Summary
Высокая пропускная способность тестирование ДНК и РНК возбудителей на основе ПЦР наногруппы описывается с использованием синдромный клыка и лошадиный дыхательной панели ПЦР.
Abstract
Nanoliter шкала ПЦР в реальном времени использует пространственное мультиплексирование, чтобы несколько анализов, которые будут работать параллельно на одной пластине без типичных недостатков комбинирования реакций вместе. Мы разработали и оценили панели на основе этого принципа, чтобы быстро определить наличие общих возбудителей болезней у собак и лошадей с острыми респираторными заболеваниями. Эта рукопись описывает наноразмерных диагностический рабочий процесс ПЦР для подготовки образцов, амплификации и анализа целевых последовательностей патогена, сосредоточив внимание на процедурах, которые отличаются от микролитров масштабных реакций. В дыхательной панели представлены, 18 Анализы каждый комплект в трех экземплярах, вмещающий до 48 образцов на чашку. Универсальная добыча и предварительной амплификации рабочий процесс был оптимизирован для подготовки проб с высокой пропускной способностью для размещения нескольких матриц и ДНК и РНК патогенных микроорганизмов на основе. Типичные данные представлены на одной мишени РНК (гриппа А, матрица) и одной ДНК-мишени (лошадиный вирус герпеса1). Способность быстро и точно проверить для всестороннего, синдрома на основе группы патогенов является ценным инструментом для повышения эффективности и эргономичности диагностического тестирования и острых респираторных диагностики и лечения заболеваний.
Introduction
С требованием для быстрого и всеобъемлющего определения нескольких агентов в клинической диагностике для человека и животных, одного организма молекулярные методы диагностики для выявления патогенных микроорганизмов являются обременительными, если не используется для большого количества образцов, испытываемых одной болезни. В ветеринарии контексте методики диагностики с высокой пропускной способностью, особенно важны из-за дополнительной потребности в охватывающих патогены из широкого спектра видов. OneHealth подходы к управлению болезней пищевого происхождения и формирующейся наблюдения патогена являются примерами потребностей тестирования, которые включают ряд бактерий, вирусов (ДНК или РНК на основе), паразитов и грибов. Задача объединения тестов для нескольких аналитов вместе (мультиплексирование) с целью повышения эффективности тестирования является возможной потери чувствительности и большая нагрузка для оптимизации и проверки анализов.
Nanoliter масштаба в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) является альтерУроженец к практике мультиплексирования , что позволяет много отдельных реакций работать одновременно на том же образце 1. OpenArray платформа является применение этого принципа 2; он сочетает в себе технологию микрочипов с ПЦР в реальном времени. На основе концепции пространственного мультиплексирования, каждый образец проверяется на наличие большого количества мишеней в виде отдельных сквозных отверстий. Эта платформа была первоначально использовалась для связывания , цианин на основе двухцепочечной ДНК химии 2 и теперь доступен для химии зонда на основе с использованием темных закалочных зондов 3. Эта платформа была в основном использовалась для генетического профилирования в организме человека 4 и 5 животных. Недавно он был адаптирован для обнаружения ДНК и РНК патогенами через кровь по Григоренко и др. 6 с использованием процедуры двухступенчатую обратной транскрипции / предварительной амплификации (предусилитель).
Здесь мы опишем процедуру предварительного усилителя на основе один шаг для определения обоих типов возбудителей в дыхательной секretions и множество других типов образцов, которые могут быть выполнены полностью в стандартном рабочего дня. По окончании одностадийного предусилитель, образцы переносили в 384-луночный планшет, который является формат, понимаемый автоматизированной системы обработки жидкости, которая поставляется с этой наноразмерной платформы PCR. Система рисует мастер-микс и образец по всей поверхности до 4-х пластин (192 образцов и контролей) в то время. После этого процесса загрузки, мы опишем, как образцы усиливаются и проанализированы с помощью макро-таблицу, которая суммирует среднем 3 технических повторах для каждого образца / целевой комбинации в таблице, которая помещается на одной печатной странице.
был установлен единый способ анализа экстрагированной ДНК и / или РНК из образцов с использованием этой платформы. Большое разнообразие образцов были извлечены, обратной транскрипции, и предварительно усиливается в формате 96-луночного, сводя к минимуму вероятность ошибок. Респираторные испытанные образцы включали носовые тампоны, глубокие глоточные тампоны,транс-трахеи смывки, БАЛ и легочной ткани. Так как некоторые из агентов протестированных также могут присутствовать в периферической крови или кала, мы включили эти типы образцов в процедуру. Это упорядоченный документооборот помогает экономить время и ресурсы по сравнению с проведения экспериментов в нескольких пластин, обеспечивая эффективное тестирование путем выявления генов патогена и токсин панели на основе вместо индивидуального тестирования. Дыхательная панель продемонстрировала здесь было 18 анализов, каждая печатается в трех экземплярах сквозных отверстий, вмещающий до 48 образцов на чашку. Лошадиный патогенных микроорганизмов , обнаруженных включены лошадиный аденовирус 1 и 2, вирус лошадиной артериит, лошадиный вирус насморка А и В, лошадиный вирус герпеса (сверхвысокого) типов 1 и 4, и стрептококки следу. Клыка патогены включены собачьего дыхательную коронавируса (betacoronavirus), собачий вирус чумки, собачий аденовирус, собачий вирус парагриппа, собачьи пневмовируса, Bordetella bronchiseptica и Mycoplasma Cynos.универсальные гриппа были также включены анализ и внутренний контроль (MS2 РНК фага).
Protocol
Никакие человеческие предметы или экспериментальных животных не были использованы для разработки этого протокола. Органы управления были получены путем очистки последовательности подтвержденных ампликонов и в пробирке транскрипции для РНК - мишеней. Клинические образцы были представлены для рутинного диагностического тестирования на здоровье диагностического центра Корнелла животных.
1. Тарелка Дизайн
- Использование праймера разработки программного обеспечения, чтобы убедиться, что каждый тест соответствует стандартным зондом на основе реального времени условий ПЦР с велосипедными 60 ° C отжига с использованием тест-праймера измерительного щупа инструмента (выберите Количественное настройки с параметрами по умолчанию датчика).
ПРИМЕЧАНИЕ: Представитель РНК - мишени использовали был адаптирован из универсального гриппа Матрица целевой анализ опубликованных Shu и др 7.. Праймеры и зонд следующим образом: Прямой праймер: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, обратный праймер: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, зонд: FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. Анализ ДНК представитель, используемый здесь был адаптирован сюдам тип герпесвирусов 1 (EHV-1) метод обнаружения лошадиный опубликованные Элия и др. 8. Праймеры и зонд следующим образом: Прямой праймер: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, обратный праймер: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, зонд: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY. - Заказать наноразмерные амплификации пластин ПЦР в нужной конфигурации.
Примечание: Для данного исследования использовали формат экспрессии гена 18x3 (таблица 1). Обеспечение последовательности для всех праймеров и зондов (или инвентаризированных идентификаторов анализ) для каждой цели к производителю.
2. нуклеиновые кислоты экстракции
- Извлечение всей нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) любым желаемым способом.
ПРИМЕЧАНИЕ: автоматизированный набор для выделения магнитного шарика на основе был использован здесь в соответствии с инструкциями изготовителя (см таблицу материалов для получения более подробной информации). - Подготовка проб следующим образом:
- Очистите внешнюю поверхность каждого контейнера для образца с 10% хлорной извести и тщательно высушите. Протрите перчатке пИнгер советы с 10% хлорной между образцами для предотвращения перекрестного загрязнения.
- Место назального или глубоких глоточные тампоны в любом стерильном закрытом сосуде (например, красный пробирку для сбора крови верхняя) с несколькими каплями физиологического раствора добавляют для предотвращения высыхание до обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хлопок, пластик, дерево ручкой и лавсана и другие синтетические тампоны все приемлемо, но избежать альгинатные тампоны кальция. - Для получения мазков и трахеи моет, добавьте Дульбекко модифицированную Дульбекко (DMEM), так что есть по крайней мере 1-2 мл жидкости. Vortex тампон и DMEM энергично в трубке. Затем, с помощью пипетки для передачи около 1 мл среды в новую пробирку.
- Механически лизису ткани (100-200 мг в 1 мл DMEM) с использованием дезинтегратор ткани в соответствии с инструкциями изготовителя с последующим центрифугированием в течение 3 мин при 825 х г. Перенести 500 мкл супернатанта в новую пробирку.
- Для калом, смешайте 400 мг фекалии с 800 мкл 1x фосфатно-буферном салиния рН 7,4 (PBS). Vortex суспензии в течение 1 мин или дольше, пока образец не является гомогенизированный или полностью приостановлено. После того, как гомогенизированный, центрифугирование суспензии в течение 10 мин при 18000 х г, а затем передать 400 мкл в новую пробирку.
- Для всей uncoagulated крови, вихрь образец и сделать 250 мкл аликвоты. Добавьте шесть капель литического реагента и вихрем перемешать. Инкубировать 15 мин при 37 ° С.
- Подготовить лизису и мыть буферы в соответствии с инструкциями изготовителя. Добавить MS2 бактериофаг или внутренний контроль выбора в буфер для лизиса в качестве внутреннего положительного контроля 9 экстракции.
- Добавить 235 мкл буфера для лизиса и 175 мкл образца (или PBS для отрицательного контроля) для каждой трубки шарик. Далее с протоколом производителя.
Примечание: Очищенная общей нуклеиновой кислоты, элюировали здесь в 90 мкл.
3. обратной транскрипции / Pre-амплификации (предусилитель)
Примечание: Храните все реагенты и образцы, используемые вРеакционный предусилитель на льду во все времена. После предварительного усилителя, держать все реагенты при комнатной температуре.
- Собрать элюированной ДНК и / или РНК, реакции ПЦР Mix, нуклеазы без воды в качестве отрицательного контроля, и объединенные стандарты для положительного контроля амплификации.
ПРИМЕЧАНИЕ: До 48 образцов могут быть запущены на амплификации пластины, включая элементы управления (включают в себя, по меньшей мере, один отрицательный контроль экстракции для каждой экстракционной пластины, из которой образцы потянуться). - Распечатайте карту образца. У второго человека проверить, что и карты образца матча макета.
- В 1,5 мл пробирку, добавьте следующие строки, чтобы подготовить мастер-микс предусилитель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем 14 мкл здесь был использован.- Добавить пул предварительно перемешанной смеси праймеров с каждой мишени, так что конечная концентрация каждого праймера составляет 900 нМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бассейн, используемый здесь был подготовлен при 10x концентрации, и 1,4 мкл добавляли в реакции. - Добавить случайных праймеров до конечной концентрации 600 нМ или 0.1x. Добавить смесь 2x RT-КПЦР до половины конечного объема (7 мкл здесь).
- Смешайте компоненты основной смеси вместе, осторожно встряхивая и спиннинг вниз.
- Добавить пул предварительно перемешанной смеси праймеров с каждой мишени, так что конечная концентрация каждого праймера составляет 900 нМ.
- Выполните предусилитель в стандартной 96-луночного планшета, используя левую сторону пластины только (столбцы 1-6).
- Добавить 8,5 мкл смеси предусилителя основной и 5,5 мкл образца ДНК / РНК в каждую лунку.
- После объединения все реагенты (образцы, положительные контрольные и отрицательный контроль с предусилителя смеси), тщательно загерметизировать стандартную 96-луночного планшета с четкой клеевой прокладкой. Удалите излишки уплотнение с помощью лезвия бритвы, чтобы предотвратить образование зазоров уплотнения во время езды на велосипеде. Центрифуга герметичную пластину в течение 20 с использованием планшетов, кок ПЦР. Проверьте, чтобы гарантировать, что все реагенты объединены в нижней части лунок планшета.
- Запуск анализа предусилителя на обычном амплификатора при следующих условиях: 15 мин при 50 ° С; 1 мин при 95 ° С; 20 циклов, 15 секунд при 95 ° С, а затем 2 мин при 60 ° C; 99.9 & #176 ° С в течение 10 мин; держать при температуре 4 ° С. Программа этих условий перед началом.
- Включите обычной амплификатор, выберите программу велосипедный предусилителя и запустить программу. Поместите 96-луночный планшет в амплификатор только тогда, когда нижняя часть амплификатор (а не обложка) достигает температуры, необходимой для производства кДНК (50 ° C), путем контроля температуры чтения на экране. До этого, держать пластины простуду, чтобы минимизировать риск получения ложных положительных результатов.
- После того, как предусилитель запуска завершена, убедитесь, что пластина оставались закрытыми.
- Переходите сразу к шагу 4.1. Чтобы сохранить эту пластину на ночь, выполняют разбавление, как описано в пунктах 4.2 до 4.5, за исключением того, вместо того, чтобы свободно накрывая планшету, запечатать пластину с четким клеевой уплотнением и места внутри молнии лок пакет, хранят при температуре 4 ° С.
4. Разбавление предусилителя плиты
- Удалить соответствующее количество усилительных пластин сюдам в морозильной камере (до 4-х может быть запущена сразу). Не открывайте упаковку. Разрешить пластины, чтобы разогреть в течение по крайней мере 15 мин при комнатной температуре. Запишите серийный номер и номер партии пластины.
Примечание: Нераскрытые пластины могут храниться при комнатной температуре в течение до 24 часов, но для наилучшей практики, удалить их из морозильной камеры не более чем за 30 минут до они не потребуются. - Центрифуга заполненную предусилителя пластину в течение 20 секунд с помощью пластины кок PCR. Включите усиления аппарата и компьютера и запустить соответствующую программу.
- Удалите все ненужные элементы из области настройки PCR. Положите на двойные перчатки и крышки втулки.
- Снимите уплотнение с предусилителя пластины и осторожно снять и выбросить внешние перчатки. Развести предусилителя продукты в соотношении 1: 5 путем добавления 56 мкл ТЕ-буфера в каждую лунку колонок 1-6 предусилителя 96-луночного планшета и смешивания с помощью пипетки вверх и вниз. Идите только к первой остановке пипетку, аспирационных от дна и выдачи выше, но не создаваяпузыри. Добавить TE буфера для всех 6 столбцов, независимо от неиспользуемых скважин.
- Reseal пластинку либо прозрачного клея или уплотнения из фольги, и центрифугировать ее в течение 20 секунд с помощью пластины кок PCR. Установите эту пластину в сторону (свободно охватывал) до шага 6.1 завершена. Выбросьте оставшиеся перчатки и крышки втулки.
5. Подготовка к 384-луночного Трансфер в Amplification плиты
- Настройка материалов, необходимых для покрытия и герметизации усиления пластины: крышка, пробки, шприц иммерсионной жидкости, плиты пресса, этанол шприц бутылку и безворсовых лабораторных салфетками. Снимите колпачок шприца и зафиксировать небольшой пластиковый наконечник на шприц (требуется усилие). Выброс небольшое количество жидкости для погружения на бумажное полотенце, чтобы удалить воздух накопления (это нормально, если некоторые маленькие пузырьки воздуха остаются в наконечнике). С помощью иммерсионной жидкости в течение 60 мин удаления шприц из вакуумного запечатаны алюминиевой мешок. После того, как шприц открыт, не прикрепить крышку для последующего использования.
- Проверьтечто корзина для мусора пластинчатого загрузки жидкости обработчика пуст и откройте окно подсказок. Напишите дату истечения кончиков на кончике крышки коробки, когда открывается новая коробка, и обеспечить, чтобы советы не истек. Включите жидкости обработчик и компьютер и откройте жидкость программного обеспечения обработчика, который будет выполнять самодиагностику.
- Нажмите кнопку "Настройка и Load". Нажмите кнопку "Обзор", чтобы выбрать файл CSV, созданный с помощью программного обеспечения Пример Tracker. Если файл не отображается, перейдите в раздел "Инструмент / Edit Preferences" и нажмите кнопку "Изменить" на "Пример плиты папки с файлами". Выберите папку, в которой сохранен файл CSV. Затем нажмите кнопку "Setup и Load", затем "Обзор" и выберите файл.
- Затем нажмите кнопку "Обзор" рядом с "тарелкой держатель Положение 1" и выберите файл TPF (предоставленный производителем), который имеет тот же серийный номер, что и пластины.
6. Жидкая Хэндлер Transfer
Примечание: Не начинайте фи384 заполнение-луночного планшета, пока все указанные выше действия не являются полными. Испарение вызывает озабоченность с небольшими объемами - не позволяйте 384-луночный планшет сидеть с непокрытой жидкостью внутри.
- После того, как все вышеперечисленные шаги завершены поставить на новые, хорошо оборудованные двойные перчатки и втулки крышки. Затем добавляют 2,5 мкл амплификации мастер-смеси в 384-луночный планшет.
- Передача 2,5 мкл разбавленного предусилителя продукта в 384-луночный планшет в соответствии с картой в таблице 2 , и сразу же покрывают пластину плотно с уплотнением из фольги. Отбросить внешние перчатки и крышки втулки.
- Центрифуга 384-луночного планшета в течение 20 секунд в пластинчатом блесны ПЦР.
- Не снимайте уплотнение из фольги, но поместить 384-луночного планшета в жидкости обработчика.
- Откройте пакет, содержащий заключенную амплификации пластину и поместите его осторожно в жидком обработчиком в первый слот с серийным номером справа - держать дело по краям, не касаясь поверхности Ое пластины. Используйте распакованных пластины в течение одного часа открытия.
Примечание: Целью случая является защита пластины от прикосновения, так как это может нарушить небольших количеств праймеров и зондов внутри сквозных отверстий. - Снять уплотнение из фольги с 384-луночного планшета внутри жидкости обработчика сразу все на месте. Нажмите кнопку Далее, а затем проверить все коробки, как каждый шаг завершен. Нажмите кнопку OK, чтобы запустить прогон.
- Закройте дверь в жидкости обработчик и немедленно начать процесс заполнения. Пребывание рядом с жидким обработчиком и сразу перейти к следующему шагу, как только пластина заполняется.
- В то время как жидкость обработчик работает, удалить защитную пленку с нижней части корпуса крышки.
Примечание: Клей на нижней части корпуса крышки покрыта красной лентой и защитной пленкой. Пленка должна быть удалена в первую очередь, чтобы получить доступ красную ленту.- Оставьте верхнюю пленку на месте до стадии 6,15. Премьер-красная лента, слегка потянув к локализуйтее его из клея.
- Удалить загруженный (заполненную) амплификации пластину из жидкого обработчика и аккуратно поместите его в плиточном прессе с серийным номером справа.
- Поместите крышку на верхней части пластины с вырезом на правой и клей на нижней части (указывает на пластину).
