Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

SILAC basert proteomikk Karakterisering av Exosomes fra HIV-1 infiserte celler

Published: March 3, 2017 doi: 10.3791/54799
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 3
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

Summary

Her beskriver vi en kvantitativ proteomikk metode ved hjelp av teknikken av stabile isotoper merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) for å analysere virkningene av HIV-1-infeksjon på verten exosomal proteom. Denne protokollen kan enkelt tilpasses til cellene under ulike stress eller smitteforhold.

Introduction

Mange menneskelige sykdommer, innbefattende virusinfeksjoner, er ofte forbundet med karakteristiske cellulære prosesser som finner sted i og rundt de berørte celler. Proteiner, ofte fungerer som den ultimate mobile effektbokser, megle disse prosessene. Analyse av proteiner ofte kan gi uvurderlig informasjon om det lokale miljøet av syke cellene og hjelpe oss til å forstå den underliggende mekanismen av sykdom patogenesen. Blant ulike protein analyseteknikker, proteomikk har særlig store løftet. Som et kraftig, stor-skala-verktøyet, kan proteomforskning tilveiebringe en systemisk forståelse av cellulære prosesser, spesielt i området av funksjon og interaksjonen av proteiner. Analysere spesifikke proteiner er gjort enklere gjennom utvikling av merkingsteknikker, som tillater forskere for å overvåke ekspresjon av cellulære komponenter, spesielt proteiner, i stedet for undersøkelsen. Selv om mange proteomikk analyser har blitt utført på celleproteom skala, proteomikk characterizations på subcellulære avdelinger har vist seg å være spesielt informativ en. Dette eksemplifiseres godt i studiene av HIV-1-infeksjon.

Exosomes, 30-100 nm membranvesikler utskilt av et bredt spekter av celletyper 2, 3, er kritiske komponenter av intercellulær kommunikasjon og molekylære transport. De ble tidligere funnet å spille viktige roller i HIV-1 spirende prosess 4, 5. Ved å kombinere proteomikk analyse med funksjonelle disseksjon, fant vi at exosomes frigjøres fra HIV-1-infiserte celler består av en unik og kvantitativt forskjellige protein signatur og havne regulatoriske molekyler som påvirker celleegenskaper på nabo mottakelige celler, inkludert cellulær apoptose og proliferasjon 6. Metodene er beskrevet i denne protokoll,nemlig SILAC (stabil isotop merking av aminosyrer i cellekultur) 7 basert proteomikk karakterisering av exosomes fra HIV-1-infiserte celler. Lignende metoder kan anvendes for å bedre forstå andre subcellulære kamrene under patogenesen ved å justere den eksperimentelle spenning til den spesifikke rommet eller fraksjon av interesse, og å gjøre nødvendige endringer i de beskrevne fremgangsmåter.

Gitt den siste utviklingen av kvantitative proteomikk metoder, er det mange å velge mellom når du velger den mest effektive metoden for et bestemt eksperiment. Blant disse er den kjemiske-baserte iTRAQ (isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering) 8 og etiketten frie MRM (multiple reaksjon overvåking) 9 teknikker. Begge metodene er kraftige verktøy, og er gode valg for bestemte innstillinger. For en typisk laboratorie hovedsakelig arbeider med cellelinjer, men disse to metodene har relatively høyere kostnader og er mer tidkrevende sammenlignet med den SILAC basert metode. SILAC er en metabolsk merking basert teknikk som omfatter ikke-radioaktive isotopiske former av aminosyrer fra kulturmediet til cellulære proteiner. Vanligvis SILAC eksperimenter starte med to cellepopulasjoner, for eksempel, infiserte og uinfiserte. Hver er forskjellig merket i sin bestemt isotop-miljøet før full merking er oppnådd. De merkede exosomes av disse cellene blir deretter utsatt for proteinekstraksjon. Når ekstraheres, de merkede exosomal proteiner blir analysert ved hjelp av væskekromatografi tandem massespektroskopi 10. Til slutt blir de massespektrometri resultater og betydelig merkede proteiner underkastet statistisk og bioinformatikk analyser, samt streng biokjemisk verifisering. Våre tidligere undersøkende rapporter tyder på at de SILAC / exosome prosedyrer er mer hensiktsmessig for cellelinjer enn primærceller, som cellelinjer er vanligvis i enaktiv prolifererende tilstand for effektiv isotopisk merking,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur og HIV-1-infeksjon

MERK: Før du starter eksperimenter, anbefales det å sjekke cellenes levedyktighet gjennom trypanblått farging 11 og deres spredning gjennom en MTT-analyse 12. Det er også viktig å bruke nypreparerte SILAC medium. Forskjellige cellelinjer kan anvendes, så lenge de er i en aktiv proliferativ fase, og er utsatt for HIV-1-infeksjon, eller testbetingelse av valget. I denne protokollen, bruker H9 cellelinje som eksempel.

  1. Seed 2 x 10 6 H9 celler i hver celle kultur kolbe. Dyrke en gruppe i 10 ml merket RPMI 1640 medium inneholdende 10% dialysert føtalt bovint serum (FBS), 100 mg / l 13 C 6 L-lysin og 100 mg / l 13 C 6 15 N 4 L-arginin. Vokser den andre gruppen i 10 ml umerket RPMI 1640 medium med 10% dialysert FBS, 100 mg / L L-lysin og 100 mg / l L-Arginin.
  2. Dyrke cellene i seks doblinger ved hvilket punkt proteinene av cellene i merkede medium er praktisk talt fullstendig merket (> 99%) med tunge aminosyrer. Legg friske media eller endre media regelmessig (hver 1-3 dager, avhengig av hvilken type celle. For H9 celle, endre mellom hver 3 dager). Ved slutten av merking, øke kulturvolum (for eksempel ~ 30 ml) for å få plass til veksten av flere celler.
    MERK: bestemme nøyaktig celle doblingstiden ved begynnelsen av eksperimentet via Trypan blå farging og celletelling.
  3. Infisere de merkede celler med HIV-1 NL4-3 ved hjelp av standard HIV-1-infeksjon protokoll 13 i 48 timer. Inkuber cellene med passende mengder av virus med en infeksjonsmultiplisitet (MOI) rundt 0,3. Sjekk HIV-1-infeksjon ved p24 kvantifisering av kultursupernatantene ved hjelp av en HIV-1 p24-antigen ELISA kit. Utfør en immunfluorescens analyse 14 for å bekrefte vellykket infeksjon av celler. Keep vokser de umerkede celler i umerket medium uten HIV-1-infeksjon.
  4. Høste supernatantene fra begge grupper ved slutten av infeksjon (trinn 2.1).

2. Exosome Isolation

MERK: Gjennom en serie av ultra-sentrifugeringstrinn, er exosomal fraksjoner fra kultursupernatantene beriket 15. Utføre alle følgende trinn ved 4 ° C, med en ultrasentrifuge rotor som kan nå en hastighet på minst 100 000 x g.

  1. Samle supernatantene av kulturene i 50 ml koniske rør, unngå celler. Sentrifuger dem i 10 minutter ved 300 xg for å fjerne gjenværende celler.
  2. Samle supernatantene i nye 50 ml koniske rør og sentrifuger dem i 10 minutter ved 2000 x g for å fjerne døde celler. Overføring resulterende supernatanter til kommersielle rotor-kompatible rør som er i stand til å motstå ultrasentrifugering.
  3. Sørg for å balansere ultrasentrifuge rør. Sentrifugere rørene i 30 minutter ved 10.000 xg for å fjernecelleavfall.
  4. Samle supernatantene i ultrasentrifuge-rør og sentrifuger i 70 minutter ved 100 000 x g. Kast supernatantene.
  5. Resuspender exosome-rike pellets i 5 ml frisk PBS. Overfør løsninger for å friske ultrasentrifuge-rør og sentrifuger på nytt i 70 minutter ved 100.000 x g.
  6. Kast supernatants. For å lagre exosomes langsiktig, resuspendere pellets i 50 mL PBS og oppbevar ved -80 ° C. Alternativt, gå direkte til protein utvinning som vist nedenfor.

3. Protein Extraction og klargjøring

  1. Løs opp isolerte exosomal pellets i 100-200 mL RIPA lyse og utvinning buffer med ekstra proteasehemmer cocktails. Bufferen er sammensatt av 25 mM Tris-hydroklorid, 150 mM natriumklorid, 1% NP-40, 1% natriumdeoksykolat, og 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat), ved pH 7,6. Den protease inhibitor cocktail bør inneholde en rekke proteaseinhibitorer, så som aprotinin, bestatin, leupeptin, pepstatin A og EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), som kan hemme et komplett utvalg av proteaser.
  2. Sentrifuger de oppløste løsninger for 10 minutter ved 13 000 xg (4 ° C), og overfører de tømte supernatantene til nye 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  3. Kvantifisere protein konsentrasjon av hver prøve av exosomes ved hjelp bicinchoninic syre (BCA) eller Bradford assay 16.
  4. Blande en lik mengde av proteiner (2 ug) fra merkede og umerkede prøver og kjøre lik blanding på en 4-20% SDS-PAGE-gel ved 120 mA / 200 V i 30 minutter.
  5. Stain gel med Coomassie blå fulgt av avfarging 17.
  6. Ved hjelp av et barberblad, kutt prøven kjørefelt fra gelen. Deretter kuttet gelen kjørefelt i 10-15 like store emner. Sette hvert stykke inn i en frisk 1,5 ml mikrosentrifugerør i totalt 10-15 rør.
  7. Fordyp kuber i 25 mM NH 4 HCO 3 i 50% acetonitril, vortex, og kast supernatanten. Gjenta to ganger. Tørkekuber i et vakuum konsentrator 18, 19.
  8. Rehydrere kuber med 10 mM ditiotreitol (DTT), vortex, og kort sentrifugering. Inkuber ved 56 ° C i 1 time. Kast supernatant.
  9. Fordyp gel kuber i 55 mM iodoacetamide, vortex, og spinn. Inkuber ved romtemperatur i mørke i 45 min. Kast supernatant.
  10. Fordyp kuber i 25 mM NH 4 HCO 3, vortex, spinn, og kast supernatanten.
  11. Fordyp kuber i 25 mM NH 4 HCO 3 i 50% acetonitril, vortex, og spinn. Gjenta 3.9 og 3.10.
  12. Tørk kuber i et vakuum konsentrator. Legg 25 ul sekvense karakter modifisert trypsin i 25 mM NH 4 HCO 3, inkuber ved 4 ° C i 30 minutter, og kast det overskytende oppløsning. Dyppe kuber i 25 mM NH 4 HCO 3 uten trypsin, og inkuber over natten ved 37 ° C.
  13. I korthet spinne kuber ned og overføre det resulterende peptid ekstract til et nytt rør. Tilsett 30 pl av 5% maursyre i 50% acetonitril til kuber, vortex i 30 min og sentrifugering. Kombiner supernatanten med ekstraktet. Tørk peptid ekstraktene med en vakuum-konsentrator til mindre enn 5 ul.
  14. Sende inn prøver til massespektrometri kjernefasilitet for LC-MS / MS-analyse. MS analyse av data, som kan genereres fra åpen kildekode, omfatter vanligvis et tilgangsnummer for hvert protein identifisert, merket / umerket forhold og antall unike peptider identifisert.

4. Western Blotting Verification

MERK: Western blotting anbefales å verifisere massespektrometri resultater.

  1. Følg standard western blotting protokoller og sikre at like mengder protein fra hver gruppe er lastet. Bruk antistoffer mot proteiner av interesse (f.eks annexin A5, laktat dehydrogenase B kjede) identifisert ved MS. Western blotting deteksjon, sammen med densitometry analyseverktøs, kan bekrefte at MS protein identifikasjon og kvantifisering er riktige.

5. proteomikk Data Analysis

MERK: Datakvaliteten vurdering, data forbehandling, beregning og fastsettelse av betydelige protein kandidater er gjort separat for hver MS replikere. Når ovenstående analyser er fullført, blir de analyserte data fra replikater sammenlignes og kombineres 6, 20, 21.

  1. Vurdere kvaliteten på MS data.
    1. Først log2 forvandle SILAC-MS merket / umerkede prosenter av kvantifiseres proteiner i et regnearkprogram.
    2. I vitenskapelige grafer og statistisk programvare, gruppere forhold til 40-100 forholdet hyller og plotte antall prosenter per bin å generere et histogram. En normal fordeling av histogram indikerer god kvalitet på MS data 6. Gjør dette trinnet for alle MS gjentak.
  2. For å øke tilliten og nøyaktigheten av MS peptid forholdstall, vurdere å fjerne proteiner som har mindre enn to kvantifiserte peptider.
  3. For å finne ut betydelig opp- og ned-regulert protein kandidater, bruker du følgende fremgangsmåte for å beregne betydningen terskler 22.
    1. I vitenskapelige grafer og statistisk programvare, generere en ikke-lineær regresjon eller kurvetilpasning til frekvensfordelingsdata. Dette trinnet gir verdier som kan brukes til å beregne cutoff-verdier. Beregn cut-off verdier som median ± 1,96 σ for 95% konfidensintervall eller 2,56 σ for 99% konfidensintervall.
      MERK: Spesifikke detaljer om beregning av tidsavgrensninger kan bli funnet på Emmott et al. 22.
    2. Velg protein kandidater som forholdstall er enten større enn 1,96 (eller 2,56) standardavvik over median (betydelig over uttrykt) eller lavere enn 1,96 (eller 2,56) standardavvik under median (betydelig under uttrykt).
  4. Sammenlign replikater av de oven identifiserte vesentlige kandidater til å oppnå konsistens. Sørg for at de oppfyller følgende kriterier for å passere denne endelige valget trinnet: kandidatene må være konsekvent identifisert i alle replikatene; og replikater av en kandidat må være konsekvent i deres retning av regulering (helst minst 2 av 3 replikater av en kandidat bør enten være oppregulert eller nedregulert).
  5. Ferdig data for kandidater som oppfyller de ovennevnte kriterier ved å slå sammen sine gjentak data.

6. Bioinformatikk Verifikasjon og karakterisering

MERK: Eksisterende genomisk og bioinformatiske informasjon tilbyr et vell av informasjon for nesten alle protein. Data mining og bioinformatikk analyse på at informasjonen kan hjelpe i å få en god del innsikt i eiendommen og funksjoner av de betydelige kandidater. dette behss er vanligvis nødvendig å utforme riktige nedstrøms wet-lab eksperimenter.

