Hög genomströmning testning av DNA och RNA baserade patogener av nano PCR beskrivs med en synd hund och häst andnings PCR panel.
Nanoliterskala realtids-PCR använder spatial multiplexing så att flera analyser för att köras parallellt på en enda platta utan de typiska nackdelarna med att kombinera reaktioner tillsammans. Vi designade och utvärderade en panel baserad på denna princip att snabbt identifiera närvaron av vanliga smittämnen hos hundar och hästar med akut respiratorisk sjukdom. Detta manuskript beskriver en nanoskala diagnostisk PCR arbetsflöde för provberedning, förstärkning och analys av mål patogener sekvenser, med fokus på rutiner som skiljer sig från mikroliter skala reaktioner. I andnings panelen presenteras, har 18 analyser varje uppsättning i tre exemplar, som rymmer upp till 48 prover per platta. En universell extraktion och pre-förstärkning arbetsflöde var optimerad för hög genomströmning provberedning för att rymma flera matriser och DNA- och RNA-baserade patogener. Representativa data presenteras för en RNA-mål (influensa A matris) och en DNA-mål (häst-herpesvirus1). Förmågan att snabbt och noggrant testa en omfattande, syndrom-baserad grupp av patogener är ett värdefullt verktyg för att förbättra effektiviteten och ergonomi diagnostiska tester och för acute respiratory diagnos och sjukdomsbehandling.
Med efterfrågan på snabb och omfattande upptäckt av flera agenter i klinisk diagnostik för människor och djur, en enda organism molecular diagnostiska metoder för detektion av patogener är betungande inte används för ett stort antal prover som testas för en enda sjukdom. Inom veterinär sammanhang, hög genomströmning diagnostiska metoder är särskilt viktig på grund av ytterligare behov för att täcka patogener från en mängd olika arter. OneHealth metoder för hantering av livsmedelsburna sjukdomar och nya övervakning patogen är exempel på testbehov som inkluderar ett antal bakterier, virus (DNA eller RNA-baserade), parasiter och svampar. Utmaningen att kombinera test för multipla analyter tillsammans (multiplexering) i syfte att förbättra testernas effektivitet är en möjlig förlust av känslighet och en stor börda för optimering och validering av analyser.
Nanoliterskala i realtid polymeraskedjereaktion (PCR) är ett alternativ till den praxis som multiplexering som tillåter många separata reaktioner kan köras samtidigt på samma prov 1. Den OpenArray plattform är en tillämpning av denna princip två; den kombinerar microarray-teknik med realtids-PCR. Baserat på begreppet rymdmultiplexering, varje prov testades med avseende på ett stort antal mål i separat genomgående hål. Denna plattform användes ursprungligen med cyanin-baserade dubbelsträngade DNA-bindande kemi 2 och är nu tillgänglig för sondbaserad kemi med hjälp av mörka kylnings sonder 3. Denna plattform har främst använts för genetisk profilering hos människor 4 och djur 5. Det har nyligen anpassats för att detektera blodburna DNA- och RNA-patogener genom Grigorenko et al. 6 med användning av en omvänd-transkription / pre-amplifiering förfarande i två steg (preamp).
Vi beskriver här en en-stegs-förförstärkare baserad procedur för att detektera båda typerna av patogener i andnings sekretions och en mängd andra provtyper som kan utföras helt i en vanlig arbetsdag. Vid slutförandet av ett steg förförstärkare, prover överfördes till en 384-brunnar, som är formatet accepterats av automatiserade vätskehanteringssystem som kommer med denna nano PCR plattform. Systemet drar huvudblandning och prov tvärs över ytan på upp till fyra plattor (192 prover och kontroller) i taget. Efter denna laddningsprocessen, beskriver vi hur prover förstärks och analyseras med hjälp av ett makro kalkylblad som sammanfattar genomsnitt 3 tekniska replikat för varje prov / mål kombination i en tabell som passar på en sida.
En enhetlig metod för analys av extraherat DNA och / eller RNA från prover med användning av denna plattform etablerades. Ett stort antal olika prover extraherades, transkriberades omvänt, och pre-amplifierades i en 96-brunnsformat, vilket minimerar risken för fel. Respiratoriska prover testade ingår nasala svabbar, djupa svalg kompresser,trans-luftrör tvättar, lungsköljning och lungvävnad. Eftersom en del av de testade kan även vara närvarande i perifert blod eller avföring medel, inkorporeras vi dessa typer av prov in i förfarandet. Denna strömlinjeformade arbetsflöde hjälper till att spara tid och resurser jämfört med att köra experiment i flera plattor genom att möjliggöra effektiv testning genom panelbaserade patogen och toxin-gen upptäckt i stället för individuell prövning. Andnings panel visat här hade 18 analyser varje utskriven trefaldigt genomgående hål, som rymmer upp till 48 prover per platta. Häst patogener upptäckta ingår häst adenovirus 1 och 2, häst arterit virus, häst rinit virus A och B, häst-herpesvirus (EHV) typ 1 och 4, och Streptococcus equi. Hundens patogener ingår hund andningscorona (betacoronavirus), valpsjukevirus, hund adenovirus, hundparainfluensavirus, hund pneumovirus, Bordetella bronchiseptica och Mycoplasma cynos. enuniversellt influensa A-analys och en intern kontroll (MS2 RNA-fag) ingick också.
Detta förfarande har använts för rutintestning av respiratoriska patogener i vårt laboratorium under loppet av sex månader (2-3 gånger per vecka). Vi har också haft framgång med hjälp av samma procedur för enter patogen profilering i avföringsprov och bakterieisolat på en separat anpassad platta. När plattorna tillverkas, kan erfaren personal slutföra steg 2-7 i en standard arbetsdag. De mest kritiska stegen är korrekt tätning av förförstärkaren plattan, överföring av förförstärkta proverna mellan plattor (som måste göras snabbt för att förhindra avdunstning), och sluttäckning av förstärkningen plattan. Användning av makro kalkylblad som en guide för resultatanalys (kontroll kurvor för prover och kontroller) var också kritisk eftersom det kraftigt minskade tid och pappersarbete som krävs för denna process. Den angivna makro kalkylblad är ett exempel; det skulle behöva ändras eller återskapas för plattor med olika konfigurationer. Detta kan lätt bli performed av någon med grundläggande kalkyl kunskap.
På grund av den mycket lilla mängden av provet laddades på förstärkningsplattan (33 nl), är pre-amplifiering erfordras. I optimeringen av detta protokoll (icke visad), jämförde vi ett antal förförstärkning parametrar inklusive master mix, tillsats av slumpmässiga primrar, antal cykler, glödgningstid, och spädning före amplifiering. Varje mål hade sina egna optimala förhållanden, och de som beskrivs här representerar de som gav den bästa detektionsgränsen övergripande för vår panel. Denna panel täcker ett brett spektrum av patogena mål och provtyper som påträffas i rutin veterinär diagnostisk testning, men modifieringar av förförstärkning procedurer kan vara nödvändiga för olika paneler. Tillverkaren optimerade amplifieringsbetingelser är baserade på en standardsondbaserad realtids-PCR-protokoll med en 10 min vid 95 ° C enzymaktivering, följt av denaturering vid 95 ° C och annEaling / förlängning vid 60 ° C. Primrarna och prober är förtryckta på plattorna också använder tillverkarens-optimerade betingelser och därför inte kräver titrering. Kombinera de omvända-transkriptions- och pre-amplifieringsstegen för alla prover (oberoende av vilken typ av mål) var nödvändigt för att bibehålla effektivitet i arbetsflödet. Med alla prover transkriberades omvänt är också fördelaktigt för att maximera känsligheten. Vidare användning av en huvudblandning för förförstärkaren som är optimerad för att minimera hämmare tillåter mångsidighet i att kombinera olika provtyper på samma platta.
Den Center for Disease Control (CDC) influensamatris analysen beskriven av et al. Shu 7 och anpassas här för nanoliterskala reaktioner är ett universellt influensa A analys som är lämplig för testning av prover från människor och sällskapsdjur. Den var avsedd för universell detektering av matrisen genen av alla influensa A-virus med hjälp av mikroliter skala reaTGÄRDER. Det har använts runt om i världen som en del av en CDC Human influensavirus panelen och en CDC svininfluensa Panelen. EHV-1-analys 8 anpassas här upptäcker en viktig andnings patogen av hästar som kan orsaka aborter och neurologiska sjukdomar (granskats av Pusterla och Hussey 10). Betydelsen av anpassning av dessa tester för att en hög genomströmning plattform med en art-oberoende intern kontroll är att de kan ingå i ett OneHealth övervakning tillvägagångssätt. Med båda dessa analyser på en hög genomströmning testning plattform underlättar beredskap för kliniska faciliteter, vindskydd och prestanda händelser.
De ovan beskrivna resultaten var representativa för alla målen på plattan med undantag av Mycoplasma cynos, som visade betydligt mer variation i analytisk prestanda. Detta var troligen på grund av den sub-optimala smälttemperaturen (Tm) av primrarna, som i idealfallet bör vara 58-60 &# 176; C (den ideala sonden Tm är 68-70 ° C). En begränsning av denna plattform är att det tar längre tid att konstruera och tillverka plattorna än för beställning individuella prober, vilket begränsar möjligheten att snabbt ändra sekvenser. En annan begränsning av realtids-PCR i allmänhet är oförmågan att detektera nya eller oväntade patogener. Detta kan övervinnas i viss utsträckning genom att utforma analyser som matchar sekvenser i flera arter, men objektiva hela genomet sekvensebaserade metoder är mer lämpade för upptäckten av nya medel. 11,12
Nanoskala realtids-PCR tillåter ett nytt paradigm för syndrom baserade snarare än arter baserad testning, vilket är användbart för att minska reagens och lönekostnader i hög genomströmning molekylär diagnostik. Storskalig panel testning med denna metod kan underlätta OneHealth övervakningsinsatser såsom de som beskrivs av Dunne och Gurfield 13 och Moutailler et al. 14. Insamling av pinnprov tidigt,i allmänhet inom 3 dagar kliniska utbrott, ger den bästa möjligheten att identifiera närvaron av luftvägspatogener. Infectious sjukdom uppkomst är ofta oförutsägbara, och tester som kan utföras på olika arter utan behov av modifiering av reagens är idealiska för beredskap. Framtida tillämpningar av denna teknik kommer sannolikt att vara i pathotyping, antibiotikaresistens profilering, och ytterligare syndrom baserade kliniska diagnostiska paneler. Nanoskala realtids-PCR är mest användbar för snabb, high-throughput screening av flera prov och patogena typer och skulle kompletteras med objektiva eller delvis förspända sekvensbaserade metoder för att identifiera nya och framväxande patogener.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet med andnings patogen analyser som beskrivits här stöddes av Cornell Animal Health Diagnostic Center interna utvecklingsmedel. Utveckling av nano PCR arbetsflöde och tillhörande kvalitetssäkringssystem delvis finansieras (FOA PA-13-244) och utförs i samarbete med Food and Drug Administration Veterinary Laboratory Investigation och Response Network (FDA Vet-LIRN) under Grant No. 1U18FD005144- 01. De publiceringsersättning var sponsrade av VWR och Quanta Biosciences. Vi tackar Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang, och Katrina Walker för deras hjälp med att skriva och granska protokollet. Vi tackar Mike Carroll för att filma författaren intervjuer. Vi tackar slutligen redaktör och tre anonyma expertgranskare för deras värdefulla synpunkter.
Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |