Høy gjennomstrømming testing av DNA og RNA baserte patogener av nanoskala PCR er beskrevet ved hjelp av et syndrom hund og hest luft PCR panel.
Nanoliter skala real-time PCR benytter romlige multipleksing for å tillate flere analyser som skal kjøres i parallell på en enkelt plate uten de typiske ulemper ved å kombinere reaksjonene sammen. Vi utviklet og evaluert et panel basert på dette prinsippet for å raskt identifisere tilstedeværelsen av felles smittestoffer hos hunder og hester med akutt luftveissykdom. Dette manuskriptet beskriver en nanoskala diagnostisk PCR arbeidsflyt for prøveopparbeidelse, forsterkning, og analyse av målpatogenet sekvenser, med fokus på prosedyrer som er forskjellige fra mikroliter skala reaksjoner. I luftpanelet presentert, ble 18-analyser hvert satt opp i tre eksemplarer, med plass til 48 prøver per plate. En universell utvinning og pre-forsterkning arbeidsflyt var optimalisert for høy gjennomstrømming prøveopparbeidelse for å romme flere matriser og DNA og RNA baserte patogener. Representative data presenteres for en RNA mål (Influensa A matrisen) og en DNA-mål (equine herpesvirus1). Evnen til å raskt og nøyaktig test for en omfattende, syndrom-baserte gruppen av patogener er et verdifullt verktøy for effektivisering og ergonomi diagnostisk testing og for akutt luftveissykdom diagnostikk og behandling.
Med behov for rask og omfattende påvisning av multiple midler i klinisk diagnostikk for mennesker og dyr, enkelt-organisme molekylære diagnostiske metoder for deteksjon av patogen er byrde med mindre det brukes for et stort antall prøver blir testet for en enkelt sykdom. I veterinærsammenheng, high-throughput diagnostiske metoder er spesielt viktig på grunn av den ytterligere behovet for å dekke patogener fra en rekke arter. OneHealth tilnærminger for håndtering av matbåren sykdom og nye patogen overvåking er eksempler på testing behov som inkluderer en rekke bakterier, virus (DNA eller RNA-basert), parasitter og sopp. Utfordringen for å kombinere tester for flere analytter sammen (multipleksing) for å forbedre effektiviteten testing er et mulig tap av følsomhet og en stor byrde for optimalisering og validering av analyser.
Nanoliter skala real-time polymerase chain reaction (PCR) er en alternative til praksisen med multipleksing som gjør at mange separate reaksjoner å kjøre samtidig på samme prøve en. Den OpenArray plattformen er en anvendelse av dette prinsippet to; den kombinerer mikromatriseteknologi med real-time PCR. Basert på konseptet av romlig multipleksing, hver testede prøve for et stort antall av mål i separate gjennomgående hull. Denne plattformen ble opprinnelig brukt med cyanin-baserte dobbeltkjedet DNA-bindende kjemi 2 og er nå tilgjengelige for probe-basert kjemi ved hjelp av mørke slukke prober 3. Denne plattformen har først og fremst blitt brukt til genetisk profilering hos mennesker 4 og dyr 5. Det ble nylig tilpasset til å detektere blodbårne DNA- og RNA-patogener ved Grigorenko et al. 6 ved bruk av en to-trinns revers-transkripsjon / pre-amplifikasjon (forforsterker) prosedyre.
Vi beskriver her en ett-trinns preamp-basert prosedyre for deteksjon av begge typer patogener i luft sekretions og en rekke andre prøvetyper som kan utføres helt i en standard arbeidsdag. Ved fullføring av ett-trinns-forforsterker, blir prøver overført til en 384-brønners plate, som er formatet akseptert av automatisert væskehåndteringssystemet som følger med denne nanoskala PCR plattformen. Systemet tegner konsentrat-blanding og prøve over overflaten på opptil fire plater (192 prøver og kontroller) på en gang. Etter dette lasting prosessen, beskriver vi hvordan prøvene er forsterket og analysert ved hjelp av en makro regneark som oppsummerer gjennomsnittet av 3 tekniske replikater for hver prøve / target kombinasjon i en tabell som passer på en trykt side.
En enhetlig fremgangsmåte for analyse av ekstraherte DNA og / eller RNA fra prøver ved å bruke denne plattformen ble etablert. Et bredt utvalg av prøver ble ekstrahert, revers transkribert, og pre-amplifisert i en 96-brønners-formatet, noe som minsker mulighetene for feil. Luftveis prøvene testet inkludert nasale vattpinner, dype svelg vattpinner,trans-tracheal vasker, bronchoalveolar kylling og lungevev. Siden noen av de testede midler kan også være tilstede i perifert blod eller avføring, innlemmet vi de typer av prøvene inn i prosedyren. Denne strømlinjeformet arbeidsflyt sparer tid og ressurser i forhold til å kjøre eksperimenter i flere plater ved å muliggjøre effektiv testing gjennom patogen og toksin genetisk testing panel-basert i stedet for individuell testing. Det luft panel demonstrert her hadde 18 analyser hvert trykt i tre eksemplarer gjennom-hull, med plass til 48 prøver per plate. Equine patogener oppdages inkludert hest adenovirus 1 og 2, hestearteritt-virus, hest rhinitt virus A og B, equine herpesvirus (EHV) type 1 og 4, og Streptococcus equi. Canine patogener inkludert canine respiratorisk corona (betacoronavirus), valpesykevirus, adenovirus, canine parainfluensavirus, canine pneumovirus, Bordetella bronchiseptica, og Mycoplasma cynos. ENuniversell influensa A-analyse og en intern kontroll (MS2 RNA-fag) ble også inkludert.
Denne prosedyren har vært brukt for rutinemessig testing av åndedretts patogener i vårt laboratorium i løpet av seks måneder (2-3 ganger per uke). Vi har også hatt suksess ved anvendelse av samme prosedyre for profilering enteriske patogen i fekale prøver og bakterieisolater på en særskilt tilpasset plate. Når platene er produsert, kan erfarne medarbeidere fullføre trinn 2-7 i løpet av en standard arbeidsdag. De mest kritiske trinn er et riktig tetning av forforsterkeren plate, overføring av preamplified prøver mellom platene (som må gjøres raskt for å forhindre fordampning), og den endelige dekning av forsterkningsplaten. Bruk av makroarket som en guide for resultatanalyse (sjekke kurvene for prøver og kontroller) var også kritisk som det sterkt redusert mengden av tid og papirene som trengs for denne prosessen. Den angitte makroarket er et eksempel; det må endres eller re-laget for plater med forskjellige konfigurasjoner. Dette kan lett bli performed av noen med grunnleggende regneark kunnskap.
På grunn av den meget lille mengden av prøven applisert på forsterkningsplaten (33 nl) blir pre-forsterkning kreves. Ved optimalisering av denne protokoll (ikke vist), sammenlignet vi en rekke parametere inkludert Preamplification den konsentrat-blanding, tilsetning av tilfeldige primere, antall sykluser, annealing tid, og fortynning før amplifikasjon. Hvert mål hadde sin egen optimale forhold, og de som er beskrevet her representerer de som ga det beste deteksjonsgrensen samlet for vårt panel. Dette panelet dekker et bredt spekter av sykdomsfremkallende mål og prøvetyper som er oppstått i rutine veterinær diagnostiske tester, men modifikasjoner på preamplification prosedyrer kan være nødvendig for forskjellige paneler. Produsenten-optimalisert amplifikasjonsbetingelser er basert på et standard sonde-baserte real-time PCR protokoll med en 10 min ved 95 ° C enzymaktivering, etterfulgt av denaturering ved 95 ° C og annealing / forlengelse ved 60 ° C. De primere og prober er forhåndstrykt på platene også bruker produsent optimalisert forhold og derfor ikke krever titrering. Ved å kombinere de revers-transkripsjon og pre-forsterkertrinn for alle prøver (uten hensyn til hvilken type mål) var nødvendig for å opprettholde effektiviteten i arbeidsflyten. Etter å ha alle prøvene reverstranskribert er også gunstig for å maksimere følsomheten. Videre gir bruk av en masterblanding for en forforsterker som er optimalisert for å minimalisere inhibitorer fleksibilitet i å kombinere forskjellige prøvetyper på samme plate.
The Center for Disease Control (CDC) influensa matrise analysen beskrevet av Shu et al. 7 og tilpasset her for nanoliter skala reaksjoner er en universell influensa A-analysen som er egnet for testing prøver fra mennesker og selskapsdyr. Det er designet for universell deteksjon av matrisen genet av alle influensa A-virus ved hjelp av mikroliter skala reactions. Det har blitt brukt over hele verden som en del av en CDC menneskelig influensavirus Panel og en CDC Swine Flu Panel. Den EHV-1-analysen åtte tilpasset her oppdager en viktig respirasjonspatogenet av hester som kan forårsake aborter og nevrologisk sykdom (gjennomgått av Pusterla og Hussey 10). Betydningen av å tilpasse disse testene til en high-throughput-plattform med et arts uavhengig intern kontroll er at de kan bli inkorporert i en OneHealth overvåking tilnærming. Å ha begge disse analysene på en høy gjennomstrømming testing plattform vil lette beredskap for kliniske anlegg, tilfluktsrom og performance events.
Resultatene som er beskrevet ovenfor var representative for alle målene på plate med unntak av Mycoplasma cynos, som viste betydelig mer variasjon i analytiske resultater. Dette var sannsynligvis på grunn av sub-optimale smeltetemperatur (T m) av primerne, som bør ideelt sett være 58-60 &# 176, C (ideelt sonde Tm er 68-70 ° C). En begrensning av denne plattformen er at det tar lengre tid å designe og produsere platene enn for bestilling av individuelle sonder, som begrenser muligheten til å raskt endre sekvenser. En annen begrensning av real-time PCR generelt er manglende evne til å oppdage nye eller uventede patogener. Dette kan overvinnes i en viss utstrekning ved å utforme analyser som svarer til sekvenser i flere arter, men objektive hele genomet sekvense baserte metoder er mer egnet for oppdagelse av nye midler. 11,12
Nanoskala real-time PCR gjør et nytt paradigme for syndrom basert snarere enn artsbasert testing, noe som er nyttig for å redusere reagenvolumer og lønnskostnadene i high-throughput molekylær diagnostikk. Storskala panel testing av denne tilnærming kan lette OneHealth overvåkings forsøk slik som de som er beskrevet av Dunne og Gurfield 13 og Moutailler et al., 14. Innsamling av penselprøver tidlig,vanligvis innen 3 dager etter klinisk utbruddet, gir den beste muligheten for å identifisere tilstedeværelsen av respiratoriske patogener. Infeksjonssykdom veksten er ofte uforutsigbar, og tester som kan utføres på forskjellige arter uten behov for endring av reagenser er ideelle for beredskap. Fremtidige anvendelser av denne teknologi er sannsynlig å være i pathotyping, antibiotikaresistens profilering, og ytterligere syndrom-baserte diagnostiske paneler. Nanoskala real-time PCR er mest nyttig for rask, high-throughput screening av flere prøve og patogen typer, og vil bli supplert med deg eller delvis partisk sekvensebaserte tilnærminger for å identifisere nye og emergent patogener.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet med luftveis patogen analysene beskrevet her ble støttet av Cornell Animal Health diagnostisk senter intern utviklingsmidler. Utvikling av nanoskala PCR arbeidsflyt og tilknyttede kvalitetssikringssystemer ble delvis finansiert (FOA PA-13-244) og utføres i samarbeid med Food and Drug Administration Veterinær Laboratory Investigation og Response Network (FDA Vet-LIRN) under Grant No. 1U18FD005144- 01. Publikasjonen avgifter ble sponset av VWR og Quanta biovitenskap. Vi takker Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang, og Katrina Walker for deres hjelp med å skrive og gjennomgang av protokollen. Vi takker Mike Carroll for filming forfatteren intervjuer. Vi endelig takke redaktøren og tre anonyme peer lesere for nyttige kommentarer.
Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |