total a été élue dans 90 ul ici.

3. transcription inverse / pré-amplification (préampli)

REMARQUE: Conservez tous les réactifs et échantillons utilisés dansla réaction de préampli sur la glace en tout temps. Après préampli, conserver tous les réactifs à la température ambiante.

1. Assembler ADN élue et / ou de l'ARN, PCR Réaction Mix, l'eau sans nucléase comme témoin négatif, et les normes mises en commun pour le contrôle d'amplification positive.
   NOTE: Jusqu'à 48 échantillons peut être exécuté sur une plaque d'amplification y compris les contrôles (y compris au moins un contrôle négatif d'extraction pour chaque plaque d'extraction à partir de laquelle les échantillons doivent être tirés).
2. Imprimez une carte d'échantillon. Avoir un deuxième contrôle de personne que la carte et la mise en page échantillon rencontre.
3. Dans un tube de 1,5 ml, ajouter ce qui suit pour préparer le maître préampli mix.
   REMARQUE: Un volume final de 14 ul a été utilisé ici.
   1. Ajouter un pool d'amorces prémélangées à partir de chaque cible de telle sorte que la concentration finale de chaque amorce est de 900 nm.
      NOTE: La piscine utilisée ici a été préparé à une concentration 10x, et 1,4 ul ajouté par réaction.
   2. Ajouter des amorces aléatoires à une concentration finale de 600 nM ou 0,1x. Ajouter 2x mix RT-PCR quantitative à la moitié du volume final (7 ul ici).
   3. Mélanger les composants de mixage master ensemble par tourbillonner doucement et tourner vers le bas.
4. Effectuer le préampli dans une plaque à 96 puits standard en utilisant le côté gauche de la plaque seulement (colonnes 1-6).
5. Ajouter 8,5 pi de préampli master mix et 5,5 pi d'échantillon d'ADN / ARN à chaque puits.
6. Après avoir combiné tous les réactifs (échantillons, les contrôles positifs et les contrôles négatifs avec Preamp mix), sceller soigneusement la plaque de 96 puits standard avec un joint adhésif transparent. Retirez tout joint excédent à l'aide d'une lame de rasoir pour empêcher la formation de lacunes d'étanchéité au cours du cyclage. Centrifuger la plaque scellée pendant 20 secondes en utilisant une plaque spinner PCR. Vérifier pour s'assurer que tous les réactifs sont combinés dans le fond des puits de la plaque.
7. Exécuter le test de pré-ampli sur un thermocycleur classique dans les conditions suivantes: 15 min à 50 ° C; 1 min à 95 ° C; 20 cycles de 15 s à 95 ° C, puis 2 min à 60 ° C; 99,9 & #176; C pendant 10 min; maintenir à 4 ° C. Programme ces conditions avant de commencer.
8. Allumez le thermocycleur conventionnel, sélectionnez le programme de vélo de préampli et démarrer le programme. Placer la plaque à 96 puits dans le thermocycleur que lorsque la partie inférieure du thermocycleur (et non le couvercle) atteint la température requise pour la production d'ADNc (50 ° C) en surveillant la température de lecture sur l'écran. Avant cela, garder le froid de la plaque pour réduire au minimum le risque de produire des résultats faussement positifs.
9. Une fois la course de préampli est terminée, vérifiez que la plaque est restée fermée.
10. Procéder immédiatement à l'étape 4.1. Pour stocker cette plaque pendant la nuit, effectuer la dilution comme décrit dans les étapes 4.2 à 4.5, à l'exception au lieu de couvrir sans serrer la plaque, sceller la plaque avec un joint clair adhésif et place à l'intérieur d'un sac à fermeture-lock, conservé à 4 ° C.

4. Dilution de Preamp Plate

1. Retirer le nombre approprié de plaques d'amplification from le congélateur (jusqu'à 4 peut être exécuté à la fois). Ne pas ouvrir l'emballage. Laisser la plaque de se réchauffer pendant au moins 15 min à température ambiante. Notez le numéro et le lot numéro de série de la plaque.
   NOTE: plaques ouverts peuvent rester à température ambiante pendant jusqu'à 24 heures, mais pour les meilleures pratiques, les enlever du congélateur pas plus de 30 minutes avant nécessaire.
2. Centrifuger la plaque de préampli complété pendant 20 secondes en utilisant la plaque spinner PCR. Mettez la machine d'amplification et de l'ordinateur et démarrer le programme associé.
3. Retirez tous les éléments inutiles à partir d'une zone de configuration PCR. Mettez des gants doubles et housses de manches.
4. Retirez le joint de la plaque de préampli et soigneusement enlever et jeter les gants extérieurs. Diluer les produits de préampli à 1: 5 en ajoutant 56 pi de tampon TE à chaque puits de colonnes 1-6 de la plaque de préampli à 96 puits et de mélange par pipetage de haut en bas. Allez seulement au premier arrêt de la pipette, aspirer du fond et de distribution plus haut, mais pas la créationbulles. Ajouter un tampon TE à tous les 6 colonnes indépendamment des puits inutilisés.
5. Refermer la plaque soit avec un adhésif transparent ou papier d'aluminium, et centrifuger pendant 20 secondes en utilisant la plaque spinner PCR. Réglez cette plaque de côté (légèrement couvert) jusqu'à ce que l'étape 6.1 est terminée. Jeter les gants restants et housses de manches.

5. Préparation de 384 puits Transfert à la plaque d'Amplification

1. Mettre en place les matériaux nécessaires pour couvrir et sceller la plaque d'amplification: couvercle, bouchon, seringue de liquide d'immersion, appuyez sur la plaque, l'éthanol gicler bouteille, et lingettes de laboratoire non pelucheux. Retirez le capuchon de la seringue et bloquer un petit bout de plastique sur la seringue (nécessite la force). Ejecter une petite quantité de liquide d'immersion sur une serviette en papier pour enlever l'accumulation d'air (il est ok si quelques petites bulles d'air dans la pointe). Utiliser le fluide d'immersion dans les 60 minutes de retrait de la seringue du sachet en aluminium scellé sous vide. Dès qu'une seringue est ouverte, ne remettez pas la capsule pour une utilisation ultérieure.
2. Vérifierque la poubelle du gestionnaire de liquide de chargement de plaque est vide et ouvrez la boîte de conseils. Écrivez la date d'expiration des conseils sur le couvercle du boîtier de pointe quand une nouvelle boîte est ouverte, et veiller à ce que les conseils ne sont pas périmés. Allumez le manipulateur de liquide et de l'ordinateur et ouvrez le logiciel de gestionnaire de liquide, qui effectuera un auto-test.
3. Cliquez sur "Setup and Load". Cliquez sur "Parcourir" pour sélectionner le fichier csv créé à partir du logiciel Tracker de l'échantillon. Si le fichier est pas affiché, passez à "Instrument / Modifier Préférences" puis cliquez sur "Modifier" par "Plate Sample File Folder". Sélectionnez le dossier dans lequel le fichier csv est enregistré. Ensuite, cliquez sur "Setup and Load", puis "Parcourir" et sélectionnez le fichier.
4. Ensuite, cliquez sur "Parcourir" à côté de la "Plate Holder Position 1" et sélectionnez le fichier TPF (fourni par le fabricant) qui a le même numéro que la plaque.

Transfert 6. Liquid Handler

Note: Ne pas commencer fiLLING la plaque 384 puits jusqu'à ce que toutes les étapes ci-dessus sont complets. L'évaporation est une préoccupation avec de petits volumes - ne laissez pas la plaque de 384 puits assis à découvert avec le liquide à l'intérieur.

1. Une fois toutes les étapes ci-dessus mis sur de nouveaux gants doubles, bien équipés et le manchon couvre. Ensuite, ajoutez 2,5 pi d'amplification mélange maître à une plaque à 384 puits.
2. Transférer 2,5 pi de produit de préampli dilué à la plaque de 384 puits en fonction de la carte dans le tableau 2 et couvrir immédiatement la plaque hermétiquement avec un joint d' étanchéité en aluminium. Jeter les gants extérieurs et housses de manches.
3. Centrifuger la plaque à 384 puits pendant 20 s dans la plaque spinner PCR.
4. Ne pas retirer le joint de feuille, mais placer la plaque de 384 puits dans le gestionnaire liquide.
5. Ouvrez l'emballage contenant une plaque d'amplification encastré et placez-le soigneusement dans le gestionnaire de liquide dans le premier emplacement avec le numéro de série sur la droite - maintenir le cas par les bords sans toucher la surface of la plaque. Utilisez des assiettes déballé dans l'heure de l'ouverture.
   Remarque: Le but de cette affaire est de protéger la plaque d'être touché, car cela pourrait gêner les petites quantités d'amorces et de sondes à l'intérieur des trous traversants.
6. Retirer le papier d'aluminium de la plaque de 384 puits dans le gestionnaire de liquide une fois que tout est en place. Cliquez sur Suivant, puis cocher toutes les cases que chaque étape est terminée. Cliquez sur OK pour lancer la course.
7. Fermez la porte du manipulateur de liquide et commencer immédiatement le processus de remplissage. Restez à côté du manipulateur de liquide et de procéder immédiatement à l'étape suivante une fois que la plaque est remplie.
8. Alors que le manipulateur de liquide est en cours d'exécution, retirez le film protecteur de la partie inférieure d'un couvercle de boîtier.
   NOTE: L'adhésif au bas du couvercle du boîtier est recouverte par un ruban rouge et un film protecteur. Le film doit être retiré d'abord accéder à la bande rouge.
   1. Laissez le film supérieur en place jusqu'à l'étape 6.15. Premier ruban rouge en tirant légèrement vers release à partir de l'adhésif.
9. Retirez le (rempli) plaque d'amplification chargé à partir du gestionnaire de liquide et placez doucement dans la presse de la plaque avec le numéro de série sur la droite.
10. Placer le couvercle sur le dessus de la plaque entaillée à l'extrémité droite et de l'adhésif sur la partie inférieure (dirigée vers la plaque).
11. Tirez sur le levier de la presse de la plaque de fermeture avec précaution; la lumière clignote pendant 20 sec. Ne touchez pas la presse de la plaque pendant ce temps. Une fois que le feu passe au vert, soulevez le levier soigneusement et retirez soigneusement la plaque scellée en le tenant sur les bords.
12. Tout en maintenant la plaque d'amplification scellée verticalement par les bords du boîtier, insérez immédiatement la pointe de la seringue dans le port de chargement à la fin de l'affaire, puis distribuer le liquide d'immersion lentement dans un mouvement continu doux pour remplir l'espace entre la plaque et la le couvercle. Laissez une petite bulle d'air dans le coin une fois que la plaque est immergée.
13. Tout en continuant à hvieux la plaque verticalement par les bords, sceller le port de chargement en insérant la fiche dans le port et en tournant le bouchon dans le sens horaire, en appliquant une pression suffisante jusqu'à ce que la poignée se détache. Saisissez les bords de l'affaire fermement pour que la force de rupture de la poignée ne provoque pas le cas à la baisse. Si une plaque est tombé, jetez-le.
14. Nettoyez le boîtier avec une lingette qui pelucheux a été complètement pulvérisé avec de l'éthanol. Pour sécher le cas, essuyez le cas vers le bas avec un chiffon propre essuyer. manipulé le cas; être sûr de ne pas appliquer la pression sur le verre au-dessus des puits.
15. Amener la plaque scellée à la machine d'amplification. Sous l'onglet "Instrument", sélectionnez "Console Instrument." Sélectionnez la machine d'amplification puis cliquez sur le bouton "Open Door".
16. Placer la plaque d'amplification dans le premier emplacement de l'adaptateur de plaque, vérifier que l'adaptateur est correctement aligné avec A1 dans le coin supérieur gauche. Orientez la plaque avec le code à barres vers le haut et versla face avant de l'instrument. Cliquez sur le bouton "Close Door". Notez l'utilisation du plateau d'adaptation - il y a une limite de 10 utilisations.
17. Sous l'onglet Accueil au bas de l'écran, sous le menu Exécuter, sélectionnez OpenArray. Cliquez sur "Get ID Plate." Les cases vides seront automatiquement avec des informations sur la plaque. Pour commencer la course, cliquez sur "Démarrer Exécuter".
18. Fermez le logiciel de gestionnaire liquide et désactiver le gestionnaire liquide. Placer le couvercle de pointe sur la grille de pointe. Jeter les conseils de la poubelle et le nettoyer. Nettoyer et décontaminer tous les éléments, y compris la surface de travail, pipette, seau à déchets et conseils boîtes.
19. Refermer la plaque de préampli avec un joint adhésif transparent et conserver à -20 ° C.

Analyse 7. Résultat

1. Une fois la course terminée, enregistrez le fichier, puis cliquez sur le "X" dans l'onglet avec le nom de course au bas de l'écran pour fermer le fichier.
2. Cliquez sur "Open Door"En haut de l'écran pour ouvrir la porte. Retirer la plaque d'amplification, vérifier qu'aucun liquide d'immersion a filtré. Cliquez sur" Fermer la porte "en haut de l'écran pour fermer la porte.
3. Cliquez sur "Ouvrir" et sélectionnez le fichier d'exécution pour l'ouvrir. Appuyez sur le bouton vert Analyser en haut à droite de l'écran. Cliquez sur "Exporter" sur le côté gauche de l'écran, puis "Démarrer Exporter" pour exporter les résultats (sous forme de fichier .txt). Minimiser le fichier après son ouverture. Ensuite, cliquez sur "Exporter QC Images."
4. CQ en revue des images dans le programme d'analyse d'image selon les critères suivants:
   1. Évaluer la qualité de chargement à l'aide PRE-READ_CHANNEL_4.tiff et POST-READ_CHANNEL_4.tiff, en vérifiant qu'il n'y a pas de taches sombres ou des taches.
      REMARQUE: Un colorant détecté par ce canal est ajouté par le fabricant pour les amorces et les sondes, qui est libéré dans la solution lorsque la réaction est chargée. La lecture de ce canal indique que les réactions ont été correctementchargés et que les amorces et la sonde mélangées avec de la teinture étaient présents.
   2. Vérifier les fuites ou l'agitation à la plaque après le chargement en utilisant S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. Si l'image est sombre, augmentez la luminosité (appuyez sur Ctrl + Maj + C pour ouvrir les contrôles) jusqu'à ce que la totalité de la plaque est visible. Assurez-vous que l'image semble uniforme, sans ombres, des bulles ou des échantillons déplacés.
   3. Évaluer le placement du couvercle et des débris sous le couvercle (points lumineux) en utilisant STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff et STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. Facultatif: Ouvrez une feuille de calcul contenant les résultats macro (fichier de code supplémentaire). Dans le fichier de données exporté, cliquez droit sur l'onglet au bas de l'écran et sélectionnez "Déplacer ou copier". Dans le champ "à réserver", sélectionnez "Résultats Macro.xlsm". Cliquez sur "Déplacer à la fin" et cochez la case «Créer une copie". Ensuite, cliquez sur OK.
   1. Si l'option Résultats de Macro ne figure pas dans le champ "à réserver", simplis copier le contenu de la feuille de fichier de données exporté (cliquez sur la cellule supérieure gauche pour mettre en évidence toutes les cellules et Ctrl-C) et le coller dans un nouvel onglet.
6. Supprimer l'onglet ancienne "Exporter" et puis renommez l'onglet nouvellement ajouté que "Exporter".
7. Cliquez sur "Alt-F8" (ou cliquez sur Afficher puis Macros) puis sélectionnez "Macro" et cliquez sur "Exécuter". Puis répéter cette opération pour Macro2 en cliquant sur "Alt-F8" puis en sélectionnant "Macro2" et en cliquant sur "Exécuter".
8. Renommez le fichier Résultats de Macro en utilisant les informations pertinentes (date et numéro de série), mettre cette information au-dessus de la table, et enregistrer sous le même nom de fichier dans le dossier Résultats Exporté. Enfin, imprimez la macro-généré le tableau des résultats.
9. Dans le logiciel de la machine d'amplification, vérifier les courbes pour chaque échantillon et de contrôle sur la table macro en sélectionnant Analyse / Amplification Plot sur le côté gauche de l'écran. Ensuite, sélectionnez l'onglet Sample, puis cliquez sur chaque échantillon àconfirment qu'il y a 2 ou 3 courbes d'amplification positives pour chacun des résultats positifs dans le tableau.
10. Eteignez la machine d'amplification.

Representative Results

Les résultats sont présentés sur les figures 1 et 2 pour un dosage représentatif de l' ARN (matrice de la grippe) et le dosage de l' ADN (EHV-1) avec une combinaison de témoins positifs et les échantillons cliniques soumis à des tests de diagnostic de routine. Les signaux de fluorescence émis à travers cette réaction typique sont représentés sur la figure 1, qui trace les valeurs de fluorescence brute par cycle. Tous seuil relatif de cycle (Ct) les valeurs ont été générées automatiquement par le logiciel de l'appareil d'amplification. la fluorescence d'arrière-plan a été utilisé comme une mesure distincte pour l'évaluation de la qualité du chargement au lieu de l'incorporer dans les lectures de fluorescence avant de calculer les valeurs de Ct.

La limite de détection analytique (LOD) pour chaque cible a été calculé sur la base de la moyenne globale des valeurs Ct au niveau de détection de 95% plus 2 écarts-types dans une mare de contrôles pourtoutes les cibles. La dilution la plus élevée, où au moins 95% des répliques étaient positifs pour les essais représentatifs était de 50 copies; la détection de 5 copies a réussi à 50% des réplicats. Ni essai a été détecté au-dessous d'une copie. Les LOD pour le dosage de l'ARN et l'ADN ont été calculées à des valeurs Ct de 21,92 et 20,05. Ces valeurs ont été considérées comme étant les seuils pour les valeurs positives vs suspect (potentiellement non reproductible) de déclaration.

D' autres aspects de la performance analytique des cibles a été évaluée en utilisant des dilutions en série de contrôles positifs communs fonctionnent sur trois jours différents (figure 2). Les rendements moyens des ARN et d'ADN des essais représentatifs étaient 101,1% et 106,6%; l'efficacité moyenne globale pour toutes les cibles était de 101,3%. Les essais ont également eu une bonne linéarité (R ^2> 0,98). Répliquée variation à l'intérieur des trous traversants est typiquement dans les écarts types de 0,2 pour les échantillons cliniques d'commandes d. Pas de réactivité croisée entre l'une des cibles a été observé.

Les résultats finaux feuille de calcul dans le fichier supplémentaire montre des résultats quantitatifs représentatifs des 10 échantillons de diagnostic clinique et 4 contrôles. Les échantillons cliniques sont un sous-ensemble des types d'échantillons testés périodiquement, y compris nasale / oropharyngés, le tissu pulmonaire, et des échantillons de selles. Un (équin) échantillon de selles dans cet ensemble montre un contrôle interne MS2 échoué, ce qui indique la présence d'inhibiteurs dans l'échantillon. Cela est généralement géré par dilution de l'échantillon élue et / ou ré-extraction. Comme cela est le cas ici, le contrôle d'amplification négatif doit être négatif pour toutes les cibles, et le contrôle de l'extraction négative ne doit contenir que le contrôle interne. Dans l'ensemble clinique, des échantillons produits valeurs Ct pour betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, canine distemper virus A, le virus parainfluenza canin, pneumovirus canine, et la grippeUNE.

Figure 1. Les graphes d'amplification. Des lectures de fluorescence sont tracées en fonction des cycles d'amplification pour le dosage de l' ARN (A) et le dosage de l' ADN (B). Triangles sont présentés indiquant les valeurs Ct. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Les courbes standard. Les courbes standard de l'analyse de l' ARN et l' ADN testé sur trois jours différents sont tracés afin de démontrer la linéarité et la gamme d'amplification à l' aide de contrôles positifs. Seuil de cycle (Ct) les valeurs sont reportées en fonction log (10) du nombre de copies d'ARN (A) ou de l' ADN ( S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. Schéma de la plaque et cible des emplacements d'amplification. Les plaques utilisées pour les tests PCR à l' échelle nanométrique en temps réel sur cette plate - forme sont lame de microscope taille et sont disposés en 48 sous - réseaux de 64 à trous, avec un total de 3072 à travers des trous pour des réactions individuelles. Un sous-réseau est montré ici, avec 18 cibles en triple exemplaire. Chaque échantillon est ajouté à une sous-matrice par le manipulateur de liquide. Les plaques sont recouvertes avec des composés hydrophiles et hydrophobes pour maintenir les réactifs dans les trous traversants par l'intermédiaire de la tension superficielle. La puce en acier inoxydable est "photolithographie modelée et humide gravé pour former un réseau rectiligne de 3072 micro-usiné, 320 um diamete. r trous de 33 nl de chaque ^"2 Les abréviations pour les cibles sont les suivantes: BCOR, le coronavirus respiratoire canin (betacoronavirus) Bord, Bordetella bronchiseptica CAV, l' adénovirus canin, le CPIV, le virus parainfluenza canin; CPNV, le pneumovirus canin; DISTA / B, canin distemper virus A et B; EADV1 / 2, l'adénovirus équin 1/2; EAV, le virus de l'artérite équine; EHV1 / 4, herpèsvirus équin de type 1/4; ERVA / B, équin virus de la rhinite A / B; IVM, la grippe A matrice; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, le contrôle interne (MS2 ARN phage); SEQU, Streptococcus equi.

