nanoscale पीसीआर द्वारा डीएनए और आरएनए आधारित रोगाणुओं की उच्च throughput परीक्षण एक स्यन्द्रोमिक कुत्ते और घोड़े सांस की पीसीआर पैनल का उपयोग वर्णित है।
Nanoliter पैमाने वास्तविक समय पीसीआर कई assays प्रतिक्रियाओं के साथ संयोजन के विशिष्ट कमियां के बिना एक ही थाली पर समानांतर में चलाने के लिए अनुमति देने के लिए स्थानिक बहुसंकेतन उपयोग करता है। हम डिजाइन और एक पैनल इस सिद्धांत के आधार पर तेजी से कुत्तों और तीव्र श्वसन बीमारी के साथ घोड़ों में आम बीमारी एजेंटों की उपस्थिति की पहचान करने के लिए मूल्यांकन किया है। यह पांडुलिपि नमूना तैयार करने, प्रवर्धन, और लक्ष्य रोगज़नक़ दृश्यों के विश्लेषण के लिए एक nanoscale नैदानिक पीसीआर कार्यप्रवाह का वर्णन करता है, प्रक्रियाओं है कि microliter पैमाने प्रतिक्रियाओं से अलग कर रहे हैं पर ध्यान दे। प्रस्तुत श्वसन पैनल में, 18 assays प्रत्येक तीन प्रतियों में स्थापित किए गए थे, प्रति प्लेट 48 नमूनों को समायोजित। एक सार्वभौमिक निकासी और पूर्व प्रवर्धन कार्यप्रवाह उच्च throughput नमूना तैयार करने के लिए अनुकूलित किया गया था कई matrices और डीएनए और आरएनए आधारित रोगजनकों समायोजित करने के लिए। प्रतिनिधि डेटा एक आरएनए लक्ष्य (इन्फ्लूएंजा एक मैट्रिक्स) और एक डीएनए लक्ष्य (घोड़े का herpesvirus के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं1)। जल्दी और सही रोगाणुओं की एक व्यापक, सिंड्रोम आधारित समूह के लिए परीक्षण करने की क्षमता और दक्षता नैदानिक परीक्षण के ergonomics में सुधार के लिए और तीव्र श्वसन रोग निदान और प्रबंधन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
मनुष्यों और पशुओं के लिए नैदानिक निदान में कई एजेंटों के तेजी से और व्यापक पता लगाने के लिए मांग के साथ, रोगज़नक़ पता लगाने के लिए एकल जीव आणविक निदान विधियों भारी हैं, जब तक कि नमूनों की बड़ी संख्या के लिए इस्तेमाल एक ही बीमारी के लिए परीक्षण किया जा रहा है। पशु चिकित्सा संदर्भ में, उच्च throughput नैदानिक तरीके प्रजातियों में से एक विस्तृत विविधता से रोगजनकों को कवर करने के लिए अतिरिक्त आवश्यकता के कारण विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। OneHealth खाद्य जनित रोग के प्रबंधन और उभरते रोगज़नक़ निगरानी के लिए दृष्टिकोण के परीक्षण की जरूरत है कि बैक्टीरिया की एक संख्या शामिल के उदाहरण हैं, वायरस (डीएनए या आरएनए आधारित), परजीवी, और कवक। परीक्षण दक्षता में सुधार करने के क्रम में एक साथ कई analytes (बहुसंकेतन) के लिए परीक्षण के संयोजन के लिए चुनौती संवेदनशीलता का एक संभावित नुकसान और अनुकूलन और assays के सत्यापन के लिए एक बड़ा बोझ है।
Nanoliter पैमाने वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक बदल रहा हैबहुसंकेतन की प्रथा है कि कई अलग प्रतिक्रियाओं ही नमूना 1 पर एक साथ चलाने के लिए अनुमति देता है के मूल निवासी। OpenArray मंच इस सिद्धांत 2 का एक आवेदन पत्र है; इसके साथ वास्तविक समय पीसीआर माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी को जोड़ती है। स्थानिक बहुसंकेतन की अवधारणा के आधार पर, हर नमूना एक बड़ा माध्यम से छेद अलग में लक्ष्य की संख्या के लिए परीक्षण किया है। इस मंच के शुरू में जाती आधारित डबल असहाय डीएनए बाध्यकारी रसायन शास्त्र 2 के साथ इस्तेमाल किया गया था और अंधेरे शमन जांच 3 का उपयोग कर जांच-आधारित रसायन शास्त्र के लिए अब उपलब्ध है। इस मंच मुख्य रूप से इंसानों और जानवरों 4 5 में आनुवंशिक रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह हाल ही में Grigorenko एट अल द्वारा रक्त जनित डीएनए और आरएनए रोगजनकों का पता लगाने के लिए 6 एक दो कदम रिवर्स प्रतिलेखन / पूर्व प्रवर्धन (preamp) प्रक्रिया का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था।।
हम यहाँ श्वसन सेकंड में रोगाणुओं की दोनों प्रकार का पता लगाने के लिए एक एक कदम preamp आधारित प्रक्रिया का वर्णनretions और अन्य प्रकार नमूना है कि एक मानक कार्यदिवस में पूरी तरह से प्रदर्शन किया जा सकता है की एक किस्म है। एक कदम preamp के पूरा होने पर, नमूने 384 अच्छी तरह से थाली है, जो प्रारूप स्वचालित तरल हैंडलिंग प्रणाली है कि इस nanoscale पीसीआर मंच के साथ आता है द्वारा स्वीकार कर लिया है के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। प्रणाली एक समय में मास्टर मिश्रण और 4 प्लेट (192 नमूने और नियंत्रण) की सतह भर नमूना खींचता है। इस लोड करने की प्रक्रिया के बाद, हम वर्णन कैसे नमूने प्रवर्धित और एक मैक्रो स्प्रेडशीट कि एक मेज है कि एक मुद्रित पृष्ठ पर फिट बैठता है में प्रत्येक नमूना / लक्ष्य संयोजन के लिए 3 तकनीकी प्रतिकृति की औसत का सार का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं।
इस मंच का उपयोग कर नमूने से निकाले गए डीएनए और / या आरएनए का विश्लेषण करने के लिए एक समान विधि स्थापित किया गया था। नमूने का एक व्यापक विविधता, निकाले गए थे रिवर्स लिखित, और एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में पूर्व प्रवर्धित, त्रुटियों के लिए संभावित कम से कम। श्वसन नमूनों का परीक्षण नाक swabs, गहरी ग्रसनी swabs शामिल है,ट्रांस-सांस की नली washes, ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना, और फेफड़े के ऊतकों। एजेंटों का परीक्षण भी परिधीय रक्त या मल में मौजूद हो सकता है कुछ के बाद से, हम प्रक्रिया में नमूने के उन प्रकारों को शामिल किया। इस सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह अलग-अलग परीक्षण के स्थान पर पैनल आधारित रोगज़नक़ और विष जीन का पता लगाने के माध्यम से कुशल परीक्षण को सक्षम करने से कई प्लेटों में प्रयोगों चल रहा है की तुलना में समय और संसाधनों को बचाने में मदद करता है। श्वसन यहां प्रदर्शन पैनल 18 assays के प्रत्येक छेद के माध्यम से तीन प्रतियों में मुद्रित, प्रति प्लेट 48 नमूनों को समायोजित करने के लिए किया था। घोड़े का पता लगाया रोगजनकों घोड़े का एडीनोवायरस 1 और 2, घोड़े आर्टेराईटिस वायरस, घोड़े rhinitis वायरस ए और बी, घोड़े herpesvirus (EHV) प्रकार 1 और 4, और स्ट्रेप्टोकोकस सम शामिल थे। कुत्ते रोगजनकों कुत्ते सांस कोरोना (betacoronavirus), कुत्ते व्यथा वायरस, कुत्ते adenovirus, कुत्ते पैराइन्फ्लुएंज़ा वायरस, कुत्ते pneumovirus, Bordetella bronchiseptica, और माइकोप्लाज्मा cynos शामिल थे। एयूनिवर्सल इन्फ्लूएंजा एक परख और एक आंतरिक नियंत्रण (MS2 आरएनए फेज) भी शामिल थे।
यह प्रक्रिया छह महीने (प्रति सप्ताह 2-3 बार) के पाठ्यक्रम पर हमारी प्रयोगशाला में श्वसन रोगाणुओं की नियमित परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम भी एक अलग से अनुकूलित प्लेट पर मल के नमूने और बैक्टीरियल वियोजन में आंतों का रोगज़नक़ रूपरेखा के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर सफलता मिली है। एक बार जब प्लेटों का उत्पादन कर रहे हैं, अनुभवी स्टाफ एक मानक कार्यदिवस के भीतर 2-7 चरणों को पूरा कर सकते हैं। सबसे महत्वपूर्ण कदम preamp प्लेट के समुचित