  1. Å benytte seg av GenBank tiltredelses tall eller Uniprot IDer, søker kandidater mot dagens exosome databaser (Exocarta 23, Evpedia 24) for å kontrollere at kandidat proteiner har tidligere blitt funnet i exosome. Dette trinnet legger et lag av tillit til at kandidatene er faktisk i exosomes.
    1. Tilgang http://www.exocarta.org/, klikk på "Query" og innspill enten genet eller proteinet navn / sjonsnummer. En oppsummering siden vises og bevisene i exosome vil bli vist om dersom det er noen.
  2. Søk kandidatene mot HIV-1 og Human Protein Interaksjon Database 25. Du kan også søke på spesifikke databaser som kan gi informasjon om samspillet mellom kandidat proteiner og testen tilstand.
    1. Tilgang til databasen ved www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteraksjoner. På "protein domenenavn 'oppføring, skriv kandidatnavnene eller deponeringsnummer, og klikk på søk. Søkeresultatene kan gi innsikt i samspillet mellom HIV-1 og protein kandidater, og foreslå hvilke av kandidatene kan være virkelig HIV-1 assosiert.
  3. Import GenBank tiltredelses tall eller Uniprot IDer av kandidatene til GO analyse programvare (for eksempel FunRich, Functional Enrichment analyseverktøy 26) og kjøre programvaren.
    1. Last ned programvaren på http://www.funrich.org/. Etter installasjon, åpne programvaren under berikelse analyse, klikk på "Legg Data Set", og laste opp en liste av protein / gener. Deretter velger diagramtype for å visualisere GO analyse.
      MERK: GO analyseresultater vil bli visualisert i form av sektordiagrammer. Dette trinnet hjelper oss til å få global innsikt knyttet til kandidater innen områdene biologisk prosess (BP), Cellular Komponent (CC), og molekylær funksjon (MF).
  4. Tilgang DAVID på http://david.ncifcrf.gov/ 27, klikk på "Functional merknad verktøyet" på sin hjemmeside. Skriv inn kandidatlisten, velger du "Identifier" av genet som "Uniprot ID", velg "Gene List" og søk. De beriket GO vilkår, p-verdier og andre parametere kan finnes ved å klikke på "Merknads Oppsummering Resultater" side under kategorien "Gene_Ontology".
  5. For å undersøke mulige interaksjoner av kandidatene med andre proteiner, bruke åpent tilgjengelig STRING database 28 å belyse potensielle protein-protein interaksjoner og mulige biokjemiske mekanismer.
    MERK: GO Analyse og Funksjonell Merknad (avsnitt 6.3 til 6.4) kan også utføres ved hjelp av den nyeste STRING programvare.
    1. Tilgang til databasen ved http://string-db.org/. Input proteinet ID eller sekvens i de utpekte sØk ved boksen og velger riktige arter for analyse. Klikk "Søk". Resultatene vil gi informasjon om både direkte (fysiske) og indirekte (funksjonelle) assosiasjoner. De ti kjente kamper for exosomal kandidaten vil bli vist, og bør vurderes for betydelig kandidat valg.
      MERK: En stor del av informasjon knyttet til kandidatene kan analyseres ved hjelp av trinnene ovenfor. De mest betydningsfulle kandidater kan bli valgt for ytterligere nedstrøms molekylære og biokjemiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A er et flytskjema som beskriver SILAC merking prosedyren 21. For å rense exosomes, må prøvene spunnet ned via sentrifuge. Figur 1B viser trinnene av exosome rensing av serie ultracentrifugation 21. Når renset, er exosomes er gjenstand for eksperimentell proteomikk analyse som beskrevet i prosedyren.

Figur 2A er et flytskjema for å bestemme signifikante protein kandidater fra proteomic data 21. De valgte kandidatene blir så brukt for nedstrøms proteomikk analyse. Figur 2B er et eksempel på SILAC histogram som viser representative forhold av typiske protein kvantifisering resultater (Dette tallet er blitt modifisert fra Li et al. 6), og tabell 1 er enn eksempel på å bestemme cutoff-verdier for betydelige kandidater 6 fra disse SILAC ratio histogrammer. Ved å følge trinnene som er beskrevet i punkt 6.3, ble cutoff-verdier for å bestemme betydelig opp- eller nedregulert proteiner beregnet. I denne representative datasettet, ble proteiner med en tung / lett (H / L) ratio over øvre verdi cutoff anses som vesentlig oppregulert, mens proteiner med en H / L ratio under nedre grenseverdi ble ansett som signifikant nedregulert . Betydelig regulerte kandidatproteinene ville bli utsatt for videre undersøkelser.

Figur 3 viser de samlede bioinformatikk analyse og data mining prosedyrer for de utvalgte betydelige kandidatene. Tabell 2 er en data mining eksempel som benytter exosome og HIV-1 / vertsinteraksjonsdatabaser 6 for å samle informasjon om kandidatene (I denne kategorienle har blitt forandret fra Li et al. 6). Ved gruvedrift nåværende exosome og HIV-1 / vertsinteraksjonsdatabaser, ble tretten av fjorten kandidater funnet å assosiere med exosomes. Fem ut de fjorten kandidater ble også kjent for å samhandle med HIV-1. Blant dem, fire kandidater (HSPA4, varmesjokk 70 kDa protein 4; NUTF2, nukleær transport faktor 2; PTGES3, prostaglandin E-syntase 3; LDHB, L-laktatdehydrogenase B kjede) ble funnet å assosiere med både exosome og HIV-1. Blant HSPA4, NUTF2, PTGES3 og LDHB, bare LDHB var konsekvent under uttrykt i den infiserte fraksjon (tung merket). Gjennom en serie av analyser, valgte vi LDHB for å være den mest betydningsfulle kandidaten, som kan bli utsatt for videre studier. Nedstrøms proteomikk analyser er vist i figur 4. Figur 4A viser korte skritt av genet ontologi (GO) analyse; Figur 4B viser trinnene for å utføre DAVID analyse; Figur 4C viser hvordan du utfører nettverksanalyse ved hjelp STRING. Figurene 5A, 5B og 5C er DAVID analyse av et sett med fjorten proteiner i BP, CC og MF; Figur 5D viser de ti beste i samspill partnere av LDHB; Figur 5E viser at de fleste av interagerende partnere LDHB er også forbundet med exosome og HIV-1. Innledende DAVID analyseresultater antydet at mange kandidater er apoptose-relatert og trolig delta i proteinbinding. Ytterligere STRING-analyse bekreftet at LDHB bindingspartnere er også funksjonelt og locationally relatert til exosome og HIV-1. Alle disse resultatene gir verdifull informasjon for potensielle nedstrøms undersøkelser.

Figur 1
Figur 1: SILAC merking og exosome rensing ved hjelp av differensial ultracentrifugation.(A) To grupper av celler dyrkes hver for seg. Den ene gruppen er dyrket i merket medium for seks doublings for fullstendig merking. Den andre gruppen er dyrket på vanlig umerkede medium for samme periode. Deretter blir de merkede celler infisert med HIV-1, mens umerkede celler ikke er det. Endelig er exosomes fra begge grupper isolert i parallell. (B) De prøver (Supernatantene eller pelletene) som brukes i sentrifugering ved hvert trinn er angitt i reagensrørene. Fraksjoner å kastes er angitt på høyre side av reagensglass. Hastigheten og lengden av hver sentrifugering er også vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Veien til validering proteomikk datasettet (s) og bestemme betydelig proTein kandidater. (A) Flytskjema for å bestemme signifikante protein kandidater fra proteomikk datasettet (e). Disse fire trinnene sikre pålitelig utvalg av betydelige kandidater. Først blir en SILAC forholdet histogram plottet å vurdere kvaliteten på dataene. Neste, mindre ideelle kandidater som kan redusere nøyaktigheten blir fjernet. I det tredje trinnet, er statistiske metoder som brukes for å stille betydning terskler for potensielle protein kandidater. Endelig er de duplikate data for de betydelige kandidatene analysert med hensyn til konsistens og er slått sammen til slutt. (B) Representant histogram av SILAC forholdstall. Histogrammet avslørte symmetrisk fordeling langs ratio = 1 (log2 = 0) trendlinje. De log2 forvandlet forholdstall er gruppert i forholdet binger, og y-aksen viser den relative antall oppdaget forholdstall bin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Totalt bioinformatikk for analyse og data mining prosedyrer for betydelige kandidater. Prosedyrene inneholder exosomal og HIV-1 / verts data mining, Gene ontologi karakterisering, DAVID analyse og nettverksforslag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Fremgangsmåte for å utføre genet ontologi karakterisering, berikelse, og veien analyser. (A) trinn til å utføre genet ontologi (GO) karakterisering. For å få innsikt i funksjoner og subcellulære lokaliseringen av de betydelige kandidater, trinn for å utføre GO analyse ved hjelp av appi relevante programvare 26 er illustrert. (B) trinn for å utføre GO Term berikelse analyse. For å få berikelse informasjon av de viktige kandidater, er korte skritt til å utføre DAVID analyse vist. (C) trinn til å utføre samhandling og sti analyse. For å belyse mulige veier og finne funksjonelle partnere, skritt til å utføre interaksjon eller nettverk analyse av STRING vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Representant DAVID og STRING analyseresultater. (A) BP berikelse resultatene av de fjorten kandidater av David analyse. Celledød relaterte prosesser er betydelig beriket. (B) CC enrichmen t resultatene av de fjorten kandidater av David analyse. Mange proteiner har en intracellulær opprinnelse. (C) BP berikelse resultatene av de fjorten kandidater av David analyse. De fleste av de kandidatene delta i proteinbinding. (D) De ti samspill partnere av LDHB identifisert av STRING. (E) Flertallet av LDHB partnere er også forbundet med exosome og HIV-1, noe som ytterligere støtter rollene LDHB i exosome / HIV-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1: Representant beregning av cutoff-verdier for betydelig protein forstyrrelse.