Tableau 2. Transfert de plaque carte. Une plaque de carte de transfert de couleur pour l' aide d' une pipette à 8 canaux fixes pour transférer de la 96 puits préampli plaque à la plaque de 384 puits est représenté. En variante, une pipette réglable peut être utilisé. La même procédure est effectuée à chaque fois indépendamment de h ow de nombreux échantillons sont dans la plaque.

Fichier supplémentaire. Un fichier tableur macros contenant deux macros pour les résultats de la mise en forme dans un tableau récapitulatif (tel que décrit dans le protocole) est fourni. Une table typique de résultat généré par les macros est inclus dans le fichier (sous Final Results). Les deux macros rempliront les noms d'échantillons dans la première colonne (jusqu'à 48 échantillons) et la moyenne des trois valeurs Ct pour chaque cible pour ceux qui ont des résultats positifs; noter que les cibles qui n'amplifient apparaissent vides dans ce tableau. Ceci peut être facilement imprimé sur une feuille de papier et utilisé comme référence pour la vérification des données brutes de manière efficace. Dans l'onglet résultats finaux, des résultats représentatifs pour 10 échantillons cliniques et 4 contrôles sont présentés. Les abréviations pour les noms de dosage sont répertoriés dans la légende du tableau 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette procédure a été utilisée pour les tests de routine des agents pathogènes respiratoires dans notre laboratoire au cours des six mois (2-3 fois par semaine). Nous avons également eu du succès en utilisant la même procédure pour entérique profilage des agents pathogènes dans des échantillons fécaux et isolats bactériens sur une plaque séparément sur mesure. Une fois que les plaques sont produites, le personnel expérimenté peut effectuer les étapes 2-7 en une journée normale de travail. Les étapes les plus critiques sont la bonne étanchéité de la plaque de préamplification, le transfert d'échantillons préamplifiés entre les plaques (ce qui doit être fait rapidement afin d'éviter l'évaporation), et le revêtement final de la plaque d'amplification. L'utilisation de la feuille de macro comme un guide pour l'analyse des résultats (vérification des courbes pour les échantillons et les témoins) était également essentielle, car elle réduit considérablement la quantité de temps et de documents nécessaires pour ce processus. La feuille de calcul fournie macro est un exemple; il serait nécessaire de modifier ou recréées pour des plaques avec des configurations différentes. Cela peut facilement être performed par une personne ayant des connaissances de base de la feuille de calcul.

En raison de la très petite quantité d'échantillon a été chargé sur la plaque d'amplification (33 nl), pré-amplification est nécessaire. L'optimisation de ce protocole (non représenté), nous avons comparé un certain nombre de paramètres de préamplification comprenant le mélange maître, l'addition d'amorces aléatoires, le nombre de cycles, le temps de recuit, et une dilution avant l'amplification. Chaque cible a ses propres conditions optimales, et celles qui sont décrites ici représentent ceux qui a abouti à la meilleure limite de détection globale de notre panel. Ce panneau couvre un large éventail de cibles pathogènes et les types d'échantillons que l'on rencontre dans les tests de diagnostic vétérinaire de routine, mais des modifications aux procédures de préamplification peut être nécessaire pour les différents panneaux. Les conditions d'amplification du fabricant optimisées sont basées sur un système en temps réel protocole de PCR standard à base de sonde avec une 10 min à 95 ° C activation enzymatique suivie d'une dénaturation à 95 ° C et Annealing / allongement à 60 ° C. Les amorces et les sondes sont pré-imprimé sur les plaques en utilisant des conditions aussi du fabricant optimisé et ne nécessitent donc pas de titrage. En combinant les reverse-transcription et de pré-amplification étapes pour tous les échantillons (quel que soit le type de cible) était nécessaire afin de maintenir l'efficacité du flux de travail. Tous les échantillons ayant subi une transcription inverse est également bénéfique pour maximiser la sensibilité. En outre, l'utilisation d'un mélange maître pour le préampli qui est optimisé pour les inhibiteurs minimisant permet une polyvalence en combinant différents types d'échantillons sur la même plaque.

Le Center for Disease Control (CDC) de dosage de la matrice de la grippe décrite par Shu et al. ⁷ et adapté ici pour des réactions à l'échelle de nanolitre est une grippe universelle Un test qui est approprié pour tester des échantillons provenant d' êtres humains et les animaux de compagnie. Il a été conçu pour la détection universelle du gène de la matrice de tous les virus de la grippe A en utilisant rea échelle microlitresctions. Il a été utilisé dans le monde entier dans le cadre d'un groupe spécial de virus CDC grippe humaine et un groupe spécial de la grippe porcine CDC. Le EHV-1 test ⁸ adapté ici détecte un important pathogène respiratoire des chevaux qui peuvent causer des avortements et des maladies neurologiques (revue par Pusterla et Hussey ^10). L'importance de l'adaptation de ces tests pour une plate-forme à haut débit avec un contrôle interne des espèces indépendantes est qu'elles peuvent être intégrées dans une approche de surveillance OneHealth. Ayant à la fois de ces essais sur une plate-forme de test à haut débit facilitera la préparation aux urgences pour les installations cliniques, des abris et des événements de performance.

Les résultats décrits ci - dessus sont représentatifs de toutes les cibles sur la plaque à l'exception de Mycoplasma cynos, qui a montré beaucoup plus de variation dans la performance analytique. Cela était probablement due à la température sous-optimale fusion _(Tm) des amorces, ce qui devrait idéalement être 58-60 &# 176; C (la sonde idéale Tm est 68-70 ° C). Une limitation de cette plate-forme est que cela prend plus de temps pour concevoir et fabriquer les plaques que pour commander des sondes individuelles, ce qui limite la capacité de modifier rapidement des séquences. Une autre limitation de la PCR en temps réel, en général, est l'incapacité à détecter des agents pathogènes nouveaux ou inattendus. Ceci peut être surmonté dans une certaine mesure par la conception des dosages qui correspondent à des séquences dans plusieurs espèces, mais méthodologies basées sur le séquençage du génome entier authentiques sont plus appropriés pour la découverte de nouveaux agents ^11,12 .

PCR Nanoscale en temps réel permet à un nouveau paradigme pour les tests plutôt que sur la base des espèces, ce qui est utile pour réduire réactifs et le coût du travail dans le diagnostic moléculaire à haut débit basé sur les syndromes. Test du panneau à grande échelle par cette approche peut faciliter les efforts de surveillance OneHealth tels que ceux décrits par Dunne et Gurfield ¹³ et Moutailler et al. ^14. Prélèvement d'échantillons de frottis tôt,généralement dans les 3 jours suivant l'apparition clinique, fournit la meilleure chance d'identifier la présence d'agents pathogènes respiratoires. l'émergence de maladies infectieuses est souvent imprévisible, et des tests qui peuvent être effectuées sur des espèces différentes sans nécessiter de modification des réactifs sont idéales pour la préparation. Les futures applications de cette technologie sont susceptibles d'être en pathotypage, antimicrobien profilage de la résistance, et d'autres panneaux cliniques de diagnostic basés sur le syndrome. PCR Nanoscale en temps réel est très utile pour rapide, criblage à haut débit de types d'échantillons et d'agents pathogènes multiples, et serait complétée par des approches fondées séquençage impartiales ou partiellement biaisées pour identifier les agents pathogènes nouveaux et émergents.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0