JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

En In Vitro -modell för att studera cellulära omvandling av Kaposis sarkom Herpesvirus

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/54828
, , , ,
1Division of Pediatric Infectious Diseases,University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute,Oregon Health and Science University

Summary

Kaposis sarkom (KS) är en tumör som induceras av infektion med de onkogena virus människa herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). Endotelcell kultur modellen beskrivs här är unikt lämpade för att studera de mekanismer genom vilka KSHV förvandlar värdceller.

Abstract

Kaposis sarkom (KS) är en ovanlig tumör bestående av prolifererande spindel celler som initieras av infektion av endotelceller (EG) med KSHV, och utvecklar oftast i fastställandet av immunsuppression. Trots decennier av forskning, optimal behandling av KS fortfarande dåligt definierade och kliniska resultat är särskilt ogynnsamma i begränsade resurser inställningar. KS lesioner drivs av patologisk angiogenes, kronisk inflammation och Onkogenes, och olika in vitro- cell kultur modeller har utvecklats för att studera dessa processer. KS uppkommer KSHV-infekterade celler av endotel ursprung, så EG-lineage celler ger de mest lämpliga in vitro- ersättningar av spindeln cell föregångaren. Men eftersom EG har en begränsad i vitro livslängd, och som de onkogena mekanismer som anställd av KSHV är mindre effektiva än de andra tumörframkallande virus, det har varit svårt att utvärdera processerna för omvandling i primär eller telomeras-förevigade EC. Därför utvecklades en ny EG-baserade kultur modell som lätt stöder omvandling efter infektion med KSHV. Ektopisk uttryck av E6 och E7 generna av humant papillomvirus typ 16 möjliggör utökade kultur och passage-åldersmatchade mock – och KSHV-smittade EG och stöder utvecklingen av en verkligt transformerade (dvs tumörframkallande) fenotyp i infekterade cellkulturer . Denna eftertraktansvärda och mycket reproducerbara modell av KS har underlättat upptäckten av flera viktiga signalvägar med hög potential för översättning till kliniska inställningar.

Introduction

Kaposis sarkom (KS) är en multi fokala angioproliferative tumör som drabbar huden, slemhinnor och viscerala platser som utvecklar oftast i fastställandet av avancerade immunsystemet1. Fyra epidemiologiska former har beskrivits: classic, en indolent form som vanligtvis drabbar äldre människor i Medelhavsområdet och Mellanöstern arv. iatrogen, följd av behandling med Immunosuppressiva läkemedel efter organtransplantation; epidemi, en AIDS-relaterad cancer; och endemiska, en HIV-oberoende form vanligt hos barn i endemiska områden i Afrika. Med tillkomsten av effektiva kombinationsregimer antiretrovirala läkemedel för behandling av HIV diagnostiseras epidemisk KS mycket mindre vanligt i utvecklingsländerna. De kliniskt aggressiv endemiska och epidemiska formerna dock bland de vanligaste diagnosen cancer i många afrikanska länder2,3,4. Identifiering av effektiva patogenes-riktade läkemedel för behandling av KS är därför prioriteras forskning.

Histologiskt, kännetecknas KS lesioner av omfattande men onormal kärlnybildning whereby spindel celler av EG ursprung bilda diskontinuerligt vaskulär nätverk5. Dessa onormala fartyg (”vaskulär slitsar”) tillåta extravasation av erytrocyter, som ger lesioner deras karakteristiska färg. Dessutom innehålla lesioner talrika leukocyter som kännetecknar kronisk inflammation (dvs, lymfocyter, makrofager och plasmaceller). Regression av KS lesioner efter immun beredning har beskrivits, vilket tyder på att KS har drag av både en hyper-proliferativ lesion och en sann tumör6,7,8,9.