- Потяните вниз на пресс рычаг пластины аккуратно прикрыв ее; свет будет мигать в течение 20 сек. Не прикасайтесь к пластине пресса в течение этого времени. После того, как свет загорится зеленым цветом, поднимите рычаг тщательно и осторожно снимите герметичную пластину, удерживая его по краям.
- Удерживая запечатанный усиления пластины вертикально по краям корпуса, немедленно вставьте наконечник шприца в порт погрузки в конце корпуса, а затем отказаться от иммерсионной жидкости медленно в одном нежном непрерывном движении, чтобы заполнить пространство между пластиной и крышка. Оставьте один небольшой воздушный пузырь в углу, как только плита погружается.
- Продолжая чстарый планшет вертикально по краям, запечатать загрузочное отверстие, вставив вилку в порт и скручивание заглушку по часовой стрелке, применяя достаточное давление, пока ручка не обламывается. Захвата кромок корпуса плотно так, чтобы сила рукоятки разрыва не вызывает так, чтобы упасть. Если пластина опускается, отказаться от него.
- Очистите корпус с безворсовой вытирать, которая была тщательно распыляется с этанолом. Сушить случай, протрите корпус вниз с чистой салфеткой. Аккуратно обрабатываем случай; убедитесь, что не надавливать на стекло над скважинами.
- Доведите запечатанную пластину к амплификации машины. На вкладке "Инструмент", выберите "приборной консоли." Выберите машину усиления затем нажмите на кнопку «открытых дверей».
- Поместите пластину усиления в первый слот адаптера пластины, убедившись, что адаптер правильно выстроены с A1 в верхнем левом углу. Сориентировать пластину со штрихкодом лицевой стороной вверх и в сторонупередняя часть прибора. Нажмите кнопку "Закрыть" двери. Обратите внимание на использование адаптера лотка - есть ограничение на 10 применений.
- На вкладке Главная в нижней части экрана, в меню Run выберите OpenArray. Нажмите кнопку "Получить идентификаторы пластины." Пустые коробки будут автоматически заполнены информацией о плите. Чтобы начать прогон, нажмите кнопку "Пуск Выполнить".
- Закройте программное обеспечение жидкости обработчик и выключите жидкий обработчик. Поместите крышку опрокидыванию стойки наконечника. Выбросьте кончики из бункера отходов и очистить его. Чистый и обеззаразить все элементы, включая рабочую поверхность, пипеткой, ведро отходов, а также советы коробки.
- Reseal на предусилитель пластину с четким клеевой прокладкой и хранят при -20 ° C.
7. Результат анализа
- После того, как запуск завершен, сохраните файл, а затем нажмите на кнопку "X" на вкладке с именем запуска в нижней части экрана, чтобы закрыть файл.
- Нажмите на "открытых дверей"В верхней части экрана, чтобы открыть дверцу. Снимите пластину усиления, проверяя, что ни погружения жидкость не просочилась. Нажмите на кнопку" закрыть дверь "в верхней части экрана, чтобы закрыть дверь.
- Нажмите кнопку "Открыть" и выберите файл запуска, чтобы открыть его. Нажмите на зеленую кнопку Анализ в правом верхнем углу экрана. Нажмите кнопку "Экспорт" на левой стороне экрана, а затем "Пуск Экспорт", чтобы экспортировать результаты (в виде файла .txt). Минимизация файл после того, как она открывается. Затем нажмите кнопку "Экспорт КК изображений."
- Обзор изображений QC в программе анализа изображений в соответствии со следующими критериями:
- Оценка качества загрузки с использованием PRE-READ_CHANNEL_4.tiff и пост-READ_CHANNEL_4.tiff, проверяя, что нет темных пятен или пятен.
Примечание: Краситель детектируется этого канала добавляется производителем к праймеров и зондов, который высвобождается в раствор, когда реакция загружается. Чтение в этом канале указывает на то, что реакции были правильнозагружены и что праймеры и зонд, смешанного с красителем присутствовали. - Проверить на наличие утечек или агитация к пластине после загрузки с использованием S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. Если изображение выглядит темным, увеличьте яркость (нажмите Ctrl + Shift + C, чтобы открыть элементы управления), пока вся пластина не видна. Убедитесь, что изображение выглядит равномерным, без теней, пузыри или перемещенных образцов.
- Оценка размещения крышки и мусора под крышкой (яркие пятна), используя STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff и STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
- Оценка качества загрузки с использованием PRE-READ_CHANNEL_4.tiff и пост-READ_CHANNEL_4.tiff, проверяя, что нет темных пятен или пятен.
- Необязательно: Откройте таблицу, содержащий результаты макросъемки (Дополнительный файл код). В файле экспорта данных, щелкните правой кнопкой мыши на вкладке в нижней части экрана и выберите "Переместить или Копировать". В поле "к книге", выберите "Результаты Macro.xlsm". Нажмите кнопку "Переместить в конец" и установите флажок "Создать копию". Затем нажмите кнопку ОК.
- Если опция Результаты Макро не отображается в поле "заказать", симслойные скопировать содержимое экспортированного файла данных листа (нажмите на верхней левой ячейке, чтобы выделить все ячейки и Ctrl-C) и вставить его в новой вкладке.
- Удалить вкладку старый "Экспорт", а затем переименовать вкладку вновь добавленный как "экспорт".
- Нажмите "Alt-F8" (или нажмите кнопку View затем Macros), затем выберите "макро" и нажмите кнопку "Выполнить". Затем повторите это для Macro2, нажав кнопку "Alt-F8", а затем выбрав пункт "Macro2" и нажать кнопку "Выполнить".
- Переименовать файл результатов Macro, используя соответствующую информацию (дата и серийный номер), поместите эту информацию над таблицей, и сохраните как же именем файла в папке экспортированной Результаты. И, наконец, распечатать макро генерируемые таблицы результатов.
- В машине программного обеспечения амплификации, проверьте кривые для каждого образца и контроля по отношению к макро-таблицы, выбрав Анализ / график амплификации на левой стороне экрана. Затем выберите вкладку Sample, и нажмите на каждом образце доподтвердить, что есть 2 или 3 положительных кривые усиления для каждого из положительных результатов в таблице.
- Выключите машину усиления.
Representative Results
Результаты показаны на фиг.1 и 2 , для репрезентативного анализа РНК (матричной) и гриппа анализа ДНК (EHV-1) с комбинацией положительного контроля и клинических образцах , представленных для рутинного диагностического тестирования. Сигналы флуоресценции , испускаемые по всей этой типичной реакции, показаны на рисунке 1, на котором приведены необработанные значения флуоресценции за один цикл. Все значения относительного порогового цикла (Ct) были автоматически программным обеспечением усиления машины. Фоновой флуоресценции использовали в качестве отдельной метрики для оценки качества нагрузки, а не включать его в показания флуоресценции до расчета значений Ct.
Аналитический предел обнаружения (LOD) для каждой цели была рассчитана на основе общего среднего значений Ct на уровне обнаружения на 95% плюс 2 стандартных отклонения в пуле управления длявсе цели. Самый высокий титр, где по меньшей мере 95% из повторностей были положительными для представительных анализов было 50 копий; обнаружение 5 копий было успешным в 50% повторах. Ни один анализ был обнаружен в одном экземпляре ниже. В LODs для РНК и ДНК анализа были рассчитаны при значениях КТ 21.92 и 20.05. Эти значения считаются отсечек для значений отчетности в качестве положительного против подозреваемого (потенциально не повторяется).
Другие аспекты аналитического выполнения целевых показателей оценивали с использованием серийных разведений суммированных положительного контроля работают на трех разных дней (рисунок 2). Средние Эффективности представительными РНК и ДНК анализы 101,1% и 106,6%; общая средняя эффективность для всех целей был 101,3%. Анализы также имели хорошую линейность (R 2> 0,98). Вариация в пределах повторности сквозных отверстий, как правило, находится в пределах стандартных отклонений от 0,2 для обоих клинических образцовD управления. Не наблюдалось перекрестной реактивности между какими-либо целей.
Окончательные результаты рабочего листа в дополнительном файле показывает репрезентативные количественные результаты 10 клинических диагностических образцов и 4 управления. Клинические образцы представляют собой подмножество типов образцов тестируется в том числе носовых / ротоглотки мазки, легочной ткани, и фекальных образцов. Один (лошадиный) фекальный образец в этом наборе показывает неудавшийся MS2 внутреннего контроля, что указывает на наличие ингибиторов в пробе. Это обычно осуществляется путем разбавления элюированного образца и / или повторной экстракции. Как в данном случае, отрицательный контроль амплификации должен быть отрицательным для всех целей, а также отрицательный контроль экстракции должен содержать только внутренний контроль. В клиническом наборе, образцы получены значения Ct для betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, собачьей чумки вирус, собачий вирус парагриппа, собачьего пневмовируса и гриппаА.
Рисунок 1. Amplification участки. Измерение флюоресценции нанесены на график циклов амплификации для анализа РНК (А) и ДНК - анализа (В). Треугольники приведены обозначения значения Ct. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Стандартные кривые. Стандартные кривые из РНК и ДНК анализа тестируемой на три разные дни отложены для того , чтобы продемонстрировать , линейности и диапазон усиления с использованием положительного контроля. Порогового цикла значения (Ct) нанесены на график бревна (10) числа копий РНК (А) или ДНК (
Таблица 1. Схема расположения пластин и мишени амплификации. Пластины , используемые для наноразмерных в режиме реального времени тестирования ПЦР на этой платформе микроскопа размера и расположены в 48 подмассивов из 64 сквозных отверстий, в общей сложности 3,072 сквозных отверстий для индивидуальных реакций. Один подмассив показано здесь, с 18 целей в трех экземплярах. Каждый образец добавляется к одному подмассиве жидким обработчику. Пластины покрыты гидрофильным и гидрофобным соединениями для удержания реагентов в сквозных отверстий с помощью поверхностного натяжения. Чип из нержавеющей стали "фотолитографически рисунком и мокрый травлением, чтобы сформировать прямолинейное массив 3072 микро-механической обработке, diamete 320 мкм. г отверстия 33 нл каждого "2 Сокращения для целей заключаются в следующем: BCOR, собачьи респираторного коронавируса (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, собачий аденовирус, CPIV, собачий вирус парагриппа; CPNV, собачьи пневмовирусов; Количес / B, собачьи чумки вируса а и В; EADV1 / 2, лошадиный аденовирус 1/2; EAV, лошадиного артериита вируса; EHV1 / 4, лошадиного типа герпесвирусов 1/4; ERVA в ходе / B, лошадиный вирус насморка A / B; IVM, гриппа а матрица; MCYNOS, Mycoplasma Cynos; MS2, внутренний контроль (MS2 РНК фага); SEQU, Streptococcus Equi.
Таблица 2. Карта переноса плиты. С цветовым кодом пластина карта передачи данных для использования фиксированной пипетки 8-канальный для передачи от 96-луночного предусилителя пластины к 384-луночного планшета показана. С другой стороны, может быть использован регулируемый пипетку. Та же процедура выполняется каждый раз, независимо от того, ч вл много образцов в плите.
Справочная информация. Макрос с поддержкой таблицы файл , содержащий два макроса для форматирования результатов в сводной таблице (как описано в протоколе) предоставляется. Типичный результат таблица генерируется с помощью макросов включается в файл (под окончательные результаты). Два макроса заполнит имена образцов в первой колонке (до 48 образцов), и среднее из трех значений Ct для каждой цели для тех, с положительными результатами; отметить, что цели, которые не усиливающие оказываются пустыми в этой таблице. Это может быть легко напечатаны на одном листе бумаги, и используется в качестве эталона для эффективного контроля исходных данных. На вкладке окончательные результаты, репрезентативные результаты для 10 клинических образцов и 4 управления показаны. Сокращения для имен анализа приведены в условных обозначениях таблицы 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Эта процедура была использована для рутинного тестирования респираторных патогенов в нашей лаборатории на протяжении шести месяцев (2-3 раза в неделю). Мы также имели успех, используя ту же самую процедуру для кишечно-патогенной профилирование в образцах фекалий и бактериальных изолятов на отдельно заказной пластины. После того, как пластины производятся, опытные специалисты могут выполнить шаги 2-7 в пределах одного стандартного рабочего дня. Наиболее важные шаги являются надлежащее уплотнение предусилителя пластины, перенос предусилитель с образцов между пластинами (что должно быть сделано быстро, чтобы предотвратить испарение), и окончательное покрытие усилительной пластины. Использование макросов электронной таблицы в качестве руководства для анализа результатов проверки (кривые для образцов и контролей) также критично, как это значительно сократило количество времени и документов, необходимых для этого процесса. Предоставленный макросов с электронными таблицами является примером; он должен был бы быть изменен или воссозданы для пластин с различными конфигурациями. Это легко может быть реrformed кем-то с базовыми знаниями с электронными таблицами.
Из-за очень небольшого количества образца погрузили на усилительной пластине (33 NL), требуется предварительной амплификации. В оптимизации этого протокола (не показан), мы сравнили ряд параметров предусплением включая мастер-смеси, добавление случайных праймеров, числа циклов, времени отжига и разбавления до амплификации. Каждая цель имеет свои собственные оптимальные условия, и те, которые описаны здесь, представляют собой те, которые дали наилучший предел обнаружения для целом нашей панели. Эта панель охватывает широкий спектр патогенных мишеней и типов образцов, которые встречаются в повседневной ветеринарной диагностической проверки, но модификации процедур предусилением могут быть необходимы для различных панелей. Производитель-оптимизированные условия амплификации на основе стандартного зонда на основе реального времени протокола ПЦР с 10 мин при 95 ° C активации ферментов с последующей денатурации при 95 ° С и аппИлинга / удлинение при 60 ° С. Праймеры и зонды с предварительно напечатанной на пластинах также с использованием условий изготовителем оптимизированы и, следовательно, не требуют титрование. Сочетание обратной транскрипции и предварительной амплификации шаги для всех образцов (вне зависимости от типа мишени) было необходимо для того, чтобы сохранить эффективность в рабочем процессе. Имея все образцы обратной транскрипции также полезно для максимизации чувствительности. Кроме того, использование мастер-микс для предусилителя, который оптимизирован для минимизации ингибиторов позволяет гибкость в сочетании различных типов образцов на той же пластинке.
Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) матрицы гриппа анализа , описанного Shu и др. 7 и адаптированной здесь nanoliter масштабных реакций является универсальным гриппа анализ , который подходит для тестирования образцов от людей и домашних животных. Она была разработана для универсального обнаружения матричного гена всех вирусов гриппа А с использованием микролитр масштаба Reactions. Он был использован во всем мире как часть вируса панели CDC гриппа человека и гриппа группы экспертов CDC Свиньи. СВН-1 тест 8 приспособлен здесь обнаруживает важную респираторный патоген лошадей , которые могут вызвать выкидыши и неврологическое заболевание (обзор Pusterla и Хасси 10). Значение адаптации этих тестов к высокой пропускной способности платформы с видами, независимый от внутреннего контроля является то, что они могут быть включены в подход OneHealth наблюдения. Наличие обоих этих анализов на платформе тестирования с высокой пропускной способностью будет способствовать готовности к чрезвычайным ситуациям для клинических учреждений, приютов и событий производительности.
Описанные выше результаты были репрезентативными для всех целей на плите за исключением Mycoplasma собакоподобных обезьян, который показал значительно больший разброс в аналитической деятельности. Это, вероятно , связано с неоптимальной температурой плавления (Т м) праймеров, которые в идеале должны быть 58-60 &# 176; С (идеальный зонд Тт 68-70 ° С). Ограничение этой платформы является то, что она занимает больше времени, чтобы спроектировать и изготовить пластины, чем для заказа отдельных зондов, что ограничивает возможность быстро изменять последовательности. Другим ограничением ПЦР в реальном времени в целом является неспособность обнаружить роман или неожиданные патогены. Эту проблему можно решить в некоторой степени путем разработки анализов , которые соответствуют последовательности в нескольких видов, но Несмещенные методологии , основанные целом секвенирование генома больше подходят для открытия новых препаратов. 11,12
Наномасштабная ПЦР в реальном времени позволяет новую парадигму синдрома на основе, а не на основе видов тестирования, что полезно для снижения расходов реагентов и рабочей силы в высокой пропускной способности молекулярной диагностики. Масштабное тестирование панели с помощью такого подхода может способствовать OneHealth усилия наблюдения , например, те , которые описаны Данна и Gurfield 13 и Moutailler и др. 14. Сбор образцов мазков рано,как правило, в течение 3 дней клинического начала, обеспечивает лучший шанс определить наличие респираторных патогенов. Инфекционное заболевание, появление часто непредсказуемо, и тесты, которые могут быть выполнены на различных видах без необходимости модификации реагентов являются идеальными для обеспечения готовности. Будущие приложения этой технологии, вероятно, будут в pathotyping, антимикробной резистентности, профилирование и дальнейшего синдрома на основе клинико-диагностических панелей. Наномасштабная ПЦР в реальном времени является наиболее полезным для быстрого, высокопроизводительного скрининга множественных образцов и возбудителем типов, и будет дополняться объективными или частично смещенных секвенирования на основе подходов для выявления новых и возникающих патогенных микроорганизмов.
Disclosures
Марсия Слейтер и Елен Ortenberg являются сотрудниками компании Thermo Fisher Scientific Inc., которая производит реагенты и инструменты, используемые в этой статье.
Acknowledgments
Работа на анализах респираторных патогенов, описанных здесь, была поддержана Cornell Animal Health диагностический центр фондов внутреннего развития. Разработка наноуровне ПЦР рабочих процессов и связанных с ними систем обеспечения качества частично финансировалась (FOA PA-13-244) и осуществляется в сотрудничестве с Продовольственной и лекарствами администрации ветеринарной лаборатории расследований и ответных мер (FDA Vet-LIRN) под грант № 1U18FD005144- 01. Платы публикации спонсировал VWR и Quanta Biosciences. Мы благодарим Габриэль Никерсон, Roopa Венугопалана, Veldina Camo, XiuLin Чжан, Jinzhi Ю, Weihua Ван, и Катрина Уокер за их помощь в написании и пересмотра протокола. Мы благодарим Mike Carroll для съемок интервью автора. Мы, наконец, поблагодарить редактора и три анонимных рецензентов за их полезные замечания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4482221 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
References
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).
- Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).
- McCall, M. N., et al. A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform. BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).
- Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform. Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).
- Grigorenko, E., et al. Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform. J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).
- Shu, B., et al. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).
- Elia, G., et al. Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR. J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).
- Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays. J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).
- Pusterla, N., Hussey, G. S.
- Firth, C., Lipkin, W. I.
- Lecuit, M., Eloit, M. The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).
- Dunne, G., Gurfield, N. Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).
- Moutailler, S., et al. Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception. PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539 (2016).
