Introduction
Finita Element (FE) modellering är en ingenjörsteknik som beräknings kan beräkna och kartlägga omfattningen och lokaliseringen av stammar som verkar på en struktur 1. Modellen består av 3D-strukturen, som representeras av ett nät av "Finite Element", och slutresultatet av analysen regleras av ett antal faktorer, inklusive strukturen och antalet element i maskorna, storleken och lokaliseringen av den mekaniska laster och materialegenskaper. Materialegenskaper beskriva vissa aspekter av ett materials beteende under en viss typ av last; Youngs modul (E) beskriver elasticiteten hos materialet medan Poissons tal beskriver den proportionella minskningen i bredd hos ett material att dess längd när ett prov sträcks. FE modellering kan användas för att beräkna en mängd olika variabler, inklusive förskjutning, stress, tryck och påfrestningar som verkar på modellen genom att ta hänsyn till de unika indata om strukturen '; S form, placering och storlek av laster och de specifika materialegenskaper.
FE modellering används ofta inom teknik 2 och alltmer för ortopediska 3 och paleontologiska tillämpningar 4. I utvecklingen biomekaniska krafter är kända för att fungera som en stimulans i många celler för att aktivera cellsvar 5-8 och det är lämpligt att förutsäga både de relativa positionerna och storlekarna av mekaniska stimuli inom utveckling av organsystem, men för närvarande FE modellering har använts i liten utsträckning för zebrafisk utveckling.
Både brosk och ben har visats vara mechanosensitive material. Till exempel har in vitro-kompression befunnits aktivera kondrogena vägar, medan spänningen har visat sig vara nödvändigt för benbildning 9. FE-analys (FEA) har utnyttjats för att modellera stammar som verkar på biologiska prover, inklusive de som agerar på skelettelementen under ben formation 10. Andra utvecklings applikationer inkluderar dess användning för att förutsäga formen av en fog efter att den har utsatts för teoretiska biomekaniska krafter 11,12 och för att visa mönstret av stammar närvarande under chick knäleden morfogenes 8.
Detta protokoll syftar till att dela erfarenheter att generera 3-dimensionella ytor, maskor och finita elementmodeller från konfokala bilder i syfte att förstå mekaniken i utvecklings vävnader. Vi visar också metoder för att validera FE modellerna även fånga verklig gemensam förskjutningsinformation in vivo. Samtidigt som vi använder zebrafisk käken som en förebild samma teknik kan användas på alla små biologiskt system som 3D-information om strukturen i muskuloskeletala systemet kan erhållas genom konfokala eller multifoton avbildning.
Protocol
Alla steg i protokollet följer University of Bristol djuromsorg och djurskyddsriktlinjer och de av den brittiska inrikesdepartementet.
1. Visualisering av Musculoskeletal anatomi
OBS: För att visualisera formen av skelettelement, att kvantifiera muskler och för att identifiera den exakta placeringen av muskelfästen, immunostain (avsnitt 1.1) fisk vid lämplig ålder för skelett myosin (som avslöjar muskel) och typ II kollagen (att visualisera brosk). Alternativt, visualisera muskuloskeletala anatomi med hjälp av transgena fluorescerande reporter linjer såsom kollagen a1 reporter col2a1: mCherry 13,14 för att visualisera brosk och den långsamma myosin tung kedja reporter smyhc: GFP 15 att visualisera placeringen av muskelfästen (avsnitt 1.2).
Alternativa linjer som markerar brosk och muskler kan fungera lika bra.
- fluorescerande Immunostaining
- Fixa larv överstigande 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 1 timme. Tvätta i PBS med 0,1% Tween 20 (PBT) och dehydratisera i 50% metanol (MeOH) i PBT och 100% MeOH under 5 minuter respektive.
Varning: PFA är giftig och bör hanteras i enlighet med materialsäkerhetsbladet.
OBS: Larva kan lagras i 100% MeOH tills de behövs. - Rehydrera larv i 50% MeOH i PBT under 5 min. Tvätta i PBT under 5 min.
- Permeabilisering larv i 0,25% trypsin i PBT på is under 5-6 minuter. Tvätta i 4x PBT under 5 minuter vardera.
- Block för 2-3 timmar i 5% serum i PBT.
- Inkubera larv i det rekommenderade spädning av kanin-anti-typ 2 kollagen och mus-anti-myosin antikroppar i 5% serum i PBT under 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
OBS: Det rekommenderade utspädningsområde är normalt på antikroppsbladet. Välj antikroppar som riktats mot olika arter med varandra och som också diffehyra ut till vävnaden. - Tvätta larv 6x för 15 minuter i PBT.
- Blockera under 1-2 timmar i 5% serum i PBT.
- Inkubera i sekundära antikroppar i mörker. Använda fluorescensmärkt anti-mus (550) och anti-kanin (488) sekundära antikroppar vid en lämplig spädning i 5% serum och PBT för den specifika antikroppen.
- Tvätta 6X under 10 minuter vardera i PBT och bild på en 10X konfokalmikroskop så snart som möjligt.
- Fixa larv överstigande 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 1 timme. Tvätta i PBS med 0,1% Tween 20 (PBT) och dehydratisera i 50% metanol (MeOH) i PBT och 100% MeOH under 5 minuter respektive.
- Imaging Musculoskeletal Geometri
- Montera larverna ventralt på en täck i ljummet 0,3-0,5% låg smältpunkt (LMP) agaros i Danieau lösning 16.
OBS: Transgen fisk måste vara sövd i 0,02% MS222 (Tricaine metansulfonat, pH 7) före montering och under avbildning. - Ta en konfokala bildstapel av regionen av intresse med hjälp av 10X objektiv och ungefär 2,5X digital zoom. Förbered bilder av gröna och röda kanal med 488 nm och 561 nm lasrar respektive. Bild på en 512 x 512 pixlars upplösning med ett intervall mellan z plan 1,3 pm och 3 genomsnitt linjer. Den resulterande stapeln kommer att bestå av cirka 100 z skivor.
- Exportera data som en TIFF-serien. Maximala projektioner av de muskler och brosk element från en 5dpf zebrafisk larv visas i figur 1.
- Montera larverna ventralt på en täck i ljummet 0,3-0,5% låg smältpunkt (LMP) agaros i Danieau lösning 16.
2. Generera en 3D-yta
- Välj en representativ datamängd för varje tidpunkt på 3, 4 och 5 dpf (välj efter visualisering av flera prover).
- Öppna 3-dimensionell tiff stack och välja alla kanaler i analysprogram. Högerklicka på brosk kanal och välja bildfilter och utjämning: Gauss (Figur 2B).
- I projektet visa högerklicka på filtrerade bilden och välj "bildsegmentering" och sedan "redigera ny etikett". Skapa en ny etikett för varje material, det vill säga, brosk och joint. Välj broskområdet av bilden (Figur 2C, vit signal, lila kontur) med trollstaven. Använd borste för att ta bort brus från konturerna.
OBS: Om du använder trollstaven, klicka på "Alla skivor". - Välj fogområdet med penseln och tilldela en gemensam komponent (Figur 2C, blå kontur)
- Släta flera segment på en gång genom att välja segmente i toppmenyn och mjuka etiketter. Högerklicka på bilden och välj skapa yta för att producera en 3D-yta framför komponenten (figur 2D).
- Klicka på ytan och spara data som en hmascii fil för import till samordnade program.
3. Beräkning av Muscle makten att användas i FE Model
- Räkna antalet muskelfibrer från konfokala bilder av smyhc: GFP transgena zebrafisk (Figur 1A, pilspets, 1C) och mät diameter av fibrerna för att beräkna sin tvärsnittsarea (πr 2).
- Identifiera lämplig kraft per muskel ytenhet från litteraturen. Den maximala muskelkraft som genereras per ytenhet för larver zebrafisk skelettmuskler (40 nN / pm 2) användes 17.
- Beräkna krafter för varje anatomisk muskelgrupp genom att multiplicera antalet fibrer och deras område av kraften per ytenhet. Se tabell 1.
4. Generera en Mesh
- Importera 3D-modellen som genereras i avsnitt 2 (ovan) i ett mjukvarupaket som kan generera en finita element mesh.
- Generera A2D maska i brosk och ledytor med hjälp av krympplast verktyget under 2D-menyn. Välj en lämplig del storlek.
Obs! Använd ett element storlek mellan 1,5-2,5. Om det behövs, generera en rad olika storlek 2D yta maskor att utföra 3D-nät optimering (avsnitt 4.4). - Utför mesh kvalitetskontroller som finns under "2D> Verktyg> Kontrollera element panel för att kontrollera dubbla element, insättningar och genomföringar i nätet. Fix torsionsvinkel med hjälp av fliken verktyget i modellträdet.
- Skapa en 3D-nät från 2D yta maskor av olika inslag storlek med 3D> Tetramesh panelen.
OBS: jämföra resultaten av olika maskstorlekar och välj FE modellen med den lägsta maskstorlek som konvergerar efter ytterligare simuleringar och kompromissar inte funktionen definition. Exemplet i figur 3 innehåller 1,5 miljoner tetraedriska element för underkäken brosk och hade en 2D elementstorlek på 2,0. - Omvandla nätet så käkmodellen att skala enligt konfokala stacken genom att använda Geometry> Avstånd panelen.
OBS: Se till att brosk och gemensamma komponenter är anslutna i modellen genom att exportera en sammanslagen modell eller med hjälp av band.
5. Finita Element Model Construction
- Använda kommersiella finita element (FE) programvara, skapa en FE modell. Använda 3D muskler och brosk märkt konfokala staplar genereras i avsnitt 1 som en guide, tilldela noder som motsvarar muskel fästpunkter. Skapa en vektor mellan två noder som representerar ursprunget och insättning av varje muskel (Figur 3).
- Skapa en laddkollektor av typen "historia" för att tillämpa en C belastning "för varje muskel. Ange storleken i Newton (beräknat i steg 3,3) och tilldela den associerade vektorn. Figur 3 visar fästpunkterna för adductor mandibulae (AM), gradskiva hyoideus (PH) och intermandibularis (IM).
NOTERA: För dessa käkmusklerna är maximal sammandragande kraften fördelas mellan origo och insättning så att endast 50% av varje belastning appliceras på varje plats. - Tilldela lämpliga elastiska isotropa materialegenskaper enligt bestämning genom litteraturen. Youngs modul för broskoch Interzone i denna modell var 1,1 MPa och 0,25 MPa respektive och Poissons tal var 0,25 för både 18,19.
- Skapa en laddkollektor av typen "gräns" för att tillämpa initiala begränsningar på modellen. Gå till fliken Analys> Begränsningar och i skapa panelen, plocka noderna på den modell du vill begränsa. Välj de frihetsgrader (DOF) som begränsar rörelsefriheten för modellen till bästa tillnärmning av dess naturliga rörelseomfång.
OBS: Modellen i Figur 3 begränsades i alla rörelseaxlar (DOF: 1, 2, 3 representerar x, y och z, respektive) vid ceratohyal för att förankra den i rymden vid en mittpunkt i modellen och i y- och z-axeln vid den punkt där den palatoquadrate ansluter till resten av zebrafisk skallen (figur 3, tabell 1). Modellen måste begränsas i alla tre DOF i minst en nod. - Skapa en "Load steg", för varje typ av rörelse som du vill simulåt (dvs öppning, stängning), under analysmenyn och välj alla relevanta laster (gjorda i avsnitt 5.2) och begränsningar (som i avsnitt 5.4) för att simulera denna rörelse. Välj "Static" från rullgardinsmenyn när den visas.
- Export modell inklusive mesh, laster, begränsningar och materialegenskaper i en lämpligt filformat, i det här fallet ".inp" format.
- Belastning modell i FE analysprogram. Skapa och köra ett jobb för modellen med jobbmodul.
- Analysera utgång för spänning, töjning, förskjutning, etc. finns i resultatfliken och visualisering menyn (Figur 4 och 5).
6. Validering av Jaw Deformation / Displacement Avstånd
- Välj 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) transgen zebrafisk.
- Lätt söva larver med 0,02% MS222 tills de upphör att svara att röra men deras hjärtan är fortfarande slår.
- Monteralarverna i sidled (medan sövda) på täck i ljummet 1% LMP agaros (som består i Danieau lösning).
- Ta agarosen från runt huvudet och käken med pincett.
- Spola färsk Danieau lösning (utan MS222) över huvudet på larven att avlägsna anestesi med hjälp av en pasteurpipett till dess att normal munrörelser återupptas.
- Använd film fånga programvara för att ta ljusfält höghastighets videor av munrörelser. Ta filmer på cirka en minut varaktighet på högsta bildhastighet, eller tillräckligt för att spela in flera cykler av käken öppning.
- Välj ramar som visar käken öppen till sin maximala förskjutning. Mäta avståndet mellan den främre spetsen av Meckels brosk och den övre käften (spets ethmoid platta) i ^ m.
- Beräkna den genomsnittliga förskjutningen av multipel fiskyngel.
- Extrahera förskjutningsdata från modellen. Använd den genomsnittliga förskjutningen beräknas 6,8 att kontrollera modell förskjutning beteende (
Representative Results
Immunfärgning för muskel (figur 1 A) och brosk (Figur 1B) eller avbildning av transgena reportrar (Figur 1C) kan 3D-strukturen i käken som skall visualiseras, tillsammans med den tillhörande muskulatur. Genom avbildning med hög upplösning var det möjligt att bygga en modell som fångar både den tredimensionella formen hos käken (figur 2) och platsen och placering av laster (Figur 3). Med hjälp av in vivo förskjutningar sett genom hög hastighet spela in video (Figur 4) verifierade vi att rörelseomfång i modellen var inom en realistisk intervall.
Fe modeller gång körningen kan användas för att visa en rad av data, såsom stress (figur 5A), lägsta och högsta huvudstammen (Figur 5B - K). Dessa resultat är tre-dim ensional så modellen kan förstoras för att se fina mönster detalj (figur 5E, 5i) roteras för att få relevanta synpunkter (figur 5F, 5G, 5J, 5K) och digitalt sektione (Figur 5E ", 5E '', 5I", 5I '') för att visa hur mönster av stress, stam eller tryckförändring i hela modellen. Det är också möjligt att extrahera kvantitativa data från modellen (ej visad). Genom att verifiera modellen och med de mest exakta materialegenskaper, laster och mesh form FE-modellen kan användas för att utforska den bästa uppskattningen av den mekaniska miljön upplevs av celler under fönstret utveckling. Resultaten av modellen kan direkt jämföras med förändringar i cellulär beteende och genuttryck 20.
re en "src =" / filer / ftp_upload / 54.811 / 54811fig1.jpg "/>
Figur 1:. Representativa bilder av muskuloskeletala element i zebrafisk käken vid 5 dpf Representativa konfokala högar av underkäken av 5dpf larver alla visat med främre till toppen (A) Immunfärgning för A4.1025 som fläckar skelett myosin (B) Immunfärgning för typ II kollagen som markerar alla brosk (C) Stack från en levande larv som uttrycker de transgena reportrar col2a1: mCherry märkning brosk (röd) och smyhc: GFP långsam muskel (grön). IA: intermandibularis främre, PH: gradskiva hyoideus, AM: adductor mandibulae, HI: hyoideus sämre, HI: hyoideus överlägsen, CH: sternohyoideus, MC: Meckels brosk, PQ: Palatoquadrate, CH. Ceratohyal Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Framställning av en 3D-yta från konfokala uppgifter bilder som visar övergången från konfokala data till en 3D-yta för zebrafisk käken med högre förstoring av det gemensamma området.. (A) Rå konfokal data; (B) Dataset efter applicering av en Gauss-filter; (C) Filtrerat kontur; (D) 3D-yta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa maskor som visar begränsningar och kraftvektor Representativa maskor för en 5 DPF larv för (A) mun stängning och.(B) munöppning. Vita prickar betecknar platser där modellen är begränsad och i vilken dimensionerna (t.ex., x och y eller x, y och z). Vita linjer betecknar muskel positioner, med vektorn av muskelstyrka betecknas med vita pilar. Red visar brosk och gult i Interzone. Denna siffra har modifierats kompletterande material som tidigare publicerats i Brunt et al. 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Känslighetstestning FE-modell simulerar käke förskjutning i 5dpf zebrafisk för olika brosk och Interzone Youngs moduler. Käke förskjutning (öppet till stängt i um) är markerad på käften; spelats in med färgknappen. Varje modell (A - L) har en annan kombination av brosk (c = 1,1, 3,1, eller 6,1 MPa) eller Interzone (i = av 0,25, 0,5, 0,75, eller 1 MPa) egenskaper. Horisontell svarta pilen belyser värdet av käken förskjutning vid spetsen av Meckels brosk (representerad av den vertikala svarta pilen). M och N stillbilder från videor från 5 DPF larver visar minimum, dvs käken stängd (M) och maximal, dvs käke helt öppen (N) med de två överlagrade (O) - vit linje på O representerar förskjutningen (43 nm). I detta fall relativt brosk egenskaper 1.1 med en Interzone 0,25 (A) bästa matchningen förskjutningarna ses i levande fisk (O). Paneler AL i denna siffra har tidigare publicerats i al. Brunt et 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa data från FE modeller FE-simuleringsmodellen av alla muskler som används i en 5 DPF larv (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) Minsta Principal stam (E Min. P, μɛ) (C) Max huvudstam (E Max. P., μɛ). FE-simuleringsmodell av maximala och minimala huvudstammar under käken öppning. (D - K): Maximal huvudstam (. E Max P., μɛ) i (D) ventrala käken visa och (E) ventrala samsyn (E) visar platsen för proximala-distala sektioner genom Meckels brosk leden och Interzone i (E ') och (E' '), respektive. (F): lateralakäke vy. (G): lateral gemensam uppfattning. (H - K): Minst Principal stam (. E Min P, μɛ) i (H) ventrala käken visa och (I) ventrala samsyn. (I) visar lokaliseringen av de proximala-distala sektioner genom Meckels brosk leden och Interzone i (I ') och (I' ') resp (J): lateral vy käken. (K): laterala leden vy. Denna siffra har tidigare publicerats i al. Brunt et 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antalet muskelfibrer | Muskelfiberområdet (xm 2) | Muskelgrupp area (im2) | Force (N) | |
| 5 dpf intermandibularis anterior | 5 | 23,8 | 119 | 4.76e-6 |
| 5 dpf gradskiva hyoideus | 6 | 23,8 | 142,8 | 5.71e-6 |
| 5 dpf adductor mandibulae | 9 | 23,8 | 214,2 | 8.57e-6 |
Bord 1: Muskel kvantifiering. Beräknad genomsnittlig muskelkrafter för Intermandibularis Anterior, Adductor Mandibulae och Protractor Hyoideus vid 5 dpf användning av 40 nN / um 2 (värde per ytenhet tas från referens 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).
Discussion
Finita elementmodeller har använts för att relatera områdena skelett element som är under press med de som genomgår benbildning 10, samt att kartlägga de områden som påfrestningar under endokondral benbildning och gemensam morfogenes 8,12,21. Andra studier har också kunnat tillämpa teoretiska tillväxtmodeller att replikera förändringar under gemensam utveckling 11,12. Här visar vi protokollet för att bygga FE-modeller för ett relativt enkelt system, zebrafisk käften 20. Till skillnad från alternativa metoder för att samla in råbilder för FE-modeller, såsom CT-scanning 22, konfokal avbildning av transgena linjer eller immunzebrafisk möjliggör för flera vävnader som skall studeras. Det kan därför ge direkt information om muskel fästpunkter i förhållande till brosk. Bland ryggradsdjur modeller zebrafisk är särskilt mottagliga för genetisk och farmakologisk manipulation. Genereringen av FE-modeller för zebrafiskkraniofaciala brosk öppnar nu upp möjligheten att ytterligare studier av samspelet mellan biomekanik och genetik i joint morfogenes.
Det finns ett antal kritiska steg i processen för att skapa en FE modell; den första är att generera en exakt tredimensionell representation av systemet. Detta kräver avbildning vid tillräckligt hög upplösning för att tydligt definiera gränser. Observera att även med hög upplösning avbildning för att göra en bra yta man kan ha för att jämna ut vissa regioner. Ett annat kritiskt steg är att definiera den korrekta placeringen av lasten och korrigera begränsningar. En otillräckligt begränsad modell kommer inte att lösa och felaktig placering av lasterna kommer att orsaka onormala rörelser.
Viss bearbetning av de rådata (figur 2) är nödvändig som en yta genererad från rådata skulle vara svårt att mesh (Figur 2B). Vi filtrerade data med hjälp av en Gaussfiltret (Figur 2C
Det är viktigt att komma ihåg att det alltid finns begränsningar för en hypotetisk modell och enssumptions gjorde att köra FE modeller. När endast modellering en eller ett litet antal prover är det viktigt att se till att ett representativt urval väljs som det kommer sannolikt att vara små variationer mellan individer. Eftersom endast en del av klämskänkelelementen och muskler ingick, är modellen en förenklad version av zebrafisk kraniofaciala muskuloskeletala systemet. Därför måste begränsningar som ska positionerat för att redogöra för var de modellerade klämskänkelelementen skulle ansluta med resten av skallen och modellen artificiellt begränsas i mitten för att fixa det i "utrymme". Denna artificiella restriktion inte påverka tolkningen dras från modeller som ceratohyal själv inte analyserades. Införandet av flera av de kraniofaciala struktur, kan i synnerhet andra käken öppna muskler såsom sternohyals och dess anslutna brosk 23, har lagt till modellen, men begränsningar inkluderar möjligheten av större modeller köras i finita element program.
s = "jove_content"> En annan begränsning är att vi inte har modellerade ligament insertion, även om detta skulle kunna uppnås genom införande av fjädrar 8. En annan antagande i detta fall var att modellen skulle bete sig linjärt. Storlekarna på påfrestningar på modellerna var jämförbara med dem i publicerade modeller och tillämpas in vitro celler 10,24, med stammar som under 3500 och över -5000 μɛ bortsett från tvång och muskel fästpunkter. Därför var stammarna på de relevanta områdena av modellen bedöms inom ett område acceptabelt för en linjär modell. Brosk inte beter sig helt som en linjär material och har tidigare modelleras som en poroelastic material, vilket möjliggjorde analys av vätskan beteende i modellen 25. Sprida muskel fästpunkter bland ett kluster av lokala noder skulle fördela toppkrafter och mer exakt representera muskel isättning för vissa muskler.
ent "> Användning av FE tillåter en bedömning av stammarna och spänningar som verkar på en struktur. Som en teknik det ofta används i många biovetenskap discipliner, inklusive ortopedi, paleontologi och mer nyligen utvecklingsbiologi. Här beskriver vi hur man bygger stiftelser för zebrafisk käken. i framtiden dessa modeller skulle kunna utvidgas för att titta på hela käken, inklusive gommen. Liknande tekniker kan användas för att modellera spinal biomekanik i fisk, som hittills har mestadels studerats genom kinematiska medel.Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Vissa uppgifter i figurerna 3-5 har tryckts från J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., Förutspår Finita elementmodellering förändringar i gemensam form och cellens beteende på grund av förlust av muskelbristning i käken utveckling, 3112-22. 2015, med tillstånd från Elsevier 15.
Acknowledgments
LHB har finansierats av Wellcome Trust Dynamic Cell forskarutbildningen; KAR har finansierats av MRC projektbidrag MR / L002566 / 1 (tilldelas Ejr och CLH) och CLH finansierades av Aruk bidrag 19479. Vi vill också tacka Wolfson Bioimaging anläggning för avbildning råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coll2 | Abcam | ab34712 | Type II collagen antibody - stains all cartilage |
| A4.1025 / MF20 | Developmental studies hybridoma bank | A4.1025 | Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle |
| Low melt agarose | Sigma | A9414-5G | For mounting zebrafish |
| MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate ) | Sigma | E10521-10G | To make anesthetic |
| Trypsin | Fisher | T/3760/48 | sample permeablilisation |
| Dylight 488 Mouse IgG | Thermofisher | 35502 | Secondary antibody |
| Dylight 550 Rabbit IgG | Thermofisher | 84541 | Secondary antibody |
| SP8/SP5 or SPE confocal | Leica | For imaging | |
| LAS Leica capture software | Leica | Imaging software | |
| Aviso (version 7.0.0) | FEI Visualization Science Group | 3D image analysis software (Section 2) | |
| Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10) | Altair Engineering | FE model generating software (Section 4-5) | |
| Abaqus (version 6.14) | SIMULIA | FE analysis software (Section 5.7-5.8) |
References
- Rayfield, E. J. Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).
- Rao, S. S. The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).
- Taylor, M., Prendergast, P. J. Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities. J Biomech. 48, 767-778 (2015).
- Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments. Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).
- Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension. Dev biol. 370, 154-163 (2012).
- Rolfe, R. A., et al. Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways. BMC genomics. 15, 48 (2014).
- Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint. J Biomech. 44, 143-149 (2011).
- Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli. Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).
- Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones. J Biomech. 41, 249-258 (2008).
- Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis. J Biomech. 47, 989-995 (2014).
- Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis. J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).
- Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling. Development. 136, 3991-4000 (2009).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).
- Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity. Development. 135, 2115-2126 (2008).
- Danieau's solution (30×). Cold Spring Harb Prot. , pdb.rec12467 (2011).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).
- Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse. J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).
- Tanck, E., et al. The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone. Bone. 35, 186-190 (2004).
- Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development. J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).
- Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos. PloS one. 6, e17526 (2011).
- Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium. Peer J. 3, 1294 (2015).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo. Development. 124, 2945-2960 (1997).
- Dowthwaite, G. P., et al. A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation. Matrix biol. 22, 311-322 (2003).
- Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. Poroelasticity of cartilage at the nanoscale. Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).
