JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/54828
, , , ,
1Division of Pediatric Infectious Diseases,University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute,Oregon Health and Science University

Summary

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon oncogenic virüs insan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) ile indüklenen bir tümördür. Burada açıklanan endotel hücre kültür model benzersiz olarak hangi konak hücreleri KSHV dönüşümleri mekanizmaları eğitim için uygundur.

Abstract

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon KSHV ile endotel hücrelerinin (EC) tarafından başlatılan ve en sık immünosupresyon ayarında geliştirir Proliferasyona iğ hücreleri oluşur alışılmadık bir tümör var. Onlarca yıllık araştırma rağmen KS en uygun tedavi kötü tanımlanmış kalır ve klinik sonuçlar kaynak sınırlı ayarları özellikle olumsuz. KS lezyonlar patolojik anjiogenezi, kronik inflamasyon ve oncogenesis tarafından tahrik edilmektedir ve bu süreçlerin çalışmaya çeşitli vitro hücre kültür modelleri geliştirilmiştir. EC-lineage hücreleri Spindl Hücre habercisi en uygun vitro vekilleri sağlamak böylece KS endotel kökenli KSHV enfekte hücrelerden doğar. Ancak, AK bir sınırlı vitro ömrü olduğundan ve KSHV tarafından istihdam oncogenic mekanizmaları daha az bu tumorigenic diğer virüsler daha verimli olduğu gibi bu ilkokulda dönüştürme işlemleri değerlendirmek zor olmuştur ya da Revers ölümsüzleştirilmiş EC Bu nedenle, bir roman kültür EC tabanlı model kolayca KSHV mantar enfeksiyonu takip dönüşümü destekleyen geliştirilmiştir. HPV tip 16 E6 ve E7 genlerinin Ektopik ifade genişletilmiş kültür, yaş ve geçiş Bahisler sahte ve KSHV-enfekte EC için izin verir ve gerçekten dönüştürülmüş gelişimini destekleyen (yani tumorigenic) enfekte hücre kültürlerinde fenotip . KS bu uysal ve son derece tekrarlanabilir model klinik ayarları içine çeviri için yüksek potansiyele sahip birkaç temel sinyal yolları keşfi kolaylaştırdı.

Introduction

Kaposi sarkomu (KS) en çok geliştiren gelişmiş bağışıklık suppression1ayarı dermal, Mukozal ve visseral sitelerini etkileyen bir multifokal angioproliferative tümördür. Dört epidemiyolojik formu tarif edilmiştir: Klasik, genellikle Akdeniz ve Orta Doğu mirası; büyük insanı etkileyen bir tembel formu iyatrojenik, organ nakli takip immünsupresif ilaçlar ile tedavi sonucunda; salgın, bir AIDS tanımlama kanser; ve endemik, Afrika endemik bölgelerde çocuklarda yaygın bir HIV bağımsız formu. HIV tedavisinde etkili kombinasyonu anti-retroviral uyuşturucu rejimleri gelişiyle, salgın KS gelişmekte olan ülkelerde daha az yaygın olarak teşhis edilir. Ancak, klinik olarak agresif endemik ve salgın formları arasında en sık tanı kanser birçok Afrika ülkeleri2,3,4kalır. Bu nedenle, kimlik KS tedavisi için Patogenez hedefli etkili ilaçların bir araştırma önceliktir.

Histolojik olarak, KS lezyonlar geniş ama anormal neovaskülarizasyon sayede iğ hücreleri EC kökenli kesintili damar ağları5formu karakterizedir. Bu anormal gemiler (“vasküler yırtmaçlı”) lezyonlar onların karakteristik renk ver eritrositler ekstravazasyonu izin. Ayrıca, lezyonlar kronik inflamasyon (yani, lenfosit, makrofaj ve plazma hücreleri) karakterize çok sayıda lökosit içerir. KS proliferatif hiper lezyon ve bir gerçek tümör6,7,8,9özelliklere sahiptir düşündüren regresyon bağışıklık sulandırma takip KS lezyonların tanımlanmıştır.

KS herpesvirus (KSHV), KS, hastalığının 199410dakika sonra tespit edilmiştir. Modeller geliştirilmiştir sonra birçok vitro hücre kültürü beri Patogenez çalışmalar etkinleştirmek için hücreleri de dahil olmak üzere tümör biyopsi malzeme ve ilköğretim explanted veya EC Revers ifade KSHV vitro11 ile enfekte , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. mevcut modelleri hiçbiri tam olarak KS tümör microenvironment tablodur, ama tüm değerli bilgi KSHV enfeksiyon pathobiology anlayışımız için bulunmuştur. Diğer bilinen tumorigenic insan herpesvirus Epstein – Barr virüsü (EBV), KSHV kolayca hücre kültüründe de novo enfeksiyon19,20,21, takip dönüştürmek değil 22. ancak, bu sınırlama birincil insan EC ya mikrovasküler veya lenfatik kökenli E6 ile karışık transducing tarafından üstesinden ve HPV E7 genler 16 KSHV23,24 mantar enfeksiyonu önce yazın . Bu eksojen oncogenes ifade önemli ölçüde KSHV vitro dönüşüm potansiyelini kısmen daha fazla Retinoblastom protein ve p5323,24inhibisyonu sağlayarak artırır. Bu EC iletim yöntemi ev sahibi anahtar değişiklikleri tanımlamak için birden çok laboratuvarlar bu KSHV enfeksiyon tarafından indüklenir ve KS hücre hayatta kalma ve nükleer silahların yayılmasına karşı25,26 kolaylaştırmak için görünen hücre gen ekspresyonu izin verdi , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. burada açıklanan protokoller basit ve son derece tekrarlanabilir ve üretimi Primer hücre daha çok uzun süre kültürlü ve sahte enfekte kontrol eder ve yaş ve geçiş Bahisler KSHV enfekte EC neden olur oncogenic mekanizmaları KSHV tarafından istihdam incelenmesi için izin verir. Protokol vahşi KSHV satırından birincil efüzyon Lenfoma hücre BCBL-1, E6/E7-ölümsüzleştirilmiş EC de son derece duyarlı türü üretim için bir yöntem bulunmasına karşın rekombinant BACmid ile enfeksiyon KSHV-BAC1630türetilmiş. İletişim kuralları BAC16 hazırlanması için başka bir yerde açıklanan33,34.

Protocol

Not: Bu protokol için açıklanan tüm yordamları BSL-2 koşullar altında gerçekleştirilmelidir. 1. KSHV hisse senedi hazırlık hazırlamak TNE arabellek: 292.24 mg EDTA GKD 2 O dağıtılması, 225 mL getirmek ve pH 8 ayarlayın. GKD 2 O 605.7 mg Tris dağıtılması, 225 mL getirmek ve pH 8 ayarlayın. EDTA ve Tris çözümleri birleştirmek, 4,38 g NaCl ekleyin, 500 ml nihai ses düzeyini ayarlama, filtre sterilize ve mağaza 4 ° C’de .</l…

Representative Results

Birincil EC morfolojisi klasik “Arnavut kaldırımı taşı” olarak tanımlanır ve bu Morfoloji Papilloma virüsü E6 ve E7 genlerinin (şekil 1A) ifade tarafından değiştirilmez. İfade yalnız E6 ve E7 genlerinin dönüştürülmüş bir fenotip neden değil; Böylece, hücreleri inhibisyon temas duyarlı ve izdiham kültür ulaşan üzerine bölen sona erecek. Hücreler ancak çoğalırlar ve trypsinization ve kültürlerin yaş ve geçiş Bahisler kullanmak için s…

Discussion

Oncogenesis bir organizma36içinde önemli güvenlik önlemlerinin circumvents multistep bir süreçtir. KS lezyonlar kronik inflamasyon gerçek eklem dokusu Uru için bir spektrum boyunca var gibi aydınlatma KSHV tarafından aracılı belirli patofizyolojik süreçlerin bazı çalışmalar dönüşümü9çekmek için hücre kültür modellerinde yürütülmelidir gerektirir. Bu kaybı temas inhibisyonu ve anchorage bağlı büyüme, fenotipleri hücresel dönüşümü, g?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser K12 HD068322 (SCM) tarafından desteklenen; R01 CA179921 ve P51 OD011092 (AVM); ve 14PRE20320014 Amerika Kalp Derneği (SB) Ödülü.

Materials

BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi’s sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi’s sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi’s sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266 (5192), 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi’s sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi’s sarcoma?. Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi’s sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi’s Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3′-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder, ., Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

In Vitro ModelCellular TransformationKaposi Sarcoma HerpesvirusKSHVEndothelial CellsMalignant TransformationViral OncogenesisKaposi SarcomaPathological AngiogenesisBCBL-1 CellsPMAViral Particle IsolationUltracentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image