Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Type 1-diabetes (T1D) er en autoimmun sygdom, der er kendetegnet ved destruktionen af insulin-producerende holm β celler ved autoreaktive T-celler 1. Diagnosen T1D er typisk fremstillet ved måling af hyperglykæmi (blodglukose> 200 mg / dl) i et magert, ungt individ, som kan udgøre med ketoacidose som bevis for insulinmangel. På tidspunktet for diagnosen T1D, der er bevis for væsentligt tab af β-cellefunktion og masse (fra 50 – 90%) 2. I kliniske undersøgelser, flere immunmodulerende lægemidler, der blev anlagt på tidspunktet for diagnosen resulterede i stabiliseringen af β-celle funktion (og formentlig masse), men ingen har resulteret i klinisk remission af sygdom, en konstatering af, at der er rejst krav om udvikling af biomarkører for tidligere opdagelse af sygdommen og for den langsgående sporing af effektiviteten af kombination terapier 3,4. Indsatsen af internationale konsortier, sådaner den menneskelige Islet Research Network Consortium ved National Institutes of Heath 5, har understreget behovet for at udvikle biomarkører, der fokuserer på β celle stress og død i T1D.
I overensstemmelse med disse bestræbelser, har vores gruppe, og andre for nylig udviklet biomarkør assays, der måler cirkulerende, epigenetisk modificerede DNA-fragmenter, der opstår primært fra døende p-celler 6-9. I alle de offentliggjorte assays til dato, har der været fokus på kvantificering af det humane gen, der koder præproinsulin (INS), hvilket viser større grader af ikke-methylerede bindingssteder for CpG i de kodende og promotorområder i forhold til andre celletyper. Befrielsen af umethylerede INS DNA-fragmenter blev hypotese som opstår primært fra at dø (nekrotiske, apoptotiske) p-celler. Vores seneste undersøgelser viste, at i ungdommen, stigninger i både umethylerede og methylerede INS DNA ved position -69 bp (i forhold til than transskriptionsstartstedet) blev observeret i nye debut T1D, og sammen fungerede som specifikke biomarkører for denne population 6. Disse biomarkør assays involverer isoleringen af cellefri DNA fra serum eller plasma under anvendelse af kommercielle spin-kits, efterfulgt af en omdannelse med bisulfit af det isolerede DNA (at konvertere ikke-methyleret cytosiner til uraciler, efterlader methylerede cytosiner intakt).
I denne rapport beskriver vi de tekniske aspekter af serum prøvetagning, isolering af celle-frit DNA fra serum, bisulfit konvertering og ydeevne dråbe digital PCR (herefter, digital PCR) for forskelligt methylerede INS DNA.
Methylering af cytosiner ved DNA methyltransferaser muliggør den epigenetiske kontrol af transkription i mange gener. INS-genet hos mennesker næsten udelukkende udtrykkes i islet β celler, og der synes at være en sammenhæng mellem frekvensen af methylering af cytosiner i INS genet til silencing af dens transkription 11. Som sådan fleste celletyper viser væsentligt højere frekvenser af methylering af INS-genet på forskellige cytosiner i forhold til p-celler 11…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |