Summary

Mesure de Différentiellement méthylé<em> INS</em> ADN Espèce dans des échantillons de sérum humain en tant que mort cellulaire Biomarker de l'Islet β

Published: December 21, 2016
doi:

Summary

Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.

Abstract

The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.

Introduction

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto – immune qui se caractérise par la destruction des îlots de Langerhans productrices d'insuline par les cellules β des cellules T autoréactives 1. Le diagnostic de DT1 est généralement faite sur mesure (glycémie> 200 mg / dl) de l'hyperglycémie chez un jeune individu maigre, qui pourrait présenter une acidocétose comme preuve d'une carence en insuline. Au moment du diagnostic de diabète de type 1, il existe des preuves pour une perte substantielle de la fonction des cellules β et la masse (50-90%) 2. Dans les études cliniques, plusieurs médicaments modulateurs immunitaires qui ont été instituées au moment du diagnostic ont donné lieu à la stabilisation de la fonction des cellules β (et probablement de masse), mais aucune n'a abouti à une rémission clinique de la maladie, une constatation qui a soulevé l'appel pour le développement de biomarqueurs pour la détection précoce de la maladie et pour le suivi longitudinal de l' efficacité de la combinaison des thérapies 3,4. Les efforts déployés par des consortiums internationaux, une telleest le Consortium Réseau de recherche sur l' îlot humain au National Institutes of Heath 5, ont souligné la nécessité de développer des biomarqueurs qui mettent l' accent sur le stress cellulaire β et la mort dans le DT1.

Conformément à ces efforts, notre groupe et d' autres ont récemment mis au point des tests de biomarqueurs qui mesurent en circulation, des fragments d'ADN épigénétique modifiés qui découlent principalement de la mort des cellules ß 6-9. Dans tous les essais publiés à ce jour, l'accent a été mis sur la quantification du gène humain codant pour la préproinsuline (INS), ce qui démontre un plus grand degré de sites CpG non méthylés dans les régions codantes et du promoteur par rapport à d' autres types de cellules. La libération de fragments d' ADN non méthylé INS a émis l' hypothèse que découlant principalement de la mort (nécrotiques, apoptotiques) cellules ß. Nos études récentes ont montré que chez les jeunes, les élévations de l'ADN non méthylé INS à la fois et méthylé en position -69 pb ( par rapport à til transcriptionnelle site de départ) ont été observés dans la nouvelle apparition du DT1, et ensemble a servi en tant que biomarqueurs spécifiques pour cette population 6. Ces dosages de marqueurs biologiques impliquent l'isolement de l'ADN acellulaire de sérum ou de plasma en utilisant des kits commerciaux de rotation, suivie d'une conversion au bisulfite de l'ADN isolé (pour convertir les cytosines non méthylées à uraciles, en laissant intact cytosines méthylées).

Dans ce rapport, nous décrivons les aspects techniques de la collecte des échantillons de sérum, l' isolement de l' ADN sans cellules à partir de sérum, conversion au bisulfite, et les performances des gouttelettes PCR numérique (désormais, PCR numérique) pour l' ADN méthylé INS différentiellement.

Protocol

Ethics Statement: Protocols were approved by the Indiana University Institutional Review Board. Parents of subjects provided written informed consent, and children older than 7 years provided assent for their participation. 1. Serum Processing NOTE: The assay as described has been rigorously tested using human serum isolated as follows. Collect blood in one red top (no-additive; uncoated) blood collection tube. Let sit at room temperature for 30 min to allow the clot to form. <li…

Representative Results

Pour interpréter les données de manière appropriée, nous utilisons des contrôles plasmidiques tant pour l'ADN cible non méthylé et méthylé INS dans chaque essai de PCR numérique. Ces contrôles assurent que les signaux correspondant à l'ADN méthylé et non méthylé se distinguent clairement. La figure 1 montre les diagrammes de dispersion 2-D correspondant aux gouttes pour les contrôles de plasmide contenant le bisulfite converti méthylé …

Discussion

La méthylation de cytosines par ADN méthyltransférases permet le contrôle épigénétique de la transcription de nombreux gènes. Le gène de l' INS chez l'être humain est presque exclusivement exprimée dans des cellules d' îlots β, et il semble y avoir une corrélation entre la fréquence de méthylation de cytosine dans le gène INS silençage de sa transcription 11. En tant que tel, la plupart des types de cellules présentent sensiblement plus hautes fréquences de m?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.

Materials

Red Top Vacutainer  Beckon Dickinson 366441 no additive, uncoated interior, 10 ml
Cryovial Tube Simport T310-3A polypropylene, screw cap tube, any size
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51106
Poly(A) Sigma P9403 disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl 
Absolute Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
DPBS (with CaCl and MgCl) Sigma D8662
0.2 mL PCR 8-strip Tubes MidSci AVST
8-strip Caps, Dome MidSci AVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo D5031
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Biorad 1863024
Buffer Control for Probes Biorad 1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix Life Technologies AH21BH1
EcoR1 New England Biolabs R0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted Eppendorf 951020346
Pierceable Foil Heat Seal Biorad 1814040
PX1 PCR Plate Sealer Biorad 1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System Biorad 1864101
Automated Droplet Generation Oil for Probes Biorad 186-4110
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator Biorad 186-4108
Pipet Tips for Automated Droplet Generator Biorad 186-4120
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator Biorad 186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler Biorad 1851197
QX200 Droplet Reader Biorad 186-4003
ddPCR Droplet Reader Oil Biorad 186-3004

References

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. . Human Islet Research Network | HIRN Available from: https://hirnetwork.org/ (2016)
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

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Tersey, S. A., Nelson, J. B., Fisher, M. M., Mirmira, R. G. Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet β Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54838, doi:10.3791/54838 (2016).

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