Introduction
सीमित तत्व (FE) मॉडलिंग एक इंजीनियरिंग तकनीक है कि computationally की गणना और परिमाण और एक संरचना 1 पर अभिनय उपभेदों के स्थान नक्शा कर सकते है। मॉडल 3 डी संरचना, "परिमित तत्वों" का एक जाल द्वारा प्रतिनिधित्व के होते हैं, और विश्लेषण के अंतिम परिणाम की संरचना और जाल, परिमाण और यांत्रिक के स्थान में तत्वों की संख्या सहित कारकों की एक संख्या से नियंत्रित होता है भार और सामग्री के गुणों। सामग्री गुण लोड का एक दिया प्रकार के तहत एक सामग्री के व्यवहार के कुछ पहलुओं का वर्णन; यंग मापांक (ई) सामग्री की लोच का वर्णन करते हुए पॉसों के अनुपात इसकी लंबाई के लिए एक सामग्री की चौड़ाई में आनुपातिक कमी का वर्णन है जब एक नमूना फैला है। एफई मॉडलिंग संरचना के बारे में अद्वितीय इनपुट डेटा खाते में लेने के द्वारा विस्थापन, तनाव, दबाव और तनाव अभिनय मॉडल पर सहित चर की एक किस्म की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 'की आकृति, स्थान और भार की भयावहता और विशिष्ट गुण सामग्री।
एफई मॉडलिंग व्यापक रूप से इंजीनियरिंग 2 में और तेजी से आर्थोपेडिक 3 और paleontological अनुप्रयोगों 4 के लिए प्रयोग किया जाता है। विकास में बायोमैकेनिकल बलों कई कोशिकाओं में एक प्रोत्साहन सेल प्रतिक्रिया 5-8 सक्रिय करने के लिए के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है और यह अंग प्रणालियों के विकास के भीतर दोनों सापेक्ष स्थिति और यांत्रिक उत्तेजनाओं के परिमाण भविष्यवाणी करने के लिए उपयोगी है, हालांकि, वर्तमान में एफई मॉडलिंग थोड़ा इस्तेमाल किया गया है zebrafish विकास के लिए।
दोनों उपास्थि और हड्डी mechanosensitive सामग्री होना दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, इन विट्रो संपीड़न, chondrogenic रास्ते को सक्रिय करने whilst तनाव हड्डी गठन 9 के लिए आवश्यक हो दिखाया गया है पाया गया है। एफई विश्लेषण (FEA) जैविक नमूनों पर अभिनय, के लिए हड्डी के दौरान कंकाल तत्वों पर अभिनय उन सहित उपभेदों मॉडल करने के लिए शोषण किया गया हैrmation 10। अन्य अनुप्रयोगों के विकास के बाद यह सैद्धांतिक biomechanical बलों 11,12 को उजागर किया गया और लड़की घुटने संयुक्त morphogenesis 8 दौरान उपस्थित उपभेदों के पैटर्न को दिखाने के लिए एक संयुक्त के आकार की भविष्यवाणी करने के लिए इसके उपयोग में शामिल हैं।
इस प्रोटोकॉल के विकास के ऊतकों के यांत्रिकी समझने के लिए एक दृश्य के साथ confocal छवियों से 3 आयामी सतहों, meshes और सीमित तत्व मॉडल पैदा करने का अनुभव साझा करने के उद्देश्य से है। हम यह भी एफई मॉडल मान्य हालांकि विवो में वास्तविक संयुक्त विस्थापन जानकारी पर कब्जा करने के तरीके बताते हैं। हम एक कापी के रूप में zebrafish जबड़े का उपयोग करते हुए एक ही तकनीक किसी भी छोटे जैविक प्रणाली है जिसके लिए musculoskeletal प्रणाली की संरचना पर 3 डी जानकारी confocal या multiphoton इमेजिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है पर इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
प्रोटोकॉल के भीतर सभी कदम ब्रिस्टल जानवरों की देखभाल और कल्याण के दिशा निर्देशों और ब्रिटेन के गृह मंत्रालय के उन लोगों के लिए विश्वविद्यालय का पालन करें।
1. मस्कुलोस्कैलेटल शारीरिक रचना के दृश्य
नोट: कंकाल तत्वों के आकार की कल्पना करने के लिए, मांसपेशियों की मात्रा ठहराना और मांसपेशियों संलग्नक के सटीक स्थान की पहचान करने के लिए, immunostain (धारा 1.1) कंकाल मायोसिन के लिए उचित उम्र में मछली (जो मांसपेशियों का पता चलता है) और प्रकार द्वितीय कोलेजन (कल्पना करने के लिए कार्टिलेज)। उपास्थि और धीमी गति से मायोसिन भारी श्रृंखला संवाददाता smyhc कल्पना करने के लिए mCherry 13,14: वैकल्पिक रूप से, इस तरह के कोलेजन A1 संवाददाता col2a1 के रूप में musculoskeletal शरीर रचना विज्ञान ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाता लाइनों का उपयोग कर कल्पना GFP 15 मांसपेशियों संलग्नक (धारा 1.2) की स्थिति कल्पना करने के लिए।
वैकल्पिक लाइनों है कि कार्टिलेज और मांसपेशियों के निशान भी उतना ही अच्छा काम कर सकता था।
- फ्लोरोसेंट Immunostaining
- 1 घंटे के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में अतिरिक्त 4% paraformaldehyde (पीएफए) में लार्वा को ठीक करें। 0.1% बीच 20 (पीबीटी) के साथ पीबीएस में धो लें और क्रमशः 5 मिनट के लिए पीबीटी में 50% मेथनॉल (MeOH) और 100% MeOH में निर्जलीकरण।
सावधानी: पीएफए विषैला होता है और माल की सुरक्षा शीट के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए।
नोट: लार्वा 100% MeOH में संग्रहित किया जा सकता जब तक की आवश्यकता है। - 5 मिनट के लिए पीबीटी में 50% MeOH में लार्वा rehydrate। 5 मिनट के लिए पीबीटी में धो लें।
- 5-6 मिनट के लिए बर्फ पर पीबीटी में 0.25% trypsin में लार्वा Permeabilize। 5 मिनट प्रत्येक के लिए 4x पीबीटी में धो लें।
- पीबीटी में 5% सीरम में 2-3 घंटे के लिए ब्लॉक।
- कमरे में अस्थायी पर 1 घंटे या रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सिफारिश की पीबीटी में 5% सीरम में खरगोश विरोधी टाइप 2 कोलेजन और माउस विरोधी मायोसिन एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने में लार्वा सेते हैं।
नोट: सिफारिश की कमजोर पड़ने रेंज एंटीबॉडी डाटा शीट पर सामान्य रूप से है। एंटीबॉडी कि एक दूसरे के लिए विभिन्न प्रजातियों के खिलाफ उठाए गए हैं और वह भी diffe हैं चुनेंऊतक के लिए किराए पर। - पीबीटी में 15 मिनट के लिए लार्वा 6x धो लें।
- पीबीटी में 5% सीरम में 1-2 घंटे के लिए ब्लॉक।
- अंधेरे में माध्यमिक एंटीबॉडी में सेते हैं। विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए 5% सीरम और पीबीटी में एक उपयुक्त कमजोर पड़ने पर fluorescently लेबल विरोधी माउस (550) और विरोधी खरगोश (488) माध्यमिक एंटीबॉडी का प्रयोग करें।
- जितनी जल्दी हो सके एक 10X confocal खुर्दबीन पर पीबीटी और छवि में 10 मिनट प्रत्येक के लिए धो 6X।
- 1 घंटे के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में अतिरिक्त 4% paraformaldehyde (पीएफए) में लार्वा को ठीक करें। 0.1% बीच 20 (पीबीटी) के साथ पीबीएस में धो लें और क्रमशः 5 मिनट के लिए पीबीटी में 50% मेथनॉल (MeOH) और 100% MeOH में निर्जलीकरण।
- इमेजिंग मस्कुलोस्कैलेटल ज्यामिति
- Danieau का समाधान 16 में गुनगुना 0.3-0.5% कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) agarose में एक coverslip पर पेट के बल लार्वा माउंट।
नोट: ट्रांसजेनिक मछली बढ़ते से पहले और इमेजिंग के दौरान 0.02% MS222 (tricaine methanesulfonate, पीएच 7) में बेहोश करने की आवश्यकता होगी। - 10x उद्देश्य लेंस और लगभग 2.5X डिजिटल ज़ूम का उपयोग हित के क्षेत्र के एक confocal छवि ढेर ले लो। 488 एनएम और 561 n का उपयोग हरे और लाल चैनल की छवियों को तैयारएम क्रमशः पराबैंगनीकिरण। 1.3 माइक्रोन और 3 लाइन औसत के Z विमानों के बीच अंतराल के साथ एक 512 x 512 पिक्सेल संकल्प पर छवि। जिसके परिणामस्वरूप ढेर लगभग 100 जेड स्लाइस का समावेश होगा।
- एक झगड़ा श्रृंखला के रूप में डेटा निर्यात करें। एक 5dpf zebrafish लार्वा से मांसपेशियों और उपास्थि तत्वों की अधिकतम अनुमानों चित्र 1 में दिखाया गया है।
- Danieau का समाधान 16 में गुनगुना 0.3-0.5% कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) agarose में एक coverslip पर पेट के बल लार्वा माउंट।
2. एक 3 डी भूतल सृजन
- 3, 4 और 5 DPF पर हर समय बिंदु के लिए एक प्रतिनिधि डाटासेट चुनें (कई नमूने के दृश्य के बाद चयन)।
- ओपन 3-आयामी झगड़ा हो चुकी है और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में सभी चैनलों का चयन करें। सही उपास्थि चैनल पर क्लिक करें और छवि फिल्टर और समरेखण का चयन करें: गाऊसी (चित्रा 2 बी)।
- परियोजना ध्यान में रखते हुए सही फ़िल्टर छवि पर क्लिक करें और 'छवि विभाजन' का चयन करें और फिर 'नया लेबल संपादित करें'। प्रत्येक सामग्री, यानी, कार्टिलेज और जम्मू के लिए एक नया लेबल बनाएंoint। छवि के उपास्थि क्षेत्र (चित्रा -2 सी, सफेद संकेत, बैंगनी रूपरेखा) जादू की छड़ी उपकरण का उपयोग का चयन करें। रूपरेखा से शोर को दूर करने के लिए ब्रश उपकरण का उपयोग करें।
नोट: यदि जादू की छड़ी उपकरण का उपयोग कर, क्लिक करें 'सभी स्लाइस'। - ब्रश उपकरण के साथ संयुक्त क्षेत्र का चयन करें और एक संयुक्त घटक करने के लिए आवंटित (चित्रा -2 सी, नीले रंग की रूपरेखा)
- शीर्ष मेनू और चिकनी लेबल में विभाजन का चयन करके एक बार में चिकनी कई स्लाइस। सही छवि पर क्लिक करें और सतह उत्पन्न एक 3 डी सतह घटक (चित्रा 2 डी) का प्रतिपादन उत्पादन करने के लिए।
- सतह पर क्लिक करें और meshing सॉफ्टवेयर में आयात के लिए एक hmascii फ़ाइल के रूप में डेटा को बचाने के।
3. स्नायु बलों की गणना एफई मॉडल में इस्तेमाल किया जाएगा
- Smyhc के confocal छवियों से मांसपेशी फाइबर की संख्या की गणना: GFP ट्रांसजेनिक zebrafish (चित्रा 1 ए, नोक, 1 सी) और व्यास को मापनेफाइबर की eter उनके पार अनुभागीय क्षेत्र की गणना करने के लिए (πr 2)।
- साहित्य से पेशी प्रति इकाई क्षेत्र उपयुक्त बल को पहचानें। अधिक से अधिक मांसपेशियों लार्वा zebrafish कंकाल की मांसपेशियों (40 एनएन / माइक्रोन 2) के लिए प्रति इकाई क्षेत्र उत्पन्न बल 17 इस्तेमाल किया गया।
- प्रति इकाई क्षेत्र बल द्वारा फाइबर की संख्या और उनके क्षेत्र गुणा करके प्रत्येक संरचनात्मक पेशी समूह के लिए बलों की गणना। 1 टेबल देखें।
4. एक जाल सृजन
- धारा 2 (ऊपर) एक सॉफ्टवेयर एक परिमित तत्व जाल पैदा करने में सक्षम पैकेज में उत्पन्न में 3 डी मॉडल आयात करें।
- 2 डी मेनू के तहत हटना लपेटो उपकरण का उपयोग करके उपास्थि और संयुक्त सतहों के A2D जाल उत्पन्न करता है। एक उचित तत्व आकार चुनें।
नोट: 1.5-2.5 के बीच एक तत्व आकार का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, उत्पन्न अलग आकार 2 डी सतह की एक सीमा 3 डी जाल अनुकूलन (धारा 4 के लिए बाहर ले meshes।4)। - बाहर ले जाने के नीचे पाया जाल गुणवत्ता की जांच '2 डी> उपकरण> तत्वों की जाँच करें' दोहराया तत्वों, सम्मिलन और जाल में पेनेट्रेशन के लिए जाँच करने के लिए कक्ष। मॉडल के पेड़ में उपयोगिता टैब का उपयोग करके द्वितल कोण को ठीक करें।
- 3 डी> Tetramesh subpanel का उपयोग कर तत्व आकार भिन्न की 2 डी सतह meshes से एक 3 डी जाल उत्पन्न करता है।
नोट: विभिन्न जाल आकार के परिणामों की तुलना और सबसे कम जाल आकार है कि आगे सिमुलेशन के बाद converges और सुविधा परिभाषा समझौता नहीं करता है के साथ एफई मॉडल का चयन करें। चित्रा 3 में उदाहरण के 1.5 लाख से निचले जबड़े उपास्थि के लिए tetrahedral तत्व शामिल हैं और 2.0 की एक 2 डी तत्व आकार की थी। - जाल रूपांतरण इसलिए जबड़े मॉडल confocal ढेर ज्यामिति> दूरी subpanel का उपयोग कर के रूप में प्रति पैमाने पर है।