e2.jpg "/>
Tabell 2: Sammenhenger mellom SILAC kandidater og deres exosomal lokaliseringer og interaksjoner med HIV-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I fremgangsmåtene som beskrives i dette dokumentet, har vi demonstrert anvendelsen av SILAC teknikk for å undersøke effekten av HIV-1-infeksjon i verten exosomal proteome. I utgangspunktet friske og HIV-1-infiserte celler er forskjellig isotop-merket. De forskjellig merkede exosomes blir deretter renset før du utfører protein utvinning. Deretter blir væskekromatografi tandem-massespektrometri anvendes for å analysere exosomal proteome. Til slutt blir den resulterende masse spektrometri data og potensiell kandidat proteiner underkastet statistisk og bioinformatikk analyser før nedstrøms biokjemiske disseksjoner.

Kritiske trinn i hele protokollen må følges for å oppnå optimale resultater. I den innledende fasen av protokollen, kan SILAC merking bli påvirket av celletype og merking medium. Sunn og svært proliferative celler bør brukes for å oppnå en høy merking effektivitet. Kritisk, merking medium skal tilberedes ved hjelp dialysert bovint foster (FBS) snarere enn vanlig FBS. Dialysert FBS er oppbrukt av aminosyrer og peptider, og er derfor mindre tilbøyelige til å innvirke på SILAC merking. Det bør imidlertid bemerkes at dialysert serum ikke kan være egnet for noen cellelinjer, spesielt primære celler. Normal vekst på mellom med dialysert FBS må bekreftes før ansette den SILAC strategi. I tillegg, ved bruk av dobbel "tunge" isotop merking (13 C 6 L-lysin og 13 C 6 15 N 4 L-arginin) i stedet for å bruke 13 C 6 L-lysin enkeltvis, kan øke antallet av kvantifiserte peptider i massespektrometri analyse. Det minste antall celler som er nødvendig for vellykket påfølgende proteom- analyse avhenger av mange faktorer, slik at følsomheten av massespektrometer, massen av hver celle, og proteom målrettet (hel proteom eller post-translasjonelle modifiserte proteiner). Basert på våre funn, vi ti millioner celler som et innledende beløp for å estimere det passende antall celler som kreves for massespektrometri.

Exosome isolert fra cellekultursupernatanter kan forbedres ved tilsetning av et filtreringstrinn som følger. For suspensjonen av celler, blir et første sentrifugeringstrinn ved 200 xg i 10 min gjort for å fjerne celler suspendert i supernatanten, etterfulgt av filtrering gjennom en 0,22 um filter 29, 30. For adherente celler, kan supernatanten samles direkte fra kulturen og filtrert på samme måte. Filtrering er et kritisk trinn for å separere exosomes fra forurensende materialer, for eksempel små molekyler og peptider. De exosomes kan deretter isoleres fra supernatanten ved å bruke den klassiske ultrasentrifugemetoden, eller ved å bruke kommersielt tilgjengelige reagenser exosome isoleringssett. Renheten av exosome kan bekreftes ved nanoparticle sporing analyse eller elektronmikroskopi 31.

Siden HIV-1 viruspartikler er vanligvis omtrent samme størrelse som exosomes, de kan forurense exosomes renset fra HIV-1-infiserte prøver. I proteomikk skjermer, kan potensielle virus forurensninger filtreres ut ved å begrense databasesøk bare å humane proteiner. Ytterligere isolasjonsteknikker ved bruk av etablerte metoder som gradienter iodixanol tetthet og immunoaffinitetskromatografi Isoleringen kan også anvendes for å separere HIV-1 viruspartikler fra exosomes 32, 33.

