A confirmação da Isquemia Miocárdica e reperfusão em ratos usando Pad Superfície Eletrocardiografia

Summary

During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.

Abstract

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.

Introduction

A doença cardíaca continua a ser a principal causa de morte em todo o mundo ^1,2. Não só é o ventrículo esquerdo (VE) da câmara mais muscular, responsável pelo bombeamento de sangue do coração para o corpo inteiro ^3, é um comum local da lesão cardíaca pós-enfarte do miocárdio ^4. morte do tecido ventricular esquerda muitas vezes resulta em insuficiência cardíaca sistólica. modelos animais de doença cardíaca são fundamentais para o avanço da pesquisa cardiovascular biomédica. A estirpe C57BL / 6 de camundongos têm sido uma escolha popular para modelos animais devido ao seu tempo de reprodução rápida, de baixo custo e facilidade de alterações genéticas. A maioria dos modelos cirúrgicos murinos para o estudo de doenças cardíacas envolvem a oclusão da LAD ramo da artéria coronária esquerda. A LAD é chamado às vezes à esquerda obtusa marginal ^5,6. O LAD fornece sangue ao anterior do ventrículo esquerdo e as paredes ântero-lateral. estudos de oclusão LAD visam induzir infartos anteriores, às vezes estendendo-se into das regiões de parede inferior e lateral ^7.

Dois modelos que são usados ​​com freqüência para estudos de infarto do miocárdio incluem infarto do miocárdio oclusão crônica e lesão de isquemia / reperfusão do miocárdio. A oclusão crônica é criado por sutura cirúrgica ao redor e bloquear permanentemente o fluxo de sangue através do LAD. A lesão de isquemia / reperfusão é criado muito da mesma maneira única com um transiente, geralmente 30-60 min, período isquémico. Para alcançar a isquemia transiente, os laços de oclus de sutura em torno do LAD e um tubo de PE-10 pequeno que é colocado paralelamente à ADA na superfície do epicárdio do coração, seguido por um período de reperfusão em que a tubagem e a oclusão de sutura é retirado e o sangue é deixado fluir uma vez mais através da artéria e no miocárdio. A cirurgia de isquemia / reperfusão foi considerado clinicamente relevante devido à natureza da lesão de reperfusão em paralelo com o tratamento de enfartes do humanos, que inclui promangioplastia pt coronariana e implante de stent da artéria, ou cirurgia de revascularização. Tipicamente, durante estas cirurgias, isquemia do VE em um coração de rato é confirmada pela palidez visível da parede miocárdica. No entanto, simplesmente realizando as cirurgias em uma almofada de eletrocardiograma (ECG) em condições de monitoramento constante, mudanças visíveis pode ser observada na forma de onda ECG, confirmando assim isquemia e reperfusão do miocárdio mouse.

Embora o coração de murídeo é semelhante ao coração humano em muitos aspectos, incluindo a sua estrutura de quatro câmaras, os corações também têm diferenças. Uma diferença óbvia é a frequência cardíaca média de repouso de camundongos adultos é de 600 – 700 batidas por minuto (bpm), enquanto que a dos humanos adultos é ~ 60-100 bpm ^8,9. Além disso, em ratinhos, as ondas de repolarização J e t, frequentemente fundir-se com o QRS complexo despolarização fazendo uma clara do segmento ST difícil discernir ^10. Para complicar o processo de electrocardiographicallY confirmando isquemia do miocárdio, é a elevação da onda T e do segmento ST, que são utilizados como marcadores para o diagnóstico de lesão de isquemia e enfarte do miocárdio em seres humanos, clinicamente referido como ST E levation m yocardial i nfarction ou IAM. Uma das principais diferenças entre as formas de onda humana e murina é que o S-onda é imediatamente seguido ser um J-ondas que transfere diretamente para uma onda T negativa. Durante a isquemia miocárdica aguda em ratos diminui a amplitude da onda S e é directamente seguida por uma J-onda anormal e uma onda T invertido ^11. A onda T não parece representar uma parcela significativa da repolarização em ratos ^11. Apesar de nomenclatura e rato vs. diferenças humanas, ECG confirmação da isquemia miocárdica murino e reperfusão é ainda viável e relativamente simples. Por uma questão de simplificação da interpretação da forma de onda, o segmento entre o SJT é referido como ST-SEGMENT aqui.

EAMCEST orientações publicadas em 2013 recomendar um tempo paciente porta-para-balão inferior a 90 min ¹² .Este significa que o período de tempo desde a identificação de oclusão da artéria coronária do paciente até que a artéria é reaberto deve ser inferior a 90 min. O coração batendo está trabalhando constantemente e, portanto, tem um alto metabolismo oxidativo e um alto nível de consumo de oxigênio ^3. Para proporcionar esta, uma rede de capilares é acessível a cada um dos miócitos ^3. Leva apenas um coração alguns batidas de esgotar seu oxigênio e nutrientes. Em uma janela de 90 minutos, uma região isquêmica do coração em um ser humano terá sido impedido de receber entre 5.400 e 9.000 coração bate pena de sangue rico em oxigênio. Nessa mesma janela de 90 minutos, um rato teria 54.000 para 63.000 batimentos cardíacos. Os pontos de tempo experimentais para a lesão de isquemia / reperfusão murino são tipicamente entre 30 e 60 min.

A importância de desenvolvering um método complementar de confirmar isquemia do miocárdio e reperfusão num modelo murino tem profundas implicações sobre a consistência e reprodutibilidade dos dados em estudos de isquemia / reperfusão miocárdica. A prática corrente de se observar visualmente o coração por uma mudança na cor do tecido não é adequada como um stand-alone de diagnóstico. Além disso, a reperfusão após a remoção do tubo de sutura e não é garantida. Embora a artéria não está mais ligada off, a artéria pode ter danos sofridos durante o procedimento e pode tornar-se impossível de reperfusão. Seria benéfico para ter um registro de alterações eletrocardiográficas para confirmar reperfusão em vez de confiar em observações de palidez do miocárdio e rubor (cor vermelha). Corações que não mostram os marcadores de lesão de isquemia / reperfusão pode então ser rapidamente sinalizado e uma decisão sobre como proceder podem ser feitas pelos investigadores.

Por último, o estabelecimento de um registro de ECG muda da linha de base em todo the períodos de isquemia e reperfusão permite aos investigadores continuam a monitorar o coração após a cirurgia inicial. Os investigadores atualmente perder de vista o coração, logo que a cirurgia está concluída. ECG é uma maneira simples para obter insights sobre as mudanças que ocorrem nas horas miocárdio dias após a cirurgia. ECG registrados em pontos de tempo após a cirurgia poderia revelar ondas Q de desenvolvimento tardio indicando continuação ou piora da morte do tecido. No entanto, para calibrar eficazmente novos ou agravamento marcadores eletrocardiográficos, um ECG de base devem estar disponíveis para comparação.

Este protocolo irá demonstrar como preparar, obter e interpretar o ECG para confirmar isquemia e reperfusão do coração mouse usando 8 – do sexo masculino 12 semanas de idade C57BL / 6.

Protocol

Todos os procedimentos cirúrgicos realizados em animais devem ser realizadas de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 13 ou outras diretrizes éticas adequadas. Os protocolos devem ser aprovados pelo comitê de bem-estar animal na instituição adequada antes de prosseguir. 1. Preparação para o ECG NOTA: Antes de começar, don equipamento de protecção individual, incluindo luvas, óculos e um casaco de laboratório limpo …

Representative Results

Um ECG normal de murino é apresentada na Figura 2 com marcadores alfabéticos para eventos eléctricos P, Q, R, S, J e T. P representa a despolarização atrial inicial. QRS é a onda de despolarização ao longo dos ventrículos. J é repolarização precoce e T representa a repolarização heterogêneo também conhecida como recuperação de 11. Deve notar-se que muitos laboratórios não utilizar a nomenclatura J-ondas e não se referem à SJT do segmento …

Discussion

Usando alterações no ECG como um método complementar para confirmar isquemia do miocárdio e reperfusão assegura o posicionamento preciso da ligadura oclusão. Precisão da colocação da ligadura é fundamental para a redução da variabilidade dos dados entre os animais. O LAD em um coração de rato é uma artéria difíceis de visualizar. Portanto, completando palidez visual, com alterações eletrocardiográficas vai ajudar a garantir o correto posicionamento do dano tecidual ligadura e resultante.

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Materials

Vevo 1100	Fujifilm Visual Sonics		Echocardiography Machine
Mouse Handling Plate	Fujifilm Visual Sonics		Heated ECG plate
Signa-Gel			Highly Conductive Multi-
Electrode Gel	Parker	15-25	Purpose Electrolyte
Transpore Medical Tape	3M	1527-0
PI-Spray II	Pharmaceutical Innovations	NDC 36-2013-25	Cleaning agent for ECG plate
C57Bl6 Mice	The Jackson Laboratory	000664	Male, 8-12 wk
IsoThesia-Isoflurane	Henry Schein	NDC 1169-0500-1
Excel	Microsoft
Systane Nighttime Lubricant Eye Ointment	Alcon	65050935
7-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	640.O32
5-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	K809.O32
Surgical Scissors	ROBOZ	RS-5881
Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Gauze	Bio Nuclear Diagnostics Inc	DIS-022B
Needle Holder	Fine Science Tools	12565-14
Buprenex CIII	Patterson Veterinary	0-891-9756	Buprenorphine Hydrochloride Analgesic
Betadine	Purdue Products	67618-150-08