सील, प्लेटों के बीच preamplified नमूने के हस्तांतरण (जो तेजी से किया जाना चाहिए वाष्पीकरण को रोकने के लिए), और प्रवर्धन की थाली के अंतिम कवर कर रहे हैं। परिणाम विश्लेषण (नमूने और नियंत्रण के लिए घटता जाँच) के लिए एक गाइड के रूप में मैक्रो स्प्रेडशीट का उपयोग के रूप में यह बहुत समय और कागजी कार्रवाई इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक की मात्रा कम भी महत्वपूर्ण था। प्रदान की मैक्रो स्प्रेडशीट एक उदाहरण है; यह संशोधित किया जा करने के लिए या फिर से बनाया विभिन्न विन्यास के साथ प्लेटों के लिए की आवश्यकता होगी। यह आसानी से पीई हो सकता हैबुनियादी स्प्रेडशीट ज्ञान के साथ किसी के द्वारा rformed।
नमूने की बहुत छोटी राशि प्रवर्धन प्लेट (33 NL) पर लोड के कारण, पूर्व प्रवर्धन की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल (नहीं दिखाया गया है) के अनुकूलन में, हम मास्टर मिश्रण, यादृच्छिक प्राइमरों के अलावा, चक्रों की संख्या, annealing समय है, और कमजोर पड़ने प्रवर्धन करने से पहले सहित preamplification मानकों के एक नंबर की तुलना में। प्रत्येक लक्ष्य के लिए अपने स्वयं इष्टतम स्थितियों था, और यहाँ वर्णित उन उन है कि हमारे पैनल के लिए पता लगाने का सबसे अच्छा समग्र सीमा नहीं झुकेंगे प्रतिनिधित्व करते हैं। इस पैनल रोगजनक लक्ष्य और नमूना प्रकार है कि दिनचर्या पशु चिकित्सा नैदानिक परीक्षण में सामना कर रहे हैं की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल किया गया है, लेकिन preamplification प्रक्रियाओं के लिए संशोधन अलग पैनलों के लिए आवश्यक हो सकता है। निर्माता-अनुकूलित प्रवर्धन की स्थिति 95 डिग्री सेल्सियस और एन पर एक मानक की जांच के आधार पर वास्तविक समय पीसीआर एक 10 मिनट के साथ 95 डिग्री सेल्सियस एंजाइम सक्रियण पर प्रोटोकॉल विकृतीकरण के द्वारा पीछा के आधार पर कर रहे हैं60 डिग्री सेल्सियस पर ईलिंग / विस्तार। प्राइमरों और जांच पूर्व मुद्रित प्लेटों पर भी निर्माता-अनुकूलित शर्तों का उपयोग और इसलिए अनुमापन की आवश्यकता नहीं है। सभी नमूनों के लिए रिवर्स प्रतिलेखन और पूर्व प्रवर्धन कदम का मेल (चाहे लक्ष्य के प्रकार के) आदेश कार्यप्रवाह में दक्षता बनाए रखने के लिए जरूरी हो गया था। करने के बाद सभी नमूनों रिवर्स और लिखित भी संवेदनशीलता अधिकतम करने के लिए फायदेमंद है। इसके अलावा, preamp कि न्यूनतम करने अवरोधकों के लिए अनुकूलित है के लिए एक मास्टर मिश्रण का उपयोग एक ही थाली पर अलग नमूना प्रकार के संयोजन में बहुमुखी प्रतिभा की अनुमति देता है।
रोग नियंत्रण (सीडीसी) इन्फ्लूएंजा मैट्रिक्स परख nanoliter पैमाने प्रतिक्रियाओं के लिए शू एट अल। 7 से वर्णित है और यहाँ अनुकूलित के लिए केंद्र एक सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा एक परख है कि मनुष्य और साथी जानवरों से परीक्षण के लिए नमूने के लिए उपयुक्त है। यह सब इन्फ्लूएंजा वायरस के मैट्रिक्स जीन का पता लगाने के लिए सार्वभौमिक डिजाइन किया गया था microliter पैमाने वजह का उपयोग करctions। यह एक सीडीसी मानव इन्फ्लूएंजा वायरस पैनल और एक सीडीसी स्वाइन फ्लू पैनल के हिस्से के रूप में दुनिया भर में इस्तेमाल किया गया है। EHV-1 परख 8 यहाँ अनुकूलित घोड़ों कि गर्भपात और तंत्रिका संबंधी रोग (Pusterla और हसी 10 द्वारा समीक्षा) पैदा कर सकता का एक महत्वपूर्ण सांस रोगज़नक़ पता लगाता है। एक प्रजाति स्वतंत्र आंतरिक नियंत्रण के साथ एक उच्च throughput मंच करने के लिए इन परीक्षणों के अनुकूल ढालने का महत्व यह है कि वे एक OneHealth निगरानी दृष्टिकोण में शामिल किया जा सकता है। एक उच्च throughput परीक्षण मंच पर इन assays के दोनों होने नैदानिक सुविधाओं, घरों में, और प्रदर्शन की घटनाओं के लिए आपातकालीन तैयारियों की सुविधा होगी।
ऊपर वर्णित परिणाम माइकोप्लाज्मा cynos के अपवाद है, जो विश्लेषणात्मक प्रदर्शन में काफी अधिक विभिन्नता से पता चला है के साथ थाली पर सभी लक्ष्यों के प्रतिनिधि थे। इस उप इष्टतम पिघलने के तापमान (टी एम) प्राइमरों की है, जो आदर्श होना चाहिए 58-60 व के कारण होने की संभावना थी# 176; सी (आदर्श जांच टीएम 68-70 डिग्री सेल्सियस)। इस मंच की एक सीमा है कि यह लगता है अब अलग-अलग जांच, जो जल्दी से दृश्यों को संशोधित करने की क्षमता की सीमा से आदेश देने के लिए डिजाइन और प्लेटों का निर्माण है। सामान्य में वास्तविक समय पीसीआर की एक और सीमा उपन्यास या अप्रत्याशित रोगजनकों का पता लगाने में असमर्थता है। इस assays कि कई प्रजातियों में दृश्यों से मेल डिजाइनिंग से कुछ हद तक दूर कर सकते हो, लेकिन निष्पक्ष पूरे जीनोम अनुक्रमण आधारित तरीके उपन्यास एजेंटों की खोज के लिए अधिक अनुकूल हैं। 11,12
नेनो वास्तविक समय पीसीआर के लिए एक नए प्रतिमान की अनुमति देता है सिंड्रोम आधारित प्रजातियों आधारित परीक्षण है, जो उच्च throughput आणविक निदान में अभिकर्मक और श्रम लागत को कम करने के लिए उपयोगी है बजाय। इस दृष्टिकोण से बड़े पैमाने पर पैनल परीक्षण ऐसे ड्यूनी और Gurfield 13 और Moutailler एट अल। 14 द्वारा वर्णित उन लोगों के रूप OneHealth निगरानी के प्रयासों की सुविधा कर सकते हैं। झाड़ू के नमूनों का संग्रह जल्दी,आम तौर पर नैदानिक शुरू होने के 3 दिन के भीतर, श्वसन रोगाणुओं की उपस्थिति की पहचान करने के लिए सबसे अच्छा मौका प्रदान करता है। संक्रामक रोग उद्भव अक्सर अप्रत्याशित है, और परीक्षण है कि अभिकर्मकों के संशोधन के लिए आवश्यकता के बिना विभिन्न प्रजातियों पर किया जा सकता तैयारियों के लिए आदर्श होते हैं। इस प्रौद्योगिकी के भविष्य के अनुप्रयोगों pathotyping, रोगाणुरोधी प्रतिरोध रूपरेखा, और आगे सिंड्रोम आधारित नैदानिक नैदानिक पैनल में होने की संभावना है। नेनो वास्तविक समय पीसीआर तेजी, कई नमूना और रोगज़नक़ प्रकार के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए सबसे अधिक उपयोगी है, और नए और आकस्मिक रोगजनकों की पहचान करने के लिए निष्पक्ष या आंशिक रूप से पक्षपातपूर्ण अनुक्रमण आधारित दृष्टिकोण से पूरित किया जाएगा।
The authors have nothing to disclose.
यहाँ वर्णित श्वसन रोगज़नक़ assays पर काम कॉर्नेल पशु स्वास्थ्य डायग्नोस्टिक सेंटर के आंतरिक विकास निधियों द्वारा समर्थित किया गया। nanoscale पीसीआर कार्यप्रवाह और जुड़े गुणवत्ता आश्वासन प्रणाली का विकास आंशिक रूप से (FOA PA-13-244) वित्त पोषित है और अनुदान सं 1U18FD005144- के तहत खाद्य एवं औषधि प्रशासन के पशु चिकित्सा प्रयोगशाला जांच और उत्तर नेटवर्क (एफडीए डॉक्टर-LIRN) के सहयोग से प्रदर्शन किया गया था 01। प्रकाशन फीस VWR और क्वांटा बायोसाइंसेज द्वारा प्रायोजित किया गया। हम लिख रहे हैं और प्रोटोकॉल की समीक्षा करने के साथ उनकी सहायता के लिए गेबरियल Nickerson, रूपा वेणुगोपालन, Veldina Camo, Xiulin जांग, Jinzhi यू, Weihua वांग और कैटरीना वाकर धन्यवाद। हम लेखक साक्षात्कार फिल्माने के लिए माइक कैरोल धन्यवाद। हम अंत में उनके सहायक टिप्पणियों के लिए संपादक और तीन गुमनाम सहकर्मी समीक्षक धन्यवाद।
Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |