Tillverka en UV-Vis och Ramanspektroskopi immun Platform

Summary

Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.

Abstract

Immunanalyser används för att detektera proteiner som bygger på förekomsten av associerade antikroppar. På grund av deras omfattande användning inom forskning och kliniska miljöer, kan hittas en stor infrastruktur immun instrument och material. Till exempel, 96- och 384-brunnars polystyrenplattor är tillgängliga kommersiellt och har en standardkonstruktion för att rymma ultraviolett-synligt (UV-Vis) spektroskopi utrustning från olika tillverkare. Dessutom har ett brett utbud av immunoglobuliner, upptäckt taggar och blockerande medel för skräddarsydda immun konstruktioner såsom enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) finns tillgängliga.

Trots den befintliga infrastrukturen, gör standard ELISA kit inte uppfyller alla forskningsbehov, vilket kräver individualiserad immun utveckling, vilket kan vara dyrt och tidskrävande. Till exempel, ELISA kit har låg multiplexering (detektering av mer än en analyt i taget) kapacitet eftersom de vanligtvis är beroende av fluorescens eller colorimetric metoder för detektion. Colorimetric och fluorescensbaserade analyser har begränsad multiplexering kapacitet på grund av breda spektrala toppar. I kontrast, Raman-spektroskopi-baserade metoder har en mycket större kapacitet för multiplexering på grund av smala emissionstoppar. En annan fördel med Raman-spektroskopi är att Raman reportrar upplever betydligt mindre fotoblekning än fluorescerande taggar ^1. Trots de fördelar som Raman reportrar har över fluorescerande och kolorimetriska taggar till protokoll tillverka Raman-baserade immun är begränsade. Syftet med detta dokument är att tillhandahålla ett protokoll för att förbereda funktionaliserade prober för användning i samband med polystyrenplattor för direkt detektion av analyter genom UV-Vis analys och Raman-spektroskopi. Detta protokoll gör det möjligt för forskare att ta en gör-det-själv-strategi för framtida multianalytdetektering medan kapitalisera på förhand etablerad infrastruktur.

Introduction

Typiska sandwichimmun upptäcka indirekt närvaron av ett antigen med två antikroppar. Den infångande antikroppen är bunden till en fast yta och bildar ett antikropp-antigenkomplex när de är i närhet till en lämplig antigen. En detektionsantikropp införes därefter och binder till antigenet. Efter tvättning, är antikroppen / antigenet / antikroppskomplexet lämningar och detekteras av den märkta detektionsantikropp såsom visas i Figur 1A. Typiska detektering sker genom en fluorescerande eller kolorimetrisk detektor, vilket begränsar multiplexering till 10 analyter på grund av breda spektrala toppar ^2,3. I motsats, Raman-baserade system har mycket smalare emissionstoppar som resulterar i förbättrade multiplexering kapacitet med källor som hävdar samtidig detektion av upp till 100 analyter ^2,3.

Många litteraturkällor finns tillgängliga som täcker viktiga aspekter i samband med immunanalyser ^4-6 såsom steg-för-stegdetaljer för att skapa personliga ELISA-kit. Tyvärr är dessa protokoll är för fluorescerande eller kolorimetrisk detektering, vilket begränsar multiplexering förmåga anpassade immun. För att lösa detta behov, presenterar vi ett detaljerat förfarande för att tillverka UV-Vis / Raman immun tidigare ⁷ publicerats för en direkt immun som visas i figur 1B.

Detta protokoll omfattar tillverkning av funktionaliserad guldnanopartiklar baserade prober, som illustreras i figur 2. Förfarandet för att göra de Raman / UV-Vis prober börjar genom att binda Raman reportrar till ytan av guldnanopartiklar (AuNPs). De AuNPs därefter funktionaliseras med antikroppar som är associerade med polyetylenglykol (PEG). Återstående bindningsställen på de AuNPs blockeras genom bindning metoxipolyetylenglykol tiol (mPEG-SH) till AuNPs att förhindra efterföljande icke-specifik bindning under analysen. De framställda AuNP prober testas genom att binda till antigenerfixerad till brunnarna i en polystyren-platta, såsom visas i figur 1B. Vid tvättning av plattan, är AuNP prober detekteras med hjälp av UV-Vis-spektroskopi medan intresse Raman reportrar detekteras med Ramanspektroskopi. Kombinera UV-Vis och Raman spektraldata ger två analysmetoder, öka kapaciteten hos denna immun.

Protocol

1. Framställning av buffertar Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) Späd 50 ml 10x PBS med 450 ml HPLC-kvalitet vatten till en 1 x PBS koncentration. Sterilt filter av lösningen med ett 0,22 pm filter. Butikslösning vid rumstemperatur. Framställning av Tris saltlösning + Tween 20 (TBST) Späd 50 ml av 10x Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 450 ml av HPLC-kvalitet vatten till en 1x koncentration. Tillsätt 250 pl av Tween-20 f?…

Representative Results

I denna studie var 60 nm guldpartiklar som används för UV-Vis-spektroskopi. UV-Vis absorptionsspektra från 400 till 700 nm samlades in och toppområden för varje AuNP koncentration bestämdes med hjälp av en öppen källkod spektralanalys programvara 8. Före topp integration, det uppsamlade spektra gick baslinjekorrigering använder en trepunkts polynomanpassning. Toppytorna användes för att generera en logaritmisk kalibreringskurva såsom visas i fig 4. Det bör noteras att f…

Discussion

I den detaljerade protokoll, det finns flera kritiska punkter för att ta itu med. En fråga är valet av Raman reporter och guld nanopartiklar. Även protokollet skrevs anpassas för enskilt bruk, var Raman reporter DTTC används som ett exempel. DTTC är en positivt laddad reporter och binder till negativt laddade ytor såsom citrat utjämnade AuNPs. Detta protokoll kan anpassas för negativt laddade reportrar med hjälp av guldnanopartiklar med en positiv ytladdning. Till exempel, polyetylenimin (PEI) utjämnade AuNP…

Materials

60nm Gold Nanoparticle	Ted Pella, Inc.	15708-6	These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Methanol	Pharmco-Aaper	339000000
Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5	Scy Tek	TBD999
Bottle Top Filtration Unit	VWR	97066-202
Tween 20 (polysorbate 20)	Scy Tek	TWN500	Used as an emulsifying agent for washing steps.
Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4	Scy Tek	PBD999
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf Tubes	22431102	LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf Tubes	22431064	LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Microplate Devices UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	Used for sealing and storing functionalized plates.
Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom	Costar	3370
HPLC grade water	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Raman reporter
mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA has an NHS end.
Mouse IgG, Whole Molecule Control	Thermo Fisher Scientific	31903	Antigen
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	31164	Antibody
Human Serum Albumin Blocking Solution	Sigma Aldrich	A1887-1G	Bovine serum albumin can be used instead.
In-house built 785nm inverted Raman microscope unit	N/A	N/A	An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used.
Mini Centrifuge	Fisher Schientific	12-006-900
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000c
UV-Vis Spectrophotometer	BioTek	Synergy 2
Desalting Columns	Thermor Scientific	87766