KS herpesvirus (KSHV), vilka smittämnen av KS, identifierades 199410. Sedan då många i vitro cellkultur modeller har utvecklats för att aktivera patogenes studier, inklusive celler explanterad från tumör biopsi material och primär eller telomeras-uttryckande EG angripits KSHV in vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ingen av de för närvarande tillgängliga modellerna helt recapitulates KS tumör mikromiljö, men alla har bidragit med värdefull kunskap till vår förståelse av patobiologi KSHV infektion. Till skillnad från de andra kända tumörframkallande människa herpesvirus Epstein – Barr virus (EBV), KSHV inte lätt förvandla celler i kultur efter de novo infektion19,20,21, 22. men denna begränsning har övervunnits av transducing primära mänskliga EG av antingen blandat mikrovaskulära eller lymfatiska ursprung med E6 och E7 gener från humant papillomvirus typ 16 före infektion med KSHV23,24 . Uttryck för dessa exogena onkogener ökar dramatiskt omvandlande potential KSHV in vitro- delvis genom att tillhandahålla ytterligare hämning av retinoblastom protein och p5323,24. Denna EG transduktion metod har tillåtit flera laboratorier att identifiera viktiga förändringar i mottagande cell genuttryck som induceras av KSHV infektion och som tycks underlätta KS cell överlevnad och spridning25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de protokoll som beskrivs häri är okomplicerad och mycket reproducerbara, och kommer att resultera i generationen och passage-åldersmatchade KSHV-infekterade EG och mock-infekterade kontroller som kan vara odlade långt längre än primära celler och kommer Tillåt för utredning av onkogena mekanismer anställd av KSHV. Även om protokollet innehåller en metod för framställning av vildtyp KSHV från den primära utgjutning lymfom cellinje BCBL-1, E6/E7-förevigade EG också är mycket mottagliga för härrör infektion med rekombinant BACmid KSHV-BAC1630. Protokoll för beredning av BAC16 beskrivs någon annanstans33,34.

Protocol

Obs: alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll bör utföras under BSL-2 villkor. 1. KSHV lager förberedelse förbereda TNE buffert: lös 292.24 mg EDTA i ddH 2 O, föra till 225 mL och justera till pH 8. Lös 605.7 mg Tris i ddH 2 O, föra till 225 mL och justera till pH 8. Kombinera EDTA och Tris lösningar, tillsätt 4,38 g NaCl, anpassa den slutliga volymen till 500 mL, filtrera sterilisera och förvaras vid 4 ° C . Kultur de …

Representative Results

Morfologi av primära EG beskrivs klassiskt som ”kullersten”, och denna morfologi ändras inte av uttryck av papillomvirus E6 och E7 gener (figur 1A). Uttryck av E6 och E7 generna ensam inducerar inte en transformerade fenotyp; Således, celler är mottagliga för kontakta hämning och upphör att dela när den når sammanflödet i kultur. Cellerna kommer emellertid föröka och återföds till sammanflödet på trypsinization och replating på en lägre densitet, vil…

Discussion

Onkogenes är en process som kringgår viktiga garantier inom en organism36. Som KS lesioner finns längs ett spektrum av kronisk inflammation till sann sarkom, kräver klargörande av vissa patofysiologiska processer som medieras av KSHV att vissa studier utföras i cell kultur-modeller som stöder omvandling9. Det bör noteras att förlust av kontakt hämning och anchorage-beroende tillväxt, fenotyper vägledande av cellulära omvandling, inte lätt utvecklas efter infek…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete fick stöd av K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 och P51 OD011092 (AVM); och belöna 14PRE20320014 från Amerika hjärtat Association (SB).

Materials

BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi’s sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi’s sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi’s sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266 (5192), 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi’s sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi’s sarcoma?. Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi’s sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi’s Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3′-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder, ., Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

In Vitro ModelCellular TransformationKaposi Sarcoma HerpesvirusKSHVEndothelial CellsMalignant TransformationViral OncogenesisKaposi SarcomaPathological AngiogenesisBCBL-1 CellsPMAViral Particle IsolationUltracentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image