Summary
Den interrenal kjertel i sebrafisk er teleostean motstykket til pattedyr binyrene. Denne protokollen introduserer hvordan å utføre tre-β-hydroksysteroiddehydrogenase (Δ 5-4 isomerase, 3β-Hsd) enzymatisk aktivitetsanalyse, som oppdager differensierte steroidogenic celler i å utvikle sebrafisk.
Introduction
Binyrene, en viktig del av hypothalamo-hypofyse-binyre-aksen, skiller steroider og koordinerer steroid homeostase og kroppslig reaksjon på stress. Binyrene omfatter den ytre cortex, som utskiller steroider i en sone-spesifikk måte, og indre marg, som syntetiserer katekolaminer. Den interrenal kjertel i teleoster er motstykket i binyrene hos pattedyr og er sammensatt av steroidogenic interrenal og chromaffin celler, som er funksjonelle ekvivalenter av binyrebarken og medulla, henholdsvis 1-3. Studier utført ved hjelp av sebrafisk-modellen har rapportert at både steroidogenic og chromaffin celle linjene er dannet av molekylære og cellulære mekanismer sterkt ligner de i pattedyr 1,2. Derfor sebrafisk er en potensielt kraftig modell for å studere genetiske lidelser, nevroendokrin kontroll og systembiologi av hypothalamo-hypofyse-binyre (interrenal) akse.
4,5. 3β-Hsd er viktig for biosynthesizing alle klasser av hormonelle steroider, nemlig progesteron, glukokortikoider, mineralkortikoider, androgener og østrogener. De to menneskelige 3β-Hsd isozymene HSD3B1 og HSD3B2 er forskjellig uttrykt 6. HSD3B1 er uttrykt i morkaken og perifert vev, mens HSD3B2 er uttrykt i binyrebarken og gonadene. Menneskelig HSD3B1 og HSD3B2 er co-ortologer av sebrafisk hsd3b1, som uttrykkes ved interrenal vev og voksne gonader; sebrafisk hsd3b2 er en moderlig uttrykt gen hvis transkripsjoner forsvinne før organogeneseperioden 7. Protokollen av hele montering 3β-Hsd enzymatisk aktivitetsanalyse for sebrafisk ble utviklet ved å modifisere Levy metode, ens beskrevet av Milano et al. , På frosne deler av åtte teleost arter 8. På grunn av den vev permeabilitet og den optiske gjennomsiktigheten av det fremkallende sebrafisk, hel-mount 3β-Hsd histokjemi kan med hell brukes for det faste sebrafisk embryo og larver og spesielt avgrense de differensierte interrenal vev.
Dette følsom og rask analyse har blitt brukt til ulike mutanter og morphants demonstrere ulike typer interrenal dysmorphogenesis. Den interrenal 3β-Hsd aktivitet er fraværende i embryo der spesifikasjonen av interrenal vevet er forstyrret gjennom en spesifikk knockdown av Ff1b transkripsjonsfaktor og reduseres ettersom interrenal differensiering er påvirket av en knockdown av Ff1b coregulator Prox1 9,10. Spesielt kan 3β-Hsd aktivitet påvises i mutanter med alvorlige tidlig stadium defekter, slik som enøyde knappenålshode og myse, hvor 3β-Hsd histokjemi skisserer hvordan interrenal celle migrasjon påvirkes 11. Differensieringen av interrenal vevet er ikke i fare selv i fullstendig fravær av blod og blodkar. Derfor, hvordan endotel-avledede signaler forme det fremkallende interrenal organ kan bestemmes 12,13. Alt i alt har denne histokjemisk analyse blitt brukt til å studere beskrivelsen, differensiering og migrering av steroidogenic celler i sebrafisk modell. Derfor bør det være en effektiv og pålitelig verktøy for eventuelle genetiske eller kjemiske skjermer rettet mot binyrene og interrenal organ lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle eksperimentelle prosedyrer på sebrafisk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Tunghai-universitetet (IRB godkjenning 101-12.) Og utføres i samsvar med vedtatte retningslinjer.
1. Stock Løsninger for 3β-Hsd enzymatisk aktivitet Farging
- Fremstille trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml i dimetylsulfoksid (DMSO)].
- Fremstille β-nikotinamid-adenin-dinukleotid-hydrat (1,2 mg / ml i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,2).
- Forbered nikotinamid (vitamin B3, 50 mg / ml i H2O).
- Forbered 4-nitro blå tetrazolium (50 mg / ml i 70% dimetylformamid).
- Delmengde alle disse komponentene i mikrofugerør og oppbevares ved -20 ° C.
MERK: I vår erfaring, gjentatt frysing og tining av prøver av alle de nevnte løsningene påvirker ikke intensiteten av 3β-Hsd aktivitet farging.
2. Whole-mount 3β-Hsd aktivitet Farging
MERK: 3β-Hsd enzymatisk aktivitet er påvisbar i sebrafisk embryoer så tidlig som 28 timer etter befruktning (HPF) når de dyrkes ved 28,5 ° C, noe som er konsistent med utbruddet av mRNA-ekspresjon av hsd3b1 2,7. Hele montering 3β-Hsd aktivitet flekker protokoll i denne studien er basert på en tidligere beskrevet metode åtte og var fast bestemt på å lykkes i å utvikle sebrafisk opp til 7 dager etter befruktning 9. For å analysere vaskulær mikromiljøet av interrenal steroidogenic vev, hel-mount 3β-Hsd aktivitet flekker må benyttes til transgene linjer uttrykker endotelet spesifikke fluorescens, som Tg (kdrl: EGFP) s843 14 og Tg (kdrl: mCherry) ci5 15 . Å analysere interrenal steroidogenic vev vurderer sebrafisk nyre utvikling, kan 3β-Hsd aktivitet flekker være apparaed å Tg (wt1b: GFP) LI1 fisk 16, hvor dannelsen av glomerulus og pronephric tubuli er avgrenset.
- Behandle det fremkallende sebrafisk ved å inkubere dem i 0,03% phenylthiourea i egg vann (0,06 mg / l rev salt i deionisert vann), med start fra en scene mellom 12 og 24 HPF, for å hemme dannelsen pigment.
- Fiks dechorionated embryoer eller larver i (A) 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfat-bufret saltvann (PBS) supplert med 0,1% Tween 20 (PFAT) i 1 time ved romtemperatur (RT) eller (B) 2% PFAT over natten ved 4 ° C eller i 2 timer ved 4 ° C, etterfulgt av 4 timer ved RT.
Forsiktig: PFA er giftig ved innånding og hudkontakt. Det er ødeleggende for huden, slimhinner, øyne og øvre luftveier. - Vask 4x embryoer i 10 minutter med PBS supplert med 0,1% Tween 20 (PBST) ved romtemperatur.
MERK: Det er viktig å ikke tørke prøvene når du skifter vaskeløsninger. - Fersk forberede staining løsning før reaksjonene (tabell 1). Forbered, vortex, og sentrifuger del A og B i separate rør.
MERK: Legge alle komponentene rett inn ett enkelt rør ville føre til alvorlig nedbør. - Tilsett hele løsning av del A til hele oppløsningen av del B, bland godt for å fremstille fargeløsning, og straks fordele 1 ml i hvert mikrosentrifugerør inneholdende faste og vasket embryoer.
- Vikle mikrofugerør med aluminiumsfolie for å beskytte dem mot lys og sted på enten en rotator eller en gyngende plattform for forsiktig risting ved RT.
- Empirisk å bestemme reaksjonstiden ved å overvåke kromogene signaler gjennom mikroskopi. Lett Nedbøren vil utvikle seg over tid; men de vil ikke innvirke på reaksjonsprosessen.
MERK: For embryoer fastsatt til 28 HPF, farging ved 25 ° C i 4 timer genererer et klart signal på interrenal vev. - Stopp reaksjonen ved å vaske 4x i 10 minutter i PBST. Jegf Det kreves ikke lenger immunhistokjemiske (IHC) analyse, post-fikse farget embryoer med 4% PFAT i 60 min ved RT. Ellers lagre de vaskede embryoene ved 4 ° C inntil videre anvendelse.
- For hel-mount mikroskopi, fjerne flekker, post-faste, og vasket embryoer med 50% glycerol i PBS, orientere dem med dorsal siden opp på et lysbilde, og observere ved hjelp av en oppreist mikroskop i sterkt felt belysning.
MERK: For å gjøre et høyoppløselig bilde av interrenal vev morfologi, flat-mount analyse av 3β-Hsd aktivitet-farget og deyolked embryo anbefales. Som interrenal steroidogenic vev er plassert rett over plommesekken, en ventral flat-mount analyse av interrenal vev tillater en direkte og klar observasjon av interrenal morfologi 17.
3. IHC Analyse av 3β-HSD Aktivitets-farget Embryoet
MERK: For å analysere vaskulær mikromiljøet av steroidogenic vev blir 3β-HSD aktivitets farget embryoer med en transgen endotel-spesifikke fluorescerende reporter utsatt for tverrgående vibratome seksjonering og påfølgende IHC analyse 12,18.
- Post-fiksering
- Post-fikse 3β-Hsd-aktivitet-farget og vasket embryoer med 2% PFA supplert med 1% Triton X-100 i 1 time ved 4 ° C og vaskes 4 ganger i 10 minutter i PBS inneholdende 1% Triton X-100 (PBSTx) ved RT.
- embedding
- Fremstille 4% lavtsmeltende agarose ved å oppløse agarosen i PBS ved 95 ° C, alikvoter inn i mikrofugerør, og oppbevar ved 4-8 ° C.
- Smelte en prøve av 4% lavtsmeltende agarose ved 70 ° C i 10 minutter, og deretter holde den delmengde ved 47 ° C. Embed hvert embryo i smeltet 4% lavt smeltepunkt agarose i en frittliggende cap av en 1,5 ml mikrosentrifugerør som fungerer som en form, og la den avkjøles helt fast.
- vibratome Seksjonering
- Hold deg et stykke papir tape til den tørre platform av vibratome.
- Ta av herdet agarose blokk fra formen ved et barberblad. Påfør superlim til papir tape på plattformen, og fikse agarose blokken på papir tape, med fremre side av prøven vender opp. Trimme agarose blokken til et trapesformet prisme form, med omtrent 4 mm og 8 mm på hver side av de øvre og nedre fasetter, respektivt.
- Skyll prøven inneholdende agarose blokk med kald PBS supplert med 0,5% Triton X-100 (0,5% PBSTx) ved hjelp av en dråpeteller.
- Skjær agarose blokken i 100 mikrometer seksjoner i henhold til bruksanvisningen for vibratome. Stadig skylle agarose blokken for å hindre uttørking. Som hver skive er kuttet, fjerne den fra vibratome bruke en 26 G sprøytespissen, og overføre til et sted plate med kaldt 0,5% PBSTx (500 ul / brønn).
- Samle 3P-Hsd aktivitets positive vevssnitt ved å sjekke under et disseksjon mikroskop, og overføre deler av en pipette spiss med sin ende cut-off (ca. 1 mm indre diameter ved åpningen) i en 96-brønners plate inneholdende kald 0,5% PBSTx (150 ul / brønn). Vevsprøvene vanligvis dissosierer fra agarose blokken etter dette trinnet.
- Permeabilization og Vask
- Vask skivene 6 ganger i 15 minutter i 0,5% PBSTx ved RT, 10 min i PBS, og 4x i 10 minutter i PBS supplert med 1% bovint serumalbumin / 1% DMSO / 0,1% Triton X-100 (PBDTx).
- Blokkering
- Inkuber skivene i 1 time i 2% føtalt kalveserum (FCS) i PBDTx ved RT.
- Primær antistoff-reaksjon
- Inkuber skivene i 1,5 dager i PBDTx inneholdende et primært antistoff (for eksempel kanin polyklonalt anti-human fibronektin og muse anti-humant fokal adhesjonskinase) ved 4 ° C.
- Vaske
- Vask skivene 6x for 10 min i PBDTx ved RT.
- Blokkering
- Inkuber skiver for en time i 2% FCS i PBDTX ved RT.
- Sekundær antistoff-reaksjon
- Inkuber skivene i 1,5 dager i PBDTx inneholdende et sekundært antistoff (fluorofor-konjugert geite-anti-kanin eller anti-mus IgG) ved 4 ° C.
- Vaske
- Vask skivene 6 ganger i 10 minutter i PBDTx ved RT og 4x i 10 minutter i PBST ved RT.
MERK: For confocal mikroskopisk analyse, fjerner prøvene med 50% glycerol i PBS.
- Vask skivene 6 ganger i 10 minutter i PBDTx ved RT og 4x i 10 minutter i PBST ved RT.
4. Confocal Analysis
- Observere hele mount embryo og delen av en konfokal mikroskop utstyrt med 10X / 0.5 og 20X / 0.75 objektiv.
- For samtidig deteksjon av fluorescens og det 3β-Hsd farging, sett flerspors modus på følgende måte: 488 nm argon laser og 505-530 nm båndpassfilter for påvisning av GFP; 543 nm Helium-neon laser og 560-615 nm båndpassfilter for detektering av mCherry; og overført lys kanal for påvisning av 3β-Hsd farging.Den pinhole størrelse er en Airey enhet, og oppløsningen er 1024 x 1024 piksler.
- Monter z stabler (med 6 mikrometer intervall) som en 3D-projeksjon, og flette projeksjon og lyse felt, ved å bruke den innebygde confocal programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å finne ut hvordan de steroidogenic interrenal vev codevelops med pronephric nyre glomerulus og sin begynnende blodkar, ble 3β-Hsd enzymatisk aktivitetsanalyse utført på dobbelttransgene Tg (wt1b: GFP) LI1, Tg (kdrl: mCherry) ci5 embryo ved 34 HPF (Figur 1). På dette trinn blir 3β-Hsd-aktivitet-positive steroidogenic vev lokalisert rett til midtlinjen og umiddelbart kaudalt for pronephric nyre glomerulus, mens noen steroidogenic cellene begynner å migrere på tvers av midtlinjen, og danner en fremspringende kant fra den dorsale visningen. Den steroidogenic vev er nært forbundet med rygg aorta (DA) og bakre kardinal vene (PCV).
Den 3β-Hsd enzymatisk aktivitetsanalyse på Tg (kdrl: GFP) s843 embryo tillates en klar avgrensning av peri-interrenal fartøy, inkludert DA, PCVOg interrenal beholder (IRV, figur 2). Vibratome deler av 3β-HSD aktivitets farget embryoer ble utsatt for IHC analyse for detektering av den ekstracellulære matriks-protein Fibronectin og dens nedstrøms effektor fosforylert fokal adhesjonskinase. Den peri-DA deponering av fibronektin er avgjørende for å støtte IRV vekst 18.
Figur 1: Hel-mount 3β-Hsd aktivitet flekker utført på sebrafisk uttrykke fluorescerende reportere. Dorsal (venstre panel) og dorsolateral (høyre panel) visninger av en 3β-Hsd aktivitet-farget Tg (wt1b: GFP) LI1, Tg (kdrl: mCherry) ci5 embryo ved 34 HPF, som lar visualisere den relative romlige fordelingen av interrenal vev (IR), pronephric glomerulus (PG), pronephric tubuli (PT), rygg aorta (DA), lateral dorsalaorta (LDA), og posterior kardinal vene (PCV). På grunn av plasseringen av den interrenal vev på dette stadiet, dorsolateral utsikten er fra høyre side av embryoet. D, rygg; V, ventral; A, anterior; P, posterior; R, ikke sant; L, til venstre. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Vibratome seksjonering og IHC analyse av 3β-Hsd aktivitet-farget Tg (kdrl: GFP) s843 embryoer. 34-HPF embryo ble underkastet en 3β-Hsd enzymatisk aktivitetsanalyse, og deretter vibratome snitting. Den 3β-Hsd-aktivitet-positive seksjon var farget med dobbelt IHC med kanin anti-humant fibronektin (Fn; 1/200) og muse anti-humant fosforylerte fokal adhesjonskinase (pFak; pY397, 1/100). Den tverrgående delen viser den relative fordeling av de interrenal vev (IR) og dens nabo skip, hvorav dorsal aorta (DA), bakre kardinalvene (IRV), og bakre kardinalvene (PCV). NT, neural tube; NC, notochord; S, somitt. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stock konsentrasjon | I 1000 mL | Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP | |
| Del A. | |||
| DMSO | 40 ul | ||
| DHEA | 10 mg / ml | 10 ul | 0,1 mg / ml |
| NAD | 1,2 mg / ml | 10 ul | 12 ug / ml |
| Del B. | |||
| PBST | 936 mikroliter | ||
| vitamin B3 | 50 mg / ml | 2 pl | 0,1 mg / ml |
| NBT | 50 mg / ml | 2 pl | 0,1 mg / ml |
Tabell 1: Komponenter i 3β-Hsd fargereaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Signalstyrken til den 3β-Hsd aktivitet økes i løpet av reaksjonen. Klare signaler om den 3β-Hsd-aktivitet ble påvist etter 4 timers reaksjon for trinn fra 28 HPF framover. Imidlertid krever reaksjonen varighet empiriske bestemmelse, avhengig av formålet med analysen. I de tilfeller hvor fargingen krever behandling over natten, har en tendens til en lett blåaktig bakgrunn å utvikle seg på prøvene. Dette problemet kan overvinnes ved å øke fiksering varighet (for eksempel 4 timer i 4% PFAT ved romtemperatur) før den 3β-Hsd aktivitet farging. I motsetning til dette, overfixation, slik som feste for over natten med 4% PFAT ved romtemperatur, fører til en svært klar bakgrunn. Imidlertid ville lengre tid være nødvendig for å oppnå en ønsket intensitet av signalet. Vi la merke til at å fikse prøvene over natten med 2% i stedet for 4% PFAT før 3β-Hsd aktivitet flekker gir vanligvis mer ønskelige resultater i en etterfølgende fluorescerende reporter observasjon eller jegHC analyse. Men feste embryoene med 4% PFAT gir en rask analyse av 3β-Hsd aktivitet (fullført innen en dag), og vil derfor ha nytte genetiske eller kjemiske skjermer rettet mot interrenal steroidogenic vev.
Post-feste embryoene etter 3β-Hsd aktivitet farging er viktig fordi spormengder av kjemiske komponenter pleier å vedvare i de fargede prøvene selv etter omfattende vasking og vil resultere i høy bakgrunn etter en lang lagringsvarighet. Men hvis 3β-HSD aktivitets beiset embryoer for å underkastes ytterligere analyse IHC, lagring av 3β-Hsd-aktivitet-farget og vasket embryoer ved 4 ° C natten over ikke resulterer i en merkbar forbedring av bakgrunnen.
In situ hybridisering (ISH) analyse av 3β-HSD aktivitets farget embryoer er mulig. For eksempel er ekspresjon av prox1 transkripter colocalized med den 3β-Hsd aktivitet ved steroidogenic vev 10. For å utføre 3β-Hsd aktivitet flekker i tillegg til ISH, må embryoene bli fiksert i 4% PFAT i 4 timer både før og etter 3β-Hsd aktivitetsanalyse, slik at cellulær RNA-transkripter kan konserveres med ønskelig kvalitet for ISH analyse.
ISH analyse ved hjelp riboprober av ff1b, cyp11a1, hsdb1, og stjernen har blitt brukt i utviklingsstudier ved interrenal steroidogenic vev 1,2,11. Den riboprobe av ff1b oppdager primordial interrenal celler ved 22 HPF, mens de av cyp11a1 og stjerne oppdage differensiere interrenal celler ved 24 HPF. I forhold til 3β-Hsd histokjemisk farging som bare detekterer differensierte interrenal vev fra 28 HPF og utover, kan ISH analyse benyttes for å analysere et spektrum av interrenal-spesifikke gener på både opprinnelige og differensierte interrenal celler. Ikke desto mindre, 3β-Hsd histokjemisk farging hektarer fordelen av å være enkel, rask og pålitelig for å analysere fenotype av den differensierte steroidogenic interrenal vev, og derfor er et kraftig verktøy for detaljerte utviklingsstudier samt store genetiske eller kjemiske skjermer. I henhold til vår gjennomgang av relevant litteratur, det finnes ingen spesifikk antistoff som pålitelig kan påvise protein uttrykk på steroidogenic interrenal vev gjennom immunhistokjemi. Derfor er det 3β-Hsd histokjemisk farging metoden spesielt nyttig for å lokalisere vevet og cellulær morfologi steroidogenic interrenal vev.
Selv om 3β-Hsd histokjemisk farging er nyttig for visualisering av den differensierte steroidogenic interrenal vev, er det ikke direkte rapportere steroid syntese-kapasitet eller funksjonaliteten til interrenal celler. Mutasjoner eller kjemikalier som påvirker enzymer oppstrøms eller nedstrøms 3β-Hsd i steroidogenic syntese kaskade kan ikkenødvendigvis bli oppdaget sammen med denne beskrevne fremgangsmåte, ettersom de kan eller ikke kan forstyrre enten størrelse eller morfologi av interrenal vev. Derfor bør brukere av denne protokollen huske på at visse enzymatiske nedskrivninger påvirker funksjon, men ikke morfologi interrenal vev kan ikke være lett oppdages av denne metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker professor Christoph Englert og professor Didier Stainier for gifting Tg (wt1b: GFP) LI1 og Tg (kdrl: EGFP) s843 stammer, henholdsvis, og Taiwan Sebrafisk Kjerne Facility for å gi Tg (kdrl: mCherry) ci5. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Taiwan Ministry of Science and Technology (96-2628-B-029-002-My3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-My3, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
- Liu, Y. W.
- Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
- Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
- Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
- Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
- Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
- Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
- Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
- Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
- Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
- Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).
