JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

En In Vitro -modellen for å undersøke mobilnettet transformasjon av Kaposis sarkom Herpesvirus

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/54828
, , , ,
1Division of Pediatric Infectious Diseases,University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute,Oregon Health and Science University

Summary

Kaposis sarkom (KS) er en svulst forårsaket av infeksjon med kreftfremkallende viruset menneskelig herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). Endothelial celle kultur modellen beskrevet her er unikt tilpasset for å studere mekanismer som KSHV forvandler vertsceller.

Abstract

Kaposis sarkom (KS) er en uvanlig svulst består av voksende spindel celler som startes av infeksjon av endotelceller (EC) med KSHV, og utvikler oftest i innstillingen for immunsuppresjon. Til tross for tiår med forskning, optimal behandling for KS er dårlig definert og kliniske utfall er spesielt ugunstige i ressurs-begrenset innstillinger. KS lesjoner er drevet av patologisk angiogenese, kronisk betennelse og oncogenesis, og ulike i vitro celle kultur modeller er utviklet for å studere disse prosessene. KS oppstår fra KSHV-infiserte celler endothelial opprinnelse, slik EU-lineage celler gir de mest passende i vitro surrogater av spindel celle forløperen. Men fordi EU har en begrenset i vitro levetid, og som de kreftfremkallende mekanismene ansatt hos KSHV er mindre effektiv enn andre tumorigenic virus, har det vært vanskelig å vurdere prosessene av transformasjon i primære eller telomerase-udødeliggjort EC. Derfor ble en roman EC-baserte kultur-modellen utviklet som lett støtter transformasjon etter infeksjon med KSHV. Ektopisk uttrykk for E6 og E7 genene for humant papillomavirus type 16 gir utvidet kultur av alder – og passasje-matchet uekte – og KSHV-infiserte EC og støtter utviklingen av en virkelig transformert (dvs. tumorigenic) fenotypen i infiserte cellekulturer . Denne medgjørlig og svært reproduserbar modellen av KS har muliggjort oppdagelsen av flere viktige signalveier med stort potensial for oversettelse til kliniske innstillinger.

Introduction

Kaposis sarkom (KS) er en Multi-Focal angioproliferative svulst påvirker dermal, mucosal og visceral områder som utvikler vanligvis i innstillingen for avansert uimottakelig undertrykkelse1. Fire epidemiologisk skjemaer har blitt beskrevet: klassisk, en lat form som vanligvis påvirker eldre mennesker i middelhavs- og arv; iatrogenic, som følge av behandling med suppressive medikamenter etter organtransplantasjon; epidemien, en AIDS-definerende kreft; og endemisk, et uavhengig av HIV-skjema som er vanlig i barn i endemiske områder i Afrika. Med ankomsten av effektiv kombinasjon anti-retroviral narkotika regimer for behandling av HIV, er epidemi KS mye mindre vanlig diagnostisert i utviklingsland. Imidlertid fortsatt skjemaene for klinisk aggressiv endemisk og epidemien blant de vanligste diagnostisert kreft i mange afrikanske land2,3,4. Identifikasjon av effektiv patogenesen målrettede legemidler for behandling av KS er derfor forskning prioritet.

Histologisk, er KS lesjoner preget av omfattende men unormal neovascularization der spindelen cellene opprinnelsesland EC danner usammenhengende vaskulære nettverk5. Disse unormale fartøyene (“vaskulære slits”) gjør bloduttredelse av erytrocytter, som gir lesjoner sine karakteristiske farger. I tillegg inneholder lesjoner mange leukocytter som karakteriserer kronisk betennelse (dvs. lymfocytter, makrofager og plasma celler). Regresjon av KS lesjoner etter immune rekonstituering har blitt beskrevet, antyder at KS har både en hyper-proliferativ leksjonen og sanne svulst6,7,8,9.

KS herpesvirus (KSHV), den utløsende agenten for KS, ble identifisert i 199410. Siden så mange i vitro cellekultur modeller er utviklet for å aktivere patogenesen studier, inkludert celler explanted fra svulst biopsi materiale og primær eller telomerase-uttrykke EC infisert med KSHV i vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ingen av de tilgjengelige modellene viser fullt KS svulst microenvironment, men alle har bidratt verdifull kunnskap til vår forståelse av pathobiology av KSHV. I motsetning til de andre kjente tumorigenic menneskelig herpesvirus Epstein – Barr virus (EBV), KSHV lett transformerer ikke celler i kultur etter de novo infeksjon19,20,21, 22. imidlertid denne begrensningen er løst med transducing primære menneskelige EC enten blandet mikrovaskulær eller lymfatisk opprinnelse med E6 og E7 gener fra humant papillomavirus type 16 før infeksjon med KSHV23,24 . Uttrykk for disse eksogene oncogenes øker dramatisk transformere potensialet i KSHV i vitro delvis ved å gi ytterligere hemming av retinoblastoma protein og p5323,24. Denne EC signaltransduksjon metoden har tillatt flere laboratorier for å identifisere viktige endringer i verten celle genuttrykk som er indusert av KSHV infeksjon, og som synes å lette KS celle overlevelse og spredning25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. protokollene beskrevet her er enkel og svært reproduserbare og vil medføre generering av alder – og passasje-matchet KSHV-infiserte EC og uekte-infiserte kontroller som kan kultivert langt lenger enn primære celler og vil tillate etterforskningen av kreftfremkallende mekanismer ansatt hos KSHV. Selv om protokollen inneholder en metode for produksjon av vill-type KSHV fra primære effusjon lymfom cellen linje BCBL-1, E6/E7-udødeliggjort EC er også svært utsatt for avledet infeksjon med rekombinant BACmid KSHV-BAC1630. Protokoller for utarbeidelse av BAC16 er beskrevet andre steder33,34.

Protocol

Merk: alle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen skal utføres under BSL-2 forhold. 1. KSHV lager forberedelse forberede TNE buffer: oppløse 292.24 mg EDTA i ddH 2 O bringe til 225 mL og justere pH 8. Oppløse 605.7 mg Tris i ddH 2 O, bringe til 225 mL og justere pH 8. Kombinere EDTA og Tris løsninger, legge 4,38 g NaCl, justere endelige volumet til 500 mL, filtrere sterilisere, og lagre på 4 ° C . Kultur KSHV-positive, EBV-…

Representative Results

Morfologi av primære EC er klassisk beskrevet som “brolegge-stein”, og denne morfologi endres ikke av uttrykk papillomavirus E6 og E7 gener (figur 1A). Uttrykk for E6 og E7 genene alene få ikke en transformert fenotypen; dermed celler er utsatt for kontakt hemming og vil slutte å dele på å nå samløpet i kultur. Cellene vil imidlertid sprer og regrow til elvene trypsinization og replating på lavere tetthet, slik at vedlikehold av alder – og passasje-matchet kulture…

Discussion

Oncogenesis er en må prosess som omgår viktig beskyttelse i en organisme36. Som KS lesjoner finnes langs et spekter av kronisk betennelse til sann sarkomer, krever utviklingen av visse patofysiologiske prosesser formidlet av KSHV at noen studier gjennomføres i celle kultur modeller som støtter transformasjon9. Det bør bemerkes at kontakt hemming og anchorage-avhengige vekst, fenotyper indikativ av mobilnettet transformasjon, ikke lett utvikle etter smitte av primære E…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 og P51 OD011092 (AVM); og tildele 14PRE20320014 fra Amerika Heart Association (SB).

Materials

BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi’s sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi’s sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi’s sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266 (5192), 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi’s sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi’s sarcoma?. Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi’s sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi’s Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3′-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder, ., Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

In Vitro ModelCellular TransformationKaposi Sarcoma HerpesvirusKSHVEndothelial CellsMalignant TransformationViral OncogenesisKaposi SarcomaPathological AngiogenesisBCBL-1 CellsPMAViral Particle IsolationUltracentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image