नोट: उपास्थि सुनिश्चित करें और संयुक्त घटकों किसी मर्ज किए गए मॉडल के निर्यात से या संबंधों का उपयोग करके मॉडल में जुड़े हुए हैं।
5. सीमित तत्व मॉडएल निर्माण
- वाणिज्यिक परिमित तत्व (FE) सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक एफई मॉडल बनाने के लिए। 3 डी मांसपेशियों और उपास्थि लेबल confocal एक गाइड के रूप में धारा 1 में उत्पन्न ढेर का उपयोग करना, नोड्स है कि मांसपेशियों लगाव अंक के अनुरूप आवंटित। दो (चित्रा 3) मूल और हर पेशी की प्रविष्टि का प्रतिनिधित्व नोड्स के बीच एक वेक्टर बनाएँ।
- प्रकार 'इतिहास' के एक लोड कलेक्टर बनाएं प्रत्येक पेशी के लिए एक 'सी लोड' लागू करने के लिए। न्यूटन (3.3 कदम में गणना) में परिमाण निर्दिष्ट करें और जुड़े वेक्टर आवंटित। चित्रा 3 पेशी में mandibulae (एएम), चांदा hyoideus (पीएच) और intermandibularis (आईएम) के लिए लगाव अंक से पता चलता।
नोट: इन जबड़े की मांसपेशियों के लिए, अधिकतम सिकुड़ा बल मूल और सम्मिलन ताकि प्रत्येक लोड का केवल 50% प्रत्येक साइट पर लागू किया जाता है के बीच वितरित किया जाता है। - उचित लोचदार isotropic सामग्री गुण निरुपित के रूप में साहित्य द्वारा निर्धारित की। उपास्थि के लिए यंग मापांकऔर इस मॉडल में 1.1 Interzone एमपीए और 0.25 एमपीए क्रमशः थे और पॉसों के अनुपात दोनों 18,19 के लिए 0.25 था।
- प्रकार 'सीमा' के एक लोड कलेक्टर मॉडल पर प्रारंभिक बाधाओं लागू करने के लिए बनाएँ। टैब विश्लेषण> प्रतिबन्ध के पास जाओ और बनाने subpanel में, मॉडल आप विवश करना चाहते हैं पर नोड्स उठाओ। स्वतंत्रता की डिग्री (dof) गति की अपनी प्राकृतिक सीमा का सबसे अच्छा सन्निकटन के लिए मॉडल की है कि सीमा आंदोलन का चयन करें।
नोट: चित्रा 3 में मॉडल गति के सभी कुल्हाड़ियों में विवश किया गया था: मॉडल में और में एक मध्य बिंदु पर अंतरिक्ष में लंगर के लिए ceratohyal पर (dof 1, 2, 3 एक्स, वाई और जेड, क्रमशः प्रतिनिधित्व करते हैं) इस मुद्दे पर जहां palatoquadrate zebrafish खोपड़ी के बाकी (चित्रा 3, 1 टेबल) को जोड़ता है पर वाई और जेड अक्ष। मॉडल एक कम से कम एक नोड में सभी तीन DOF में विवश किया जाना चाहिए। - एक 'लोड कदम', आंदोलन के प्रत्येक प्रकार आप सिमुल करने के लिए इच्छा के लिए बनाएंखाया विश्लेषण मेनू के तहत (यानी, उद्घाटन, समापन) और सभी प्रासंगिक भार और बाधाओं (धारा 5.4 में किए गए) (धारा 5.2 में किए गए) का चयन इस आंदोलन अनुकरण। ड्रॉप डाउन मेनू से 'स्थिर' का चयन करें जब यह प्रकट होता है।
- निर्यात मॉडल जाल, भार, बाधाओं और एक उचित फ़ाइल स्वरूप में सामग्री गुण भी शामिल है, इस मामले में ".inp" प्रारूप में।
- एफई विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लोड मॉडल। बनाएँ और मॉडल नौकरी मॉड्यूल का उपयोग करने के लिए एक कार्य निष्पादित।
- तनाव, तनाव, विस्थापन, आदि परिणाम टैब और दृश्य मेनू में पाया के लिए आउटपुट का विश्लेषण (चित्रा 4 और 5)।
6. जबड़ा विकार / विस्थापन दूरियां के मान्यकरण
- ट्रांसजेनिक zebrafish: 3-6 टीजी (mCherry Col2a1aBAC) का चयन करें।
- हल्के से 0.02% MS222 के साथ लार्वा चतनाशून्य जब तक वे के लिए स्पर्श लेकिन उनके दिल में अभी भी मार रहे प्रतिक्रिया करने के लिए संघर्ष।
- पर्वतलार्वा laterally (anaesthetized जबकि) गुनगुना 1% एलएमपी agarose में coverslips पर (Danieau के समाधान में बना हुआ है)।
- सिर के चारों ओर से agarose निकालें और संदंश के साथ जबड़े।
- लार्वा के सिर पर (कोई MS222) के साथ नए सिरे से Danieau समाधान निकलवाने तक सामान्य मुंह आंदोलनों को फिर से शुरू पाश्चर विंदुक का उपयोग संज्ञाहरण हटा दें।
- फिल्म पर कब्जा सॉफ्टवेयर का प्रयोग मुंह आंदोलनों के उज्ज्वल क्षेत्र उच्च गति वीडियो लेने के लिए। उच्चतम फ्रेम दर पर एक मिनट की अवधि के आसपास की फिल्मों ले, या पर्याप्त जबड़े खोलने की कई चक्र को रिकॉर्ड करने के लिए।
- फ्रेम कि जबड़े इसकी अधिकतम विस्थापन के लिए खुला दिखाने के लिए चुनें। मेकेल उपास्थि के पूर्वकाल टिप और ऊपरी जबड़े (सलाखें प्लेट की नोक) माइक्रोन में बीच की दूरी को मापने।
- कई मछली के लार्वा से औसत विस्थापन की गणना।
- मॉडल से विस्थापन डेटा निकालें। मॉडल विस्थापन व्यवहार को सत्यापित करने के लिए औसत विस्थापन 6.8 में गणना का उपयोग करें (
Representative Results
मांसपेशी (चित्रा 1 ए) और उपास्थि (चित्रा 1 बी) या ट्रांसजेनिक संवाददाताओं की इमेजिंग के लिए Immunostaining (चित्रा 1 सी), की अनुमति देता जुड़े मांसलता के साथ जबड़े की 3 डी संरचना कल्पना की जा सके। एक उच्च संकल्प पर इमेजिंग द्वारा यह संभव था कि एक मॉडल (चित्रा 2) जबड़े के दोनों तीन आयामी आकार और स्थान और भार के स्थान (चित्रा 3) कब्जा बनाने के लिए। विवो विस्थापन उच्च गति वीडियो पर कब्जा के माध्यम से देखा (चित्रा 4) में उपयोग हम सत्यापित है कि मॉडल में गति की सीमा एक यथार्थवादी सीमा के भीतर था।
एक बार रन एफई मॉडल इस तरह के तनाव (चित्रा 5 ए), न्यूनतम और अधिकतम प्रिंसिपल तनाव (- कश्मीर चित्रा 5 ब) के रूप में डेटा की एक श्रृंखला प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन परिणामों के तीन-मंद कर रहे हैं ensional इसलिए मॉडल विस्तार के ठीक पैटर्न (चित्रा 5E, 5I) देखने के लिए बढ़ाया जा सकता है प्रासंगिक दृश्य (चित्रा 5F, 5G, 5J, 5K) और डिजिटल sectioned (चित्रा 5E ', 5E', 5I ', 5I प्राप्त करने के लिए घुमाया '') को दिखाने के लिए कैसे तनाव, तनाव या मॉडल के दौरान दबाव परिवर्तन के पैटर्न। (नहीं दिखाया गया है) यह भी मॉडल से मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए संभव है। मॉडल की पुष्टि करने और सबसे सटीक सामग्री गुण, भार का उपयोग और आकार जाल से एफई मॉडल यांत्रिक पर्यावरण का सबसे अच्छा अनुमान विकास की उस खिड़की के दौरान कोशिकाओं द्वारा अनुभव किया जा रहा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मॉडल के परिणामों को सीधे सेलुलर व्यवहार और जीन अभिव्यक्ति 20 में परिवर्तन करने के लिए तुलना की जा सकती।
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चित्रा 1:। 5 DPF पर zebrafish निचले जबड़े की मांसपेशियों तत्वों की छवियों प्रतिनिधि 5dpf लार्वा के निचले जबड़े के प्रतिनिधि confocal ढेर सारी (बी) के पूर्वकाल शीर्ष करने के लिए (ए) A4.1025 के लिए Immunostaining जो सभी कंकाल मायोसिन धब्बे के साथ दिखाए प्रकार द्वितीय कोलेजन जो ट्रांसजेनिक संवाददाताओं col2a1 व्यक्त एक लाइव लार्वा से सभी उपास्थि (सी) के ढेर के निशान के लिए immunostaining: mCherry अंकन उपास्थि (लाल) और smyhc: GFP धीमी गति से मांसपेशियों (हरा)। आइए: intermandibularis पूर्वकाल, पीएच: चांदा hyoideus, AM: पेशी में mandibulae, HI: hyoideus अवर, HI: hyoideus बेहतर, सीएच: sternohyoideus, एम सी: मेकेल उपास्थि, पीक्यू: Palatoquadrate, दर्पण:। Ceratohyal देखने के लिए यहाँ क्लिक करें एक बड़ा संस्करण यह आंकड़ा की।
चित्रा 2: confocal डेटा से एक 3 डी सतह की पीढ़ी संयुक्त क्षेत्र की उच्च वृद्धि के साथ zebrafish निचले जबड़े के लिए एक 3 डी सतह में confocal डेटा से संक्रमण दिखा छवियों।। (ए) कच्चे confocal डेटा; (बी) के एक गाऊसी फिल्टर के आवेदन के बाद डेटासेट; (सी) छानने रूपरेखा; (डी) 3 डी सतह। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 3: प्रतिनिधि की कमी और बल वैक्टर दिखा meshes (ए) मुंह बंद करने के लिए एक और 5 DPF लार्वा के लिए प्रतिनिधि meshes।(बी) के मुंह खोलने। सफेद डॉट्स स्थानों पर जहां मॉडल विवश है निरूपित और जिसमें आयाम (जैसे, एक्स और वाई या एक्स, वाई और जेड)। व्हाइट लाइनों मांसपेशी पदों निरूपित, मांसपेशियों में सफेद तीर से चिह्नित बल के वेक्टर के साथ। लाल उपास्थि पता चलता है और पीला Interzone। यह आंकड़ा पहले खामियाजा एट अल। 15 में प्रकाशित अनुपूरक सामग्री से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। संवेदनशीलता परीक्षण FE-मॉडल अलग उपास्थि और Interzone यंग moduli के लिए 5dpf zebrafish में जबड़े विस्थापन का अनुकरण। विस्थापन के जबड़े पर चिह्नित (माइक्रोन में बंद करने के लिए खुला) जबड़ा; रंग कुंजी का उपयोग कर दर्ज की गई। प्रत्येक मॉडल (एक - एल) (ग = 1.1, 3.1, 6.1 या एमपीए) या Interzone (0.25 की मैं =, 0.5, 0.75, या 1 एमपीए) गुण उपास्थि का एक अलग संयोजन है। क्षैतिज काला तीर (ऊर्ध्वाधर काला तीर द्वारा प्रतिनिधित्व) मेकेल उपास्थि की नोक पर जबड़े विस्थापन के मूल्य पर प्रकाश डाला गया। एम और एन DPF लार्वा दिखा रहा है कम से कम 5 के वीडियो से चित्र, यानी, जबड़े बंद (एम) और अधिकतम, यानी, जबड़े पूरी तरह से खुला (एन) के दो आरोपित साथ (ओ) - हे पर सफेद लाइन (43 माइक्रोन) के विस्थापन का प्रतिनिधित्व करता है। विस्थापन जीवित मछली में देखा 0.25 (ए) सबसे अच्छा मैच की एक Interzone के साथ 1.1 के इस मामले रिश्तेदार उपास्थि गुण में (ओ)। यह आंकड़ा की अल पैनलों पहले अल। खामियाजा एट 15 में प्रकाशित किया गया है। एक बड़ा vers देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के आयन।
चित्रा 5: एफई मॉडल से प्रतिनिधि डेटा लार्वा DPF एक 5 में लागू सभी मांसपेशियों की FE-सिमुलेशन मॉडल (एक - सी)।। (ए) वॉन Mises (EMaxmin) (बी) न्यूनतम प्रधान तनाव (ई मि। पी, μɛ) (सी) अधिकतम प्रिंसिपल तनाव (ई मैक्स। पी, μɛ)। जबड़े उद्घाटन के दौरान अधिकतम और न्यूनतम उपभेदों के प्रमुख FE-सिमुलेशन मॉडल। (डी - कश्मीर): अधिकतम प्रिंसिपल तनाव (। ई मैक्स पी, μɛ) (डी) के उदर जबड़े देखें और (ई) उदर संयुक्त दृश्य (ई) में मेकेल उपास्थि के माध्यम से समीपस्थ-बाहर का वर्गों के स्थान से पता चलता संयुक्त और Interzone (ई) और (ई '') में, क्रमशः। (एफ): पार्श्वदेखें जबड़े। (छ): पार्श्व संयुक्त देखें। (एच - कश्मीर): न्यूनतम प्रधान तनाव (ई। मिन पी, μɛ) (एच) उदर जबड़े देखें और (आई) उदर संयुक्त ध्यान में रखते हुए। (मैं) मेकेल उपास्थि संयुक्त माध्यम से समीपस्थ-बाहर का वर्गों के स्थान पता चलता है और (मैं ') और (मैं' ') क्रमश: (जे) में Interzone: पार्श्व जबड़े दृश्य। (कश्मीर): पार्श्व संयुक्त देखें। यह आंकड़ा पहले से अल। खामियाजा एट 15 में प्रकाशित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| मांसपेशी फाइबर की संख्या | मांसपेशी फाइबर क्षेत्र (माइक्रोन 2) | पेशी समूह क्षेत्र (माइक्रोन2) | बल (एन) | |
| 5 DPF intermandibularis पूर्वकाल | 5 | 23.8 | 119 | 4.76e -6 |
| 5 DPF चांदा hyoideus | 6 | 23.8 | 142.8 | 5.71e -6 |
| 5 DPF पेशी में mandibulae | 9 | 23.8 | 214.2 | 8.57e -6 |
तालिका एक: स्नायु मात्रा का ठहराव। 40 एनएन / माइक्रोन 2 (संदर्भ 17 से लिया प्रति इकाई क्षेत्र मूल्य) का उपयोग DPF 5 पर गणना Intermandibularis पूर्वकाल, adductor Mandibulae और चांदा Hyoideus के लिए औसत मांसपेशी बलों। (Lorga एट अल।, 2011) (एन = 3)।
Discussion
सीमित तत्व मॉडल कंकाल तत्वों है कि उन के दौर से गुजर हड्डी गठन 10 के साथ तनाव के तहत कर रहे हैं के क्षेत्रों से संबंधित हैं, साथ ही साथ endochondral हड्डी बन जाना और संयुक्त morphogenesis 8,12,21 के दौरान तनाव के अधीन क्षेत्रों नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। अन्य अध्ययनों से यह भी संयुक्त विकास 11,12 दौरान परिवर्तनों को दोहराने के लिए सैद्धांतिक विकास मॉडल को लागू करने में सक्षम हो गया है। यहाँ हम एक अपेक्षाकृत सरल प्रणाली, zebrafish जबड़े 20 के लिए एफई मॉडल के निर्माण के लिए प्रोटोकॉल दिखा। इस तरह के सीटी स्कैन 22, ट्रांसजेनिक लाइनों के confocal इमेजिंग या immunostained zebrafish के रूप में एफई मॉडल, के लिए कच्चे छवियों का संग्रह करने के वैकल्पिक तरीकों के विपरीत कई ऊतकों का अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति देता है। यह इसलिए, उपास्थि के संबंध में पेशी लगाव अंक पर प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान कर सकते हैं। कशेरुकी मॉडलों के बीच zebrafish विशेष रूप से आनुवंशिक और औषधीय हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी हैं। zebrafish के लिए एफई मॉडल की पीढ़ीcraniofacial उपास्थि अब बायोमैकेनिक्स और संयुक्त morphogenesis में आनुवंशिकी के बीच परस्पर क्रिया के आगे के अध्ययन की संभावना को खोलता है।
एक एफई मॉडल बनाने की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक नंबर रहे हैं; पहली प्रणाली का एक सटीक तीन आयामी प्रतिनिधित्व पैदा कर रहा है। यह स्पष्ट रूप से सीमाओं को परिभाषित करने के लिए पर्याप्त उच्च संकल्प पर इमेजिंग की आवश्यकता है। ध्यान दें कि यहां तक कि उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ एक अच्छा सतह से एक कुछ क्षेत्रों को सुचारू करने के लिए हो सकता है बनाने के लिए। एक और महत्वपूर्ण कदम लोड और सही बाधाओं का सही स्थान को परिभाषित है। एक अपर्याप्त विवश मॉडल हल करने के लिए असफल हो जायेगी और लोड की गलत नियुक्ति असामान्य आंदोलन के कारण होगा।
के रूप में एक सतह कच्चे डेटा से उत्पन्न जाल (चित्रा 2 बी) के लिए मुश्किल होगा कच्चे डेटा के कुछ प्रसंस्करण (चित्रा 2) आवश्यक है। हम डेटा एक गाऊसी फिल्टर का उपयोग (चित्रा -2 सी फ़िल्टर
यह वहाँ हमेशा एक काल्पनिक मॉडल और एक के लिए सीमाएं हैं कि याद रखना महत्वपूर्ण हैssumptions एफई मॉडल को चलाने के लिए बनाया है। जब केवल एक या नमूनों की एक छोटी संख्या मॉडलिंग यह सुनिश्चित करना है कि एक प्रतिनिधि नमूने के रूप में वहाँ व्यक्तियों के बीच छोटे बदलाव होने की संभावना है चुना जाता है महत्वपूर्ण है। के रूप में केवल जबड़े तत्वों और मांसपेशियों के कुछ शामिल थे, मॉडल zebrafish craniofacial musculoskeletal प्रणाली का एक सरल संस्करण है। इसलिए, बाधाओं जहां मॉडलिंग की जबड़े तत्वों खोपड़ी के आराम के साथ कनेक्ट होता है के लिए खाते में करने के लिए तैनात किया जा सकता था और मॉडल कृत्रिम रूप से केंद्र में विवश किया गया था 'अंतरिक्ष' में यह तय करने के लिए। इस कृत्रिम बाधा व्याख्या मॉडल ceratohyal के रूप में खुद का विश्लेषण नहीं किया गया था से तैयार की गई पर कोई असर नहीं था। Craniofacial संरचना के अधिक का समावेश है, ऐसे sternohyals और उसके संलग्न उपास्थि 23, के रूप में विशेष रूप से अन्य जबड़े की मांसपेशियों को खोलने के मॉडल को जोड़ा जा सकता था, लेकिन सीमाओं सीमित तत्व सॉफ्टवेयर में चलाने के लिए बड़े मॉडलों की क्षमता शामिल है।
एस = "jove_content"> एक और सीमा है कि हम बंधन प्रविष्टि मॉडलिंग की नहीं है, हालांकि इस स्प्रिंग्स 8 की प्रविष्टि के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इस मामले में किए गए एक अन्य धारणा है कि मॉडल रैखिक व्यवहार होता था। मॉडल पर स्ट्रेन के परिमाण प्रकाशित मॉडल में उन लोगों के बराबर थे और दबाव से 3500 के नीचे और कमी और मांसपेशियों लगाव अंक से अलग -5000 μɛ ऊपर होने के साथ इन विट्रो कोशिकाओं 10,24 के लिए आवेदन किया। इसलिए, मॉडल के संबंधित क्षेत्रों में उपभेदों एक सीमा एक रेखीय मॉडल के लिए स्वीकार्य भीतर समझा रहे थे। उपास्थि एक रेखीय सामग्री के रूप में पूरी तरह से व्यवहार नहीं करता है और पहले एक poroelastic सामग्री है, जो मॉडल 25 में तरल पदार्थ व्यवहार के विश्लेषण के लिए सक्षम के रूप में मॉडलिंग कर दिया गया है। स्थानीय नोड्स के एक समूह के बीच पेशी लगाव अंक फैल शिखर बलों वितरित होगा और अधिक सही कुछ मांसपेशियों के लिए पेशी प्रविष्टि प्रतिनिधित्व करते हैं।
ईएनटी "> फ़े के उपयोग हम zebrafish के लिए एफईएस का निर्माण करने के लिए कैसे का वर्णन तनाव और तनाव एक संरचना पर अभिनय के एक आकलन के लिए अनुमति देता है। एक तकनीक के रूप में यह अक्सर हड्डी रोग, जीवाश्म विज्ञान और अधिक हाल ही में विकास जीव विज्ञान सहित कई बायोसाइंस विषयों में प्रयोग किया जाता है। यहाँ निचले जबड़े। भविष्य में इन मॉडलों, पूरे जबड़े को देखने के लिए तालू सहित बढ़ाया जा सकता है। इसी तरह की तकनीक मछली में रीढ़ की हड्डी में बायोमैकेनिक्स, तिथि करने के लिए ज्यादातर विज्ञान सम्बन्धी तरह से अध्ययन किया गया है, जो मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
अंजीर 3-5 में कुछ डेटा J.Biomech, 48 (12), खामियाजा एट अल। से reprinted किया गया है, परिमित तत्व मॉडलिंग जबड़े विकास, 3112-22 में मांसपेशियों में तनाव की कमी के कारण संयुक्त आकार और सेल व्यवहार में परिवर्तन भविष्यवाणी की है। 2015, Elsevier 15 से अनुमति के साथ।
Acknowledgments
एलएचबी वेलकम ट्रस्ट गतिशील सेल पीएचडी कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था; KAR एमआरसी परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया एमआर / L002566 / 1 (Ejr और CLH करने के लिए सम्मानित किया गया) और CLH ARUK अनुदान 19479. द्वारा वित्त पोषित किया गया हम भी इमेजिंग सलाह के लिए वोल्फसन Bioimaging सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coll2 | Abcam | ab34712 | Type II collagen antibody - stains all cartilage |
| A4.1025 / MF20 | Developmental studies hybridoma bank | A4.1025 | Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle |
| Low melt agarose | Sigma | A9414-5G | For mounting zebrafish |
| MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate ) | Sigma | E10521-10G | To make anesthetic |
| Trypsin | Fisher | T/3760/48 | sample permeablilisation |
| Dylight 488 Mouse IgG | Thermofisher | 35502 | Secondary antibody |
| Dylight 550 Rabbit IgG | Thermofisher | 84541 | Secondary antibody |
| SP8/SP5 or SPE confocal | Leica | For imaging | |
| LAS Leica capture software | Leica | Imaging software | |
| Aviso (version 7.0.0) | FEI Visualization Science Group | 3D image analysis software (Section 2) | |
| Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10) | Altair Engineering | FE model generating software (Section 4-5) | |
| Abaqus (version 6.14) | SIMULIA | FE analysis software (Section 5.7-5.8) |
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