Deretter diskuterer vi noen forslag for å sikre pålitelige data analyse for å identifisere potensielt betydelige kandidater når MS resultatene er hentet fra isolerte exosomes. I det første trinn av analysen, skal SILAC forholdet histogrammet følge en normalfordeling. Hvis dataene fordelingen er forskjøvet i en bestemt retning, vil leseren må bestemme the forårsake før du fortsetter med analysen. For eksempel kan de merkede og umerkede prøvene ikke er blandet i like proporsjoner. Dessuten kan enkelte peptider ikke har tung / lett SILAC ratio verdier, og bør fjernes fra de potensielle protein kandidater. Etter kandidater blir valgt, kan programvare og databaser brukes til å verifisere exosome berikelse, interaksjoner med testforhold og mulige veier. Samspillet mellom kandidat proteiner og test tilstanden bør utvinnes gjennom spesifikke databaser før bioinformatikk analyse. For bioinformatikk karakteristikkene, kan genet ontologi merknader bli identifisert ved hjelp av diverse programvare og databaser,

Den SILAC teknikk ansatt her har en systematisk og grei tilnærming til å analysere vert exosomal proteom. De fleste biomedisinske laboratorier ville være i stand til å vedta de prosedyrer med minimal ekstra utstyr og ekstra kostnader. Den SILAC teknikk, men er først og fremst designerte for studier ved hjelp av cellelinjer. Som sådan, kan andre metoder må benyttes for å studere forskjellige biologiske prøver. For eksempel, kan markørene frie MRM (multiple reaksjonsovervåkning) metode brukes for målrettet kvantifisering av proteiner og peptider i kliniske prøver 9, 34. Mens i tilfellet med bestemmelse av protein-innhold fra flere undersøkelser, kan det SILAC teknikken også brukes til å undersøke to eller flere prøver. Den kjemiske merking metoden iTRAQ (isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering) eller TMT-basert (tandem masse tag) metoder tillater mye høyere multipleksing og ville være bedre egnet for flere prøver.

Fremgangsmåten som beskrives her er ikke begrenset til proteomikk karakterisering av exosomes fra HIV-1 infiserte celler. Med modifikasjoner, kan den være innrettet til å analysere exosomes under et bredt utvalg av test og spenningsforhold slik som bakterieinfeksjon, viral infeksjon, og radiation. Det er også egnet for å studere andre subcellulære avdelinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en Arra supplement til Livsløp / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, og K24HD080539 til BR. Dette arbeidet ble også støttet av Levetid Pilot forskningsfond (# 701- 5857), Rhode Island Foundation Medical Research Grant (# 20133969) og NIH Cobre URI / RIH Pilot stipend (P20GM104317) til ML. Vi takker James Myall og Vy Dang for hjelp med manuskriptet og figur forberedelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
H9 cell line ATCC HTB-176
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
MTT assay kit Thermo Fisher V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher 26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 Thermo Fisher 89982 DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Thermo Fisher 88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Thermo Fisher 88431
HIV-1 NL4-3 NIH AIDS Reagent Program 2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit PerkinElmer NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge Eppendorf 22628045
Refrigerated ultracentrifuge Beckman Coulter 363118 Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher 14-432-22
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW 32 Ti Rotor Beckman Coulter 369694
RIPA buffer Thermo Fisher 89900
Protease Inhibitor Cocktails Thermo Fisher  78430
ThermoMixer  Eppendorf 5384000020
BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher 23250
Spectrophotometer Biorad 1702525
SDS PAGE Gel apparatus Thermo Fisher EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels Novex XV04200PK20
Gel staining reagent Sigma Aldrich G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
SpeedVac Concentrator Thermo Fisher SPD131DDA
Antibody to human annexin A5 Abcam ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain Abcam ab53292
Graphing and Statistical Software Systat  SigmaPlot  Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite Max Planck Institue of Biochemistry Maxquant 
Software and databases Various vendors Refer to main text for details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

Tags

Infeksjon Exosomes ekstracellulære Kjøretøy HIV-1 proteomikk massespektrometri SILAC bioinformatikk
SILAC basert proteomikk Karakterisering av Exosomes fra HIV-1 infiserte celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, … More

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, R., Ramratnam, B., Li, M. SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells. J. Vis. Exp. (121), e54799, doi:10.3791/